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1、第二章,,蛋白質的結構與功能,Structure and Function of Protein,蛋白質的分子組成,1,蛋白質的分子結構,蛋白質結構與功能的關系,蛋白質的理化性質及其分離純化,2,3,4,,protein ？,,含量大,分布廣,種類多,功能繁雜,蛋白質的重要性,1,,2,,3,,4,蛋白質的生物活性,,催化作用,,調節(jié)作用,,免疫作用,,載體作用,,凝血作用,,收縮作用,,緩沖作用,,其它作用,第一節(jié),蛋白質的分子組成,組成蛋白質的元素,C、H、O、N和S,主要,少量,磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘,蛋白質的含氮量平均為16,100克樣品中蛋白質的含量 ( g % ) = 每

2、克樣品含氮克數 6.25100,1/16%,一 氨基酸（amino acid）,氨基酸是蛋白質的基本組成單位,自然界,300余種,人體,僅20種,除G外,均屬L--AA,,,NH2,H,R,COOH,C,,,,,（一）氨基酸的一般結構,,中心 碳原子,,羧基,,氨基,,氫原子,,側鏈,L-AA,D-AA,蛋白質中為L-AA,,,,（二）氨基酸的分類,非極性疏水性氨基酸,1,2,3,4,極性中性氨基酸,酸性氨基酸,堿性氨基酸,非極性疏水性氨基酸,極性中性氨基酸,堿性氨基酸,酸性氨基酸,,胱氨酸,,半胱氨酸,記憶口訣,,甘、丙、纈、亮、異，三、四碳烴基,丙、丁羥絲、蘇，（半）胱、蛋含有硫,酸有天冬

3、、谷，堿有精、賴、組,苯、酪、色、脯環(huán)，中性天、谷胺,要點,,編碼AA 20種,除G外均為L-型,P為環(huán)狀亞AA,含羥基AA：S、T、Y,含硫AA：C、M,芳香AA：F、Y、W,支鏈AA：V、L、I,酸性AA：D、E,堿性AA：R、K、H,（二）氨基酸的理化性質,1. 兩性解離及等電點,解離程度取決于所處溶液的酸堿度,氨基酸是兩性電解質,等電點(isoelectric point, pI),,在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,,,,,,,,pH=pI,pHpI,pH

4、.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸 最大吸收峰 280 nm,3.茚三酮反應,,在氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。,氨基酸定量分析方法,二 肽（peptide）,肽 氨基酸通過肽鍵縮合而成的化合物,肽鍵(peptide bond) 一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,,+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,二肽 兩分子氨基酸,三肽 三分子氨基酸,寡肽(oligopeptide) 十個以內氨基酸,多肽(polypeptide) 多個氨基酸,多肽鏈(polypeptide chain) 許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構,氨基酸殘基(r

5、esidue) 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全,氨基末端（N末端） 自由氨基的一端 羧基末端（C末端） 自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸 (ser-gly-tyr-ala-leu),肽單元（peptide unit）,,肽鍵中4個原子C、O、N、H和與之相鄰的 C1、 C2位于同一平面,,,肽鍵(C-N)具有部分雙鍵的性質,,天然存在的活性肽,,谷胱甘肽(glutathione, GSH),肽類激素及神經肽,抗生素肽,,谷胱甘肽(glutathione, GSH),,還原劑,清除H2O2,結合有害物質,GSH生物活性,,GSH過氧化物酶,GSH還原

6、酶,NADPH+H+,NADP+,肽類激素,,促甲狀腺素釋放激素 (TRH),,第二節(jié),蛋白質的分子結構,,蛋白質的結構層次圖,,分子結構,一級結構 （基本結構）,高級結構 （空間結構）,三級結構,四級結構,,,,-螺旋,-折疊,-轉角,不規(guī)則卷曲,二級結構,,蛋白質的一級結構 (primary structure),肽鏈中氨基酸的數目及排列順序 包括二硫鍵的數目和位置,定義,主要化學鍵,肽鍵 有些蛋白質有二硫鍵,,牛胰島素的一級結構,,蛋白質的二級結構 (secondary structure),肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置 不涉及氨基殘基側鏈的構象,定義,主要化學鍵,氫鍵,,-折疊,-轉

7、角,無規(guī)卷曲,-螺旋,蛋白質二級結構的主要形式,,-螺旋,,要點,,1,一圈3.6個氨基酸殘基，螺距0.54nm,2,螺旋穩(wěn)定靠氫鍵，與螺旋長軸平行,呈右手螺旋,側鏈影響螺旋的形成和穩(wěn)定,3,4,,-折疊(反平行),,-折疊(平行),要點,,1,順向平行和反向平行兩種構象,2,呈伸展、鋸齒狀結構,折疊的穩(wěn)定靠氫鍵,3,4,側鏈影響折疊的形成和穩(wěn)定,,-轉角,,超二級結構（模體motif）,多肽鏈內順序上相互鄰近的二級結構常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結構聚集體,,鈣結合蛋白,鋅指結構,,蛋白質的三級結構 (tertiary structure),整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相

8、對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的整體排布,定義,主要化學鍵是次級鍵,疏水鍵、離子鍵、氫鍵 和 Van der Waals力,,,肌紅蛋白（Mb）的三級結構,,血紅素,鐵原子,,,結構域(domain),結構域是是超二級結構基礎上形成的一個或數個球狀或纖維狀的區(qū)域，能各行使其功能；是蛋白質三級結構的基本結構單位,,細胞表面蛋白CD4分子4個相似結構域,,蛋白質的四級結構 (quaternary structure),兩條或多條肽鏈蛋白質的每一條具有完整三級結構的多肽鏈稱為亞基,亞基,化學鍵,主要 疏水作用 次要 離子鍵、氫鍵,定義,亞基的空間排布,,血紅蛋白（Hb）的四級結構,,鏈,鏈,

9、,,血紅素,,蛋白質的分類,根據組成,,結合蛋白質,單純蛋白質,,蛋白質部分,非蛋白質部分,,根據形狀,,球狀蛋白質,纖維狀蛋白質,,根據功能,,調節(jié)蛋白,酶蛋白,運輸蛋白,結構蛋白,,根據分布,,核蛋白質,膜蛋白質,第三節(jié),蛋白質結構與功能的關系,,蛋白質一級結構 與功能的關系,一級結構是空間構象的基礎,一級結構是功能的基礎,一級結構改變與分子病,,一級結構是空間構象的基礎,,,天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,變性RNaseA（無活性）,,,8M尿素,去掉尿素,,分子伴侶(chaperon) 是一類幫助新生多肽鏈正確折疊的蛋白質,,防止肽段錯誤聚集,使錯誤聚集肽段正確

10、折疊,保證二硫鍵的正確形成,分子伴侶功能,,一級結構是功能的基礎,結構相似，功能相似,胰島素,細胞色素c,促腎上腺皮質激素和促黑激素,,一級結構改變與分子病,分子病,由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病,案 例,鐮刀狀紅細胞性貧血,,,,（a）正常紅細胞,（ b）鐮型紅細胞,,蛋白質空間結構 與功能的關系,空間結構是功能的基礎,,胰島素原轉變成胰島素,蛋白質的功能依賴于特定的空間結構,胰島素原 （一條肽鏈）,胰島素 （兩條肽鏈）,C肽,,肌紅蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白的空間構象變化與結合,,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,,協(xié)同效應 一個亞基與其配體結合后，能影響其 中另一個

11、亞基與配體結合能力的現象,協(xié)同效應(cooperativity),正協(xié)同效應(positive cooperativity) 促進作用,負協(xié)同效應(negative cooperativity) 抑制作用,,,,,配體與亞基結合后引起亞基構象變化的效應,變構效應(allosteric effect),蛋白質空間結構改變與疾病,,蛋白質構象病（protein conformational diseases）,因蛋白質折疊錯誤或折疊導致構象異常變化引起的疾病,蛋白質空間結構改變與疾病,,朊病毒蛋白(prion protein, PrP),第四節(jié),蛋白質的理化性質及其分離純化,,蛋白質的理化性質,

12、蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) 當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為pI,（一）兩性電離及等電點,,pH=pI,pHpI,pH

13、質的改變和生物活性的喪失。,,變性因素,變性本質,破壞非共價鍵和二硫鍵 不改變蛋白質的一級結構,加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等,,理化性質變化,黏度增大,溶解度降低,易被蛋白酶水解,,應用,消毒,雞蛋要煮熟吃,疫苗保存,,蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能,蛋白質的復性(renaturation),,天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,變性RNaseA（無活性）,,,8M尿素,去掉尿素,,蛋白質從溶液中析出,蛋白質沉淀,沉淀本質,破壞水化膜,中和電荷,,中性鹽,沉淀方法,有機溶劑,生物堿試劑,重金屬離子

14、,,應用,重金屬中毒口服牛奶或生雞蛋,,變性與沉淀的關系,,變性,沉淀,,,容易,不一定,,蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，不易再溶于強酸和強堿中,蛋白質的凝固作用(protein coagulation),,（四）蛋白質的光譜吸收與呈色反應,280nm最大吸收峰 OD280 ：Y、W,蛋白質的光譜吸收,,雙縮脲反應,蛋白質的呈色反應,酚試劑呈色反應,,蛋白質的分離和純化,方法 鹽析 有機溶劑沉淀 調節(jié)pH 改變溫度,（一）改變蛋白質的溶解度,,將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀,鹽析(salt precipitati

15、on),,低溫(04 0C) 快速,有機溶劑沉淀,,方法 離心 透析 超濾 凝膠過濾,（二）根據蛋白質分子大小不同分離,,利用機械的快速旋轉所產生的離心力，將不同密度的物質分離,離心（centrifugation）,蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(sedimentation coefficient, S)表示,,利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法,透析(dialysis),純化蛋白質 濃縮蛋白質,作用,,超濾,利用超濾膜在一定壓力下使大分子蛋白質滯留，而小分子物質和溶劑濾過,,凝膠過濾（gel-filtration chromatography）,按照天然蛋白質相對分子質量大小

16、進行分離的技術，又稱為分子篩層析或排阻層析,,,方法 離子交換層析 電泳,（三）根據蛋白質電荷性質分離,,離子交換層析 （ion exchange chromatography）,利用蛋白質兩性解離特性和等電點作為分離依據,,,電泳(elctrophoresis）,帶點粒子在電場作用下向所帶電荷相反電極移動的現象,支持物的不同分為薄膜電泳、凝膠電泳,,SDS-PAGE,,SDS-PAGE 可測定蛋白質分子量,,蛋白質含量測定與純度鑒定,凱氏定氮法,（一）蛋白質含量測定,紫外線吸收法,考馬斯亮藍染色法,Folin-酚試劑法,,蛋白質純度常用某一特定成分與總蛋白之比來表示，如每毫克蛋白質含多少活性單位,（二）蛋白質的純度鑒定,,多肽鏈中氨基酸序列分析,測定蛋白質的氨基酸殘基組成,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端,將肽鏈水解成片段，分別進行分析,Edman降解法測定各肽段的氨基酸排列順序,,,,比較多種水解法產生的肽鏈，通過組合排列對比，確定完整肽鏈中的氨基酸順序,,,Edman降解法測定氨基酸序列,,,