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DBS61 陜西省食品安全地方標準 DBS61/0012—2016 食品安全地方標準 蜂蜜中16種激素殘留的測定 液相色譜-質譜/質譜法 陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā)布 2016-07-01實施 2016-06-01發(fā)布 DBS61/0012—2016 前 言 本標準按照GB/T 1.1給出的規(guī)則起草。 本標準由中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局提出。 本標準由中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局負責起草。 本標準主要起草人：張璐，李瑩，何強，王菡，孔祥虹，鄒陽，付騁宇。 本標準屬首次發(fā)布。 13 食品安全地方標準 蜂蜜中16種激素殘留的測定 液相色譜-質譜/質譜法 1 范圍 本標準規(guī)定了蜂蜜中16種激素殘留的液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）的檢測方法。 本標準適用于蜂蜜中糖皮質激素（曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸潑尼松）、雄性激素（甲睪酮、睪酮）、孕激素（孕酮）、腎上腺皮質激素（羥基醋酸去皮質酮）16種激素殘留定性和定量測定。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 1.1 標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 3 原理 試樣經(jīng)酶解，用乙腈提取目標化合物后，經(jīng)固相萃取富集凈化，液相色譜-質譜/質譜儀測定，外標法定量。 4 試劑與材料 除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和GB/T6682中規(guī)定的一級水。 4.1 乙腈：色譜純。 4.2 甲醇：色譜純。 4.3 甲酸：色譜純。 4.4 二氯甲烷。 4.5 乙酸銨。 4.6 乙酸。 4.7 b-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶（b-glucuronidase/arylsufastase）：含有b-葡萄糖醛苷酶134600 U/mL，芳基硫酸酯酶5200 U/mL。 4.8 無水硫酸鈉：650 ℃灼燒4 h，在干燥器中冷卻至室溫，貯于密封瓶中備用。 4.9 乙酸銨溶液（0.2 mol/L）：稱取15.4 g乙酸銨，加入1000 mL水溶解，用乙酸調節(jié)pH到5.2。 4.10 二氯甲烷-甲醇（6+4，體積比）：60 mL二氯己烷和40 mL甲醇混合。 4.11 0.1 %甲酸水溶液：準確量取1 mL甲酸加水稀釋至1000 mL。 4.12 乙腈-水溶液（1+9，體積比）：10 mL乙腈和90 mL水混合。 4.13 標準品：曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸潑尼松龍、甲睪酮、睪酮、孕酮、醋酸去氧皮質酮，純度均大于97 %，物質英文名稱及CAS號見附錄A。 4.14 標準儲備液（1 mg/mL）：分別準確稱10.0 mg各標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，搖勻，-18 ℃避光保存，可保存12個月。 4.15 混合標準中間溶液（1 mg/mL）：分別準確量取1 mg/mL標準儲備液各0.025 mL，于25 mL容量瓶中，用水溶解，0 ℃～4 ℃避光保存，可保存6個月。 4.16 混合標準使用溶液：根據(jù)需要，臨時吸取一定量的混合標準中間溶液（4.15）用水稀釋，配制成適當濃度的標準工作溶液0 ℃～4 ℃避光保存，可保存6個月。 4.17 HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）：使用前依次用6 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）、6 mL甲醇、6 mL水活化。 4.18 氨基固相萃取柱（60 mg，3 mL）：使用前用6 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）活化。 5 儀器與設備 5.1 液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配電噴霧離子源。 5.2 分析天平：感量0.01 mg。 5.3 天平：感量0.01 g。 5.4 振蕩器 5.5 渦旋混勻器 5.6 高速離心機 5.7 固相萃取裝置 5.8 氮吹儀 5.9 旋轉蒸發(fā)儀 5.10 離心管：50 mL。 5.11 有機系濾膜：0.22 mm。 6 試樣制備與保存 對無結晶的實驗室樣品，將其攪拌均勻。對有結晶的樣品，在封閉情況下，置于不超過60℃的水浴中溫熱，震蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5 kg作為試樣，制備好的樣品置于樣品瓶中，密封，并做上標記。 7 測定步驟 7.1 提取 準確稱取試樣5 g（精確至0.01 g），于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液（4.9），渦旋混合，再加入b-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶100 mL，于37 ℃±1℃震蕩酶解12 h。取出冷卻至室溫，加入20 mL乙腈震蕩提取15 min，4500 r/min下離心5 min，取乙腈層過無水硫酸鈉漏斗。再加入15 mL乙腈，重復上述提取過程。合并乙腈層， 40℃下旋轉蒸發(fā)至近干，用10 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液（4.9）溶解，待凈化。 7.2 凈化 提取液（7.1）以1.5 mL/min的速度上樣于活化過的HLB固相萃取柱（4.17）。將小柱減壓抽干。再將活化過的氨基柱（4.18）串聯(lián)在HLB固相萃取柱下方。用8 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗脫并收集洗脫液，取下HLB小柱，再用2 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗氨基柱，合并洗脫液，于40℃氮氣吹干，用1 mL乙腈-水（4.12）溶解殘渣，渦旋混勻，濾膜（5.11）過濾，供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。 7.4 測定 7.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD aQ （2.1×100 mm，3.0 mm）, 或相當者； 柱溫：40℃； 流速：0.3 mL/min； 進樣量：10.0 mL; 流動相：乙腈-0.1 %甲酸水，梯度洗脫，洗脫條件參見附錄B； 7.4.2 糖皮質激素質譜條件 a）電離源：電噴霧離子源； b）離子化方式：負離子模式； c）檢測模式：選擇離子反應監(jiān)測； d）噴霧電壓：2500 V； e）氣化溫度：300 ℃； f）鞘氣（N2）：0.525 L/min； g）輔助氣（N2）: 4.5 L/min； h）離子傳輸管溫度：300 ℃； i）去簇電壓：2.0 V； j）碰撞氣（Ar）：199.9 Mpa。 k）特征離子參見附錄C.1。 7.4.3 雄性激素、孕激素、腎上腺皮質激素質譜條件 a）電離源：電噴霧離子源； b）離子化方式：正離子模式； c）檢測模式：選擇離子反應監(jiān)測； d）噴霧電壓：3300 V； e）氣化溫度：300 ℃； f）鞘氣（N2）：0.525 L/min； g）輔助氣（N2）: 4.5 L/min； h）離子傳輸管溫度：300 ℃； i）去簇電壓：2.0 V； j）碰撞氣（Ar）：199.9 Mpa k）特征離子參數(shù)見附錄C. 2。 7.4.4 測定法 7.4.4.1 定性測定 通過試樣色譜圖的保留時間與相應標準品的保留時間、各色譜峰的特征離子與響應濃度標準溶液各色譜峰的特征離子相對照定性，試樣與標準品保留時間的相對偏差不大于5 %；試樣特征離子的相對豐度與濃度相當混合標準溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過表1的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應的被測物。 表1 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍 相對豐度（%） ＞50 ＞ 20～50 ＞10～20 ≤10 允許偏差（%） ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.4.2 定量測定 根據(jù)試樣中被測樣液的含量情況，按外標法，以峰面積定量。選取待測物的響應值在儀器線性響應范圍內的濃度進行測定，如果超出儀器線性響應范圍應進行稀釋。在上述條件下，標準溶液中各目標化合物的特征離子流色譜圖見附錄D。 7.5 平行試驗 按照7.1至7.4所述的測定條件和步驟對同一試樣進行平行試驗測定。 7.6 空白試驗 除不稱取試樣外，均按7.1至7.4所述的測定條件和步驟進行。 8 結果計算和表達 試樣中各目標化合物殘留量（mg/kg）：按式（1）計算： ………………………………(1) 式中： X—供試試樣中各目標化合物殘留量，單位為微克每千克（mg/kg）； A—試樣溶液中各目標化合物的峰面積； Cs—標準工作溶液中各目標化合物的濃度，單位為微克每升（mg/L）； V—樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）； As—標準工作溶液中各目標化合物的濃度，單位為微克每升（mg/L）； m—試樣質量，單位為克（g）。 注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。 9 定量限、回收率和精密度 9.1 檢出限 本方法曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、甲睪酮、睪酮、孕酮、醋酸去氧皮質酮檢出限均為1.0 mg /kg，醋酸潑尼松檢出限為2.0 mg /kg。 9.2 回收率 蜂蜜中各種激素的回收率試驗數(shù)據(jù)見附錄E，在1.0~5.0 mg/kg添加水平上的回收率范圍為68.2 %~102.2 %。 9.3 精密度 本方法的相對標準偏差≤15 %。  附 錄 A （規(guī)范性附錄） 16種激素物質的CAS號、分子式、分子量及英文名稱 A.1 16種激素物質的CAS號、分子式、分子量及英文名稱 應符合表A.1的規(guī)定。 表 A.1 化合物 CAS號 分子式 分子量 醋酸潑尼松龍Prednisolone Acetate 52-21-1 C23H30O6 402.48 醋酸可的松Cortisone Acetate 50-04-4 C23H30O6 402.48 潑尼松龍Prednisolone 50-24-8 C21H28O5 360.44 氫化可的松Hydrocortisone 50-23-7 C21H30O5 362.47 甲基潑尼松龍Methylprednisolone 83-43-2 C22H30O5? 374.47 醋酸地塞米松Dexamethasone Acetate 55812-90-3 C24H31FO7 434.5 地塞米松Dexamethasone 50-02-2 C22H29FO5 392.46 曲安西龍Triamcinolone 124-94-7 C21H27FO6 394.44 氟米松Flumethasone 2135-17-3 C22H28F2O5 410.45 氟氫可的松Fludrocortisone 127-31-1? C21H29FO5 380.45 曲安奈德Triamcinolone Acetonide 76-25-5 C24H31FO6 434.49 醋酸氟氫松Fluocinolone Acetonide 67-73-2 ?C24H30F2O6 452.49 睪酮Testosterone 58-22-0 C19H28O2 288.42 甲睪酮Methyltestosterone 58-18-4 C20H30O2 302.45 孕酮Progesterone 57-83-0 C21H30O2 314.46 醋酸去氧皮質酮21-Hydroxyprogesterone-21-acetate 56-47-3 C23H32O4 372.