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1、 特訓?13 基因工程的應用 1．(2018·廣東四校聯(lián)考)如圖所示的質(zhì)粒中，Tetr?為四環(huán)素抗性基因，LacZ′基因的表達 產(chǎn)物能使白色的大腸桿菌菌落變成藍色?，F(xiàn)用?EcoRⅠ切割目的基因及質(zhì)粒載體并進行連接， 將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以對目的基因進行保存和擴增。請回答下列問題： (1)將目的基因和質(zhì)粒載體連接需使用的工具酶是________________。為將載體導入大腸桿 菌，常用?Ca2＋處理使之處于________________。 (2)LacZ′基因在基因工程中起___

2、_______基因的作用。為篩選導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌， 應在培養(yǎng)基中加入________，篩選________(填“藍色”或“白色”)菌落。 (3)若需要將這個質(zhì)粒改造成基因工程表達載體，還需要插入________和________部分。將 改造后的表達載體和目的基因經(jīng)?EcoRⅠ酶切連接，并成功導入受體細胞后，發(fā)現(xiàn)仍有部分 細胞不能表達出目的蛋白，最可能的原因是____________________________________。 為了避免上述情況發(fā)生，最好用________________切割目的基因和表達載體。 (4)我國對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實施標識

3、制度，比如由轉(zhuǎn)基因大豆加工制成的大豆油，標注為“本 產(chǎn)品加工原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆，但本產(chǎn)品已不再含有轉(zhuǎn)基因成分”，其相關(guān)的生物學依據(jù) 是________________________________________________________________________。 答案 (1)DNA?連接酶 感受態(tài) (2)標記 四環(huán)素 白色 (3)啟動子 終止子 目的基因 與質(zhì)粒載體反向連接 兩種限制酶 (4)大豆油屬于脂肪，不含目的基因編碼的蛋白質(zhì) 解析 (1)將目的基因和質(zhì)粒載體連接需要使用的工具酶是?DNA?連接酶；為將載體導入大腸 桿菌，常用?Ca

4、2＋處理使之處于感受態(tài)。(2)LacZ′基因在基因工程中起標記基因的作用；為 篩選導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素；由于構(gòu)建重組表達載體過程中 LacZ′基因已經(jīng)被破壞，因此應該篩選白色菌落。(3)基因表達載體的組成包括目的基因、 啟動子、標記基因、終止子、復制原點等；將改造后的表達載體和目的基因經(jīng)?EcoR?Ⅰ酶切 連接，并成功導入受體細胞后，發(fā)現(xiàn)仍有部分細胞不能表達出目的蛋白，最可能的原因是目 的基因與質(zhì)粒載體反向連接，為了避免上述情況發(fā)生，最好用兩種限制酶切割目的基因和表 達載體。(4)我國對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實施標識制度，比如由轉(zhuǎn)基因大豆加

5、工制成的大豆油， 標注為“本產(chǎn)品加工原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆，但本產(chǎn)品已不再含有轉(zhuǎn)基因成分”，其相關(guān)的 生物學依據(jù)是大豆油屬于脂肪，不含目的基因編碼的蛋白質(zhì)。 2．(2018·東北五校聯(lián)考)透明質(zhì)酸酶臨床常用作藥物滲透劑，目前市場上出售的透明質(zhì)酸 酶主要從動物組織中提取，成本高且提純困難，科研人員嘗試將透明質(zhì)酸酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿 1 菌，使其高效表達。部分過程如圖所示，請回答下列問題： (1)步驟①代表的是基因工程操作程序中的_______

6、_________________，由圖可知，此步驟 中，選擇用限制酶______________去切割?DNA?分子中的____________鍵。 (2)?基?因?工?程?一?般?選?擇?大?腸?桿?菌?作?為?受?體?，?這?是?因?為?大?腸?桿?菌?具?有 ________________________________________________________________________的特點。 (3)透明質(zhì)酸酶基因進入大腸桿菌，并且____________________的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時， 首先需要用________處理大腸桿菌，使

7、其處于感受態(tài)。 (4)透明質(zhì)酸酶基因?qū)胧荏w細胞后，需通過_______________技術(shù)檢測其是否成功轉(zhuǎn)錄。 答案 (1)基因表達載體的構(gòu)建 NcoⅠ和?XhoⅠ 磷酸二酯 (2)繁殖快、單細胞、遺傳物 質(zhì)相對較少 (3)維持穩(wěn)定和表達 Ca2＋ (4)RNA－DNA?分子雜交 解析 (1)步驟①代表將目的基因即透明質(zhì)酸酶基因和作為載體的質(zhì)粒連接，完成基因表達 載體的構(gòu)建；據(jù)圖可知，要用限制酶?Nco?Ⅰ和?Xho?Ⅰ去切割?DNA，斷開磷酸二酯鍵，便于 目的基因和質(zhì)粒連接。(2)基因工程中一般選擇大腸桿菌作為載體的原因是大腸桿菌屬于

8、單 細胞生物，繁殖速度快，容易培養(yǎng)，遺傳物質(zhì)相對較少，容易對遺傳物質(zhì)進行改造。(3)透 明質(zhì)酸酶基因?qū)氪竽c桿菌，并且能維持穩(wěn)定，在大腸桿菌細胞內(nèi)能表達，控制合成透明質(zhì) 酸酶，這個過程稱作轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化時，需要用?Ca2＋(氯化鈣)處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)， 即能吸收周圍環(huán)境中?DNA?分子的狀態(tài)。(4)透明質(zhì)酸酶基因?qū)氪竽c桿菌后，需要通過?RNA －DNA?分子雜交技術(shù)來檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了?mRNA。 3．(2018·廣州畢業(yè)班測試)現(xiàn)有重組質(zhì)粒甲(共含?2?686?個堿基對，不含?T－DNA)和乙，為 避免基因反接，研究人員用限制酶Ⅰ和Ⅱ切

9、割重組質(zhì)粒甲、乙，再利用所得片段構(gòu)建了重組 質(zhì)粒丙(如圖所示)，然后采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將丙導入胡蘿卜愈傷組織細胞。培養(yǎng)后得到轉(zhuǎn) VP1?基因胡蘿卜植株。請回答下列問題： 2 (1)構(gòu)建重組質(zhì)粒丙的目的是_________________________________________ ________________________________________________________________________， 利用重組質(zhì)粒甲、乙構(gòu)

10、建丙的過程中，用到的工具酶是________________________。 (2)實驗過程中，將愈傷組織浸入農(nóng)桿菌?(含重組質(zhì)粒丙?)培養(yǎng)液中一段時間，其目的是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)將重組質(zhì)粒甲、乙和丙進行分組，每組中含其中一種重組質(zhì)粒，同時用限制酶Ⅰ和Ⅱ切 割，結(jié)果如下表所示：

11、 組別 第1組 第2組 第3組 切割后所得?DNA?片段的情況 只得到含有?2?146?和?540?個堿基對的?2?種?DNA?片段 只得到含有?540?和?12?400?個堿基對的?2?種?DNA?片段 只得到含有?12?400?和?1?000?個堿基對的?2?種?DNA?片段 切割前，重組質(zhì)粒甲含有________個游離的磷酸基團，限制酶Ⅰ在重組質(zhì)粒甲中有________ 個切割位點，表中第________組是切割重組質(zhì)粒丙的結(jié)果。 (4)在植物組織培養(yǎng)過程中需要無菌操作，因此對外植體(離體的組織塊)要進行_

12、_______處 理。用于培養(yǎng)外植體的培養(yǎng)基不適用于培養(yǎng)胚狀體，原因是_______________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)將?VP1?基因插入到?T－DNA?中，從而使?VP1?基因進入植物細胞后，能整合到染色體 的?DNA?上 限制酶Ⅰ、Ⅱ和?DNA?連接酶 (2)利用農(nóng)桿菌感染植物，將?VP1?基因轉(zhuǎn)移到受體 細胞中 (3)0 1 2 (4)消毒 培養(yǎng)基中添加的植物激素(植物生長調(diào)節(jié)劑)的種類和含量

13、比例有所不同 不 解析?(1)由圖可知，重組質(zhì)粒甲中含有目的基因，?含?T－DNA，而重組質(zhì)粒乙中含有T－DNA， 不含目的基因，所以構(gòu)建重組質(zhì)粒丙的目的是將?VP1?基因插入到?T－DNA?中，從而使?VP1?基 因進入植物細胞后，能整合到染色體的?DNA?上；在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，用到的工具酶是限制酶 Ⅰ、Ⅱ和?DNA?連接酶。(2)將愈傷組織浸入含重組質(zhì)粒丙的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，其目的是利用 農(nóng)桿菌感染植物，將?VP1?基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中。(3)因為質(zhì)粒是小型環(huán)狀的?DNA?分子，環(huán) 狀?DNA?分子沒有游離的磷酸基團；由表中數(shù)據(jù)可知，第?1?組經(jīng)切割后產(chǎn)

14、生含有?2?146?和?540 3 個堿基對的?2?種?DNA?片段，兩個片段之和為?2?686?個堿基對，所以第?1?組為重組質(zhì)粒甲，重 組質(zhì)粒甲中有?2?個限制酶切割位點，其中限制酶Ⅰ在重組質(zhì)粒甲中只有一個切割位點；第2 組中含有重組質(zhì)粒甲中的?540?個堿基對片段，所以第?2?組為切割重組質(zhì)粒丙的結(jié)果。第?3 組為切割重組質(zhì)粒乙的結(jié)果，重組質(zhì)粒丙中含有重組質(zhì)粒甲中的?540?個堿基對片段和重組質(zhì) 粒乙中的?12?400?個堿基對片段。(4)為了防止雜菌感染，植物組織培養(yǎng)過程中需要對外植體 進行消毒處理，處理方法一般用酒精、無菌水和

15、次氯酸鈉清洗；培養(yǎng)外植體是使其發(fā)生脫分 化形成愈傷組織，培養(yǎng)胚狀體是使其發(fā)芽和生根，所以培養(yǎng)基中添加的植物激素(植物生長 調(diào)節(jié)劑)的種類和含量比例有所不同。 4．(2018·湖北八校聯(lián)考)北極比目魚中有抗凍基因，如圖是獲取轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株的過 程示意圖。請回答下列問題： (1)?利用過程①的方法構(gòu)建的基因文庫是 ________(填“基因組文庫”或“部分基因文 庫”)。 (2)過程②中常需要使用限制酶和?DNA?連接酶，既能連接黏性末端又能連接平末端的?DNA?連 接酶是___________

16、_____。 (3)為使過程①獲取的目的基因在番茄細胞中能夠表達，在構(gòu)建表達載體時，需在目的基因 的兩端加入________________。 (4)將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌，并通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，可以將目的基因?qū)敕洋w細胞中 染色體的?DNA?上，其原理是_______________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)要確認抗凍基因是否在轉(zhuǎn)基因番茄植株中正確表達，應檢測轉(zhuǎn)基

17、因番茄植株中該基因的 ____________是否呈陽性。 答案 (1)部分基因文庫 (2)T4DNA?連接酶 (3)啟動子、終止子 (4)目的基因隨農(nóng)桿菌中 的?Ti?質(zhì)粒上的?T－DNA?轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體?DNA?上 (5)表達產(chǎn)物 解析 (1)用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA?逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補DNA?片段屬于部分基因 文庫。(2)既能連接黏性末端又能連接平末端的?DNA?連接酶是?T4DNA?連接酶。(3)在構(gòu)建表達 載體時，需在目的基因的兩端加入啟動子和終止子。(4)將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿 菌的轉(zhuǎn)化作用，可

18、以將目的基因?qū)敕洋w細胞中染色體的?DNA?上，其原理是農(nóng)桿菌中的 Ti?質(zhì)粒上的?T－DNA?可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的?DNA?上。(5)檢測目 的基因是否表達，可從轉(zhuǎn)基因生物中提取基因的表達產(chǎn)物即蛋白質(zhì)(抗凍蛋白)，用相應的抗 體進行抗原—抗體雜交，若呈陽性，表明目的基因已成功表達。 4 5．(2018·石家莊畢業(yè)班質(zhì)檢)資料一：PCR(聚合酶鏈式反應)三個基本反應步驟是模板?DNA 在體外加熱至?95?℃時解旋成單鏈，溫度降至?55?℃左右，引物與模板單鏈按堿基互補配對 的原則結(jié)合，再調(diào)至?72?℃左右時，D

19、NA?聚合酶沿?5′→3′(磷酸到五碳糖)的方向延伸引物 合成互補鏈。三個步驟完成一次稱為一個循環(huán)。 資料二：圖?1?顯示了目的基因及其上限制酶切點，A、B、C、D?是四種單鏈?DNA?片段；圖?2 是質(zhì)粒(顯示限制酶切點和標記基因)，一般來說，為了使切割后的目的基因與運載體結(jié)合， 往往使用兩種限制酶，同時還要破壞載體上的一個標記基因。根據(jù)資料回答下列問題： (1)若利用?PCR?技術(shù)增加目的基因的數(shù)量，所用的酶是____________。由圖?1?可知，A、B、C、 D?四種單鏈?DNA?片段中應選取____

20、____作為引物，該?DNA?分子在?PCR?儀中經(jīng)過?4?次循環(huán)后會 產(chǎn)生?DNA?片段________個。 (2)為了提高目的基因和質(zhì)粒的重組成功率，同時有利于受體細胞的篩選，應該選擇的限制 酶是______________。如果用限制酶?Pst?Ⅰ、EcoR?Ⅰ和?Hind?Ⅲ對質(zhì)粒進行切割，假設(shè)同 時只有任意兩個位點被切割且每次機會相等，則形成的含有完整抗四環(huán)素基因的?DNA?片段有 ______種。 (3)將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ㄊ莀_______________。 (4)對基因組文庫的描述，不正確的是________。 A

21、．含有某種生物的全部基因 B．基因中含有啟動子和內(nèi)含子 C．文庫的基因是通過受體菌承載的 D．文庫中的全部基因可以在物種間交流 答案 (1)Taq?酶(或熱穩(wěn)定?DNA?聚合酶) B?和?C 16 (2)Pst?Ⅰ和?EcoR?Ⅰ 1 (3)農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化法 (4)D 解析 (1)利用?PCR?技術(shù)擴增目的基因時，所使用的酶是?Taq?酶。DNA?復制需要引物，當引 物與?DNA?母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA?聚合酶就能從引物的?3′端開始延伸?DNA 鏈，因此?DNA?合成總是從子鏈的?5′端向?3′端延伸，因此選用?B、C?單鏈?DNA?片段作為

22、 引物。該?DNA?分子在?PCR?儀中經(jīng)過?4?次循環(huán)后會產(chǎn)生?DNA?片段共?24＝16(個)。(2)為了提 高目的基因和質(zhì)粒的重組成功率，同時有利于受體細胞的篩選，一般選用雙酶切法，且選用 的限制酶不能破壞目的基因，若選用限制酶?EcoR?Ⅰ和?Hind?Ⅲ，則載體上的兩個標記基因 都會被破壞，因此應該選用的限制酶是?Pst?Ⅰ和?EcoR?Ⅰ。如果用限制酶?Pst?Ⅰ、EcoR?Ⅰ和 Hind?Ⅲ對質(zhì)粒進行切割，假設(shè)同時只有任意兩個位點被切割且每次機會相等，則只有?Pst?Ⅰ 和?EcoR?Ⅰ切割后會形成含有完整抗四環(huán)素基因的?DNA?片段。(3)常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目

23、的基因?qū)胫参锛毎?4)基因組文庫就是把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體 5 貯存在一個受體菌克隆子群體中；基因組文庫含有某種生物的全部基因，基因中含有啟動子 和內(nèi)含子，只有部分基因可以在物種間交流。 6