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Chap.11 吸光光度法,Absorption Spectrophotometry,可 見(jiàn) 光,1,本章內(nèi)容,§ 11.1 吸光光度法基本原理 § 11.2 吸光光度法儀器 § 11.3 顯色反應(yīng)及其影響因素 § 11.4 吸光度的測(cè)量及誤差控制 §11. 5 吸光光度分析方法 §11. 6 吸光光度法的應(yīng)用實(shí)例,2,吸光光度法基本概念和特點(diǎn),吸光光度法：是基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的分析方法。,發(fā)展階段：目視比色法、光電比色法、分光光度法。,分類：可見(jiàn)分光光度法、紫外光譜法、紅外光譜法。,3,吸光光度法的特點(diǎn) （1）靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)10-5～10-6 mol·L-1；10-4 %～10-5 % （2）作為微量分析方法，準(zhǔn)確度較高：能夠滿足微量組分(1%)的測(cè)定要求： Er：1%～5% （3）儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快速 （4）應(yīng)用廣泛,4,一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,§11.1 吸光光度法基本原理,（一）單色光與復(fù)合光,1、光的波粒二象性,光是一種電磁波，具有波粒二象性。,5,c －真空中光速 ：~3.0 ×108m/s ?－波長(zhǎng)：1?m=10-6m, 1nm=10-9m, 1?=10-10m ? －頻率，單位：赫茲 Hz 次/秒 n －折射率，真空中為1： ? ? = c ； 波數(shù) = 1/ ? = ? /c,光的傳播速度:,（1）光的波動(dòng)性,6,h－普朗克(Planck)常數(shù) 6.626×10-34J·s ?－頻率 E－光量子具有的能量 單位：J(焦耳)，eV(電子伏特) 1eV=1.602×10－19 J,（2）光的微粒性,光是由光子流組成，光子的能量：,7,結(jié)論：一定波長(zhǎng)的光具有一定的能量，波長(zhǎng)越長(zhǎng)(頻率越低)，光量子的能量越低。,光具有波粒二象性,8,光譜區(qū)間,,?,?射線,x射線,紫外光,紅外光,微波,無(wú)線電波,10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm,可 見(jiàn) 光,400～750 nm,,,0.1nm～,10nm~,750nm~0.1cm,0.1mm～1m,1m～1000m,9,2、單色光與復(fù)合光,單色光,復(fù)合光,單一波長(zhǎng)的光,由不同波長(zhǎng)的光組合而成的光,,,互補(bǔ)色,10,1. 吸收光與透射光,當(dāng)復(fù)合光照射到物體上時(shí)，一部分光被 吸收，而另一部分光則被透射過(guò)去。即： 入射光=吸收光＋透射光,吸收光,透射光,,互補(bǔ),（二）物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,11,,物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系,,,,完全吸收,完全透過(guò),吸收黃色光,光譜示意,,光的作用方式,表觀現(xiàn)象示意,,復(fù)合光,12,不同顏色的可見(jiàn)光波長(zhǎng)及其互補(bǔ)光,13,2. 吸收光譜,(Absorption Spectra),用不同波長(zhǎng)的單色光照射，測(cè)吸光度— 吸收曲線 紫外可見(jiàn)吸收光譜：分子價(jià)電子能級(jí)躍遷。電子躍遷的同時(shí)，伴隨著振動(dòng)能級(jí)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷。帶狀光譜。,14,3. 吸收曲線,15,300,400,500,600,700,?/nm,545,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,Absorbance,MnO4-的吸收光譜,,,16,（1）吸收光譜的波長(zhǎng)分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級(jí)間的ΔΕ所決定，反映了分子內(nèi)部能級(jí)分布狀況——定性分析基礎(chǔ) （2）吸收譜帶強(qiáng)度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正比——定量分析基礎(chǔ) 同一種物質(zhì)不同濃度下，其吸收曲線形狀相似λmax不變。在λmax處吸光度A隨濃度變化的幅度最大。所以測(cè)定最靈敏。此特性可作為定量分析時(shí)選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。,Lambert-Beer定律,吸收曲線的討論：,17,1. 透光率 (透射比, Transmittance),透光率定義:,T 取值為0.0 % ~ 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,二、朗伯-比爾定律,（一）朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式,18,2. 吸光度 (Absorbance),溶液的T越大，說(shuō)明對(duì)光的吸收越小，濃度低； T越小，溶液對(duì)光的吸收越大，濃度高,19,K--吸光系數(shù) b--吸光液層的厚度(光程)， cm,c--吸光物質(zhì)的濃度， g / L, mol / L,當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻、透明的吸光介質(zhì)時(shí)，吸光度與吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度和吸收層厚度的乘積成正比.,Lambert-Beer定律,3、朗伯-比爾定律,20,吸光度與光程的關(guān)系 A = Kbc,光源,檢測(cè)器,顯示器,參 比,朗 伯 定 律 (1760),21,吸光度與濃度的關(guān)系 A = Kbc,比 爾 定 律 (1852),22,K ? ?,K ? a,吸光系數(shù)， L · g –1 · cm -1,K ?,比吸光系數(shù), 100mL · g -1 · cm -1,摩爾吸光系數(shù)，L · mol –1 · cm -1,23,4. 朗伯-比爾定律的適用條件,單色光 應(yīng)選用?max處或肩峰處測(cè)定.,稀溶液 濃度增大，分子之間作用增強(qiáng).,吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變 離解、絡(luò)合、締合會(huì)破壞線性關(guān)系, 應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等).,24,溶液濃度的測(cè)定,A＝?bc,工作曲線法 (校準(zhǔn)曲線) 外標(biāo)法,5. 朗伯-比爾定律的分析應(yīng)用,,,,0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL),A,。 。 。 。,*,,,0.80 0.60 0.40 0.20 0.00,Ax,cx,25,6. 摩爾吸光系數(shù)ε的討論,摩爾吸光系數(shù)ε (L·mol-1·cm-1)在數(shù)值上等于濃度為1 mol/L, 液層厚度為1 cm時(shí)該溶液在某一波長(zhǎng)下的吸光度,吸收物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù),在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)；,同一吸光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的ε值是不同的。在最大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸光系數(shù)，以εmax表示,表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測(cè)定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。,26,吸光光度法的靈敏度的表示方法,? 105 超高靈敏度 ? =(6～10）×104 高靈敏 ? =(2～6)×104 中等靈敏度; ? 2 × 104 不靈敏 .,（1）? 越大, 靈敏度越高,27,A = ? bc = 0.001 bc ＝ 0.001/ ?,定義：當(dāng)產(chǎn)生吸光度為0.001時(shí)，單位截面積(1cm2)的液層內(nèi)所能檢測(cè)出的吸光物質(zhì)的最低含量。 用S表示， 單位：?g·cm-2,S小靈敏度高；? 相同的物質(zhì)，M小則靈敏度高。,（2）Sandell(桑德?tīng)?靈敏度 (S),28,例1 鄰二氮菲光度法測(cè)鐵 :?(Fe)=1.0mg/L, b=2cm , A=0.38 ,計(jì)算? ，S,解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3 g/L /55.85g/mol =1.8×10-5 mol/L,S=M/? =55.85/1.1×104=0.0051 (?g/cm2),29,（二）朗伯比爾定律的推導(dǎo)（自學(xué)）,1. 吸光度的加合性,在多組分體系中如果各吸光物質(zhì)之間無(wú)相互作用這時(shí)體系總的吸光度等于各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和。,2. 朗伯比爾定律建立的前提條件 （1）入射光為平行單色光且垂直照射； （2）吸光物質(zhì)為均勻非散射體系； （3）吸光質(zhì)點(diǎn)之間無(wú)相互作用； （4）輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收過(guò)程，無(wú)熒光和光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生。,30,§11.2 吸光光度法的儀器,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)一般包括光源、單色器、吸收池和檢測(cè)顯示幾部分，基本結(jié)構(gòu)如下： 通過(guò)棱鏡或光柵得到一束近似的單色光，波長(zhǎng)可調(diào), 故選擇性好, 準(zhǔn)確度高。,31,可見(jiàn)分光光度計(jì),廣州泰納UV-4501 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),32,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),33,1、光源：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠 的光強(qiáng)度,穩(wěn)定。 可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm) 紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm) 氙燈：紫外、可見(jiàn)光區(qū)均可用作光源,一、分光光度計(jì)的構(gòu)成,34,35,2、單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。,（1）棱鏡:依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過(guò)棱鏡時(shí)折射率不同,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,入射狹縫,準(zhǔn)直透鏡,棱鏡,聚焦透鏡,出射狹縫,白光,紅,紫,,λ1,λ2,,,800 600 500 400,,,,,,36,（2）光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm )。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,M1 M2 出射狹縫,光屏,透鏡,平面透射光柵,光柵衍射示意圖,原理： 利用光通過(guò)光柵時(shí) 發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.,波長(zhǎng)范圍寬, 色散均勻, 分辨性能好, 使用方便,37,3、吸收池(比色皿)：用于盛待測(cè)及參比溶液。 可見(jiàn)光區(qū)：光學(xué)玻璃池（350～3200nm） 紫外區(qū)：石英池玻璃 （185～4000nm）,5、顯示器： 低檔儀器：刻度顯示 中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動(dòng)掃描記錄,4、檢測(cè)器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成 電流訊號(hào)。 光電池，光電管，光電倍增管,38,吸光光度法儀器主要差異比較,,,,,,,,,39,二、分光光度計(jì)的類型,單光束分光光度計(jì) 雙光束分光光度計(jì) 其他類型分光光度計(jì),多通道儀器 同時(shí)測(cè)量200～820 nm范圍內(nèi)的整個(gè)光譜，比單個(gè)檢測(cè)器快316倍，信噪比增加3161/2 倍。,纖維光度計(jì) 將光度計(jì)放入樣品中，原位測(cè)量。 對(duì)環(huán)境和過(guò)程監(jiān)測(cè)非常重要。,40,,0.575,光源,單色器,吸收池,檢測(cè)器,顯示,1. 單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì),,,,簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度， 一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有 很高的穩(wěn)定性。,41,2. 單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì),42,§11.3 顯色反應(yīng)及其影響因素,一、顯色反應(yīng)的類型及要求 被測(cè)元素在某種試劑的作用下，轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)，稱之為顯色反應(yīng)。 mX(待測(cè)物)＋nR(顯色劑)＝XmRn(有色化合物) 主要有配位反應(yīng)(為主)和氧化還原反應(yīng)。,,,43,配位顯色反應(yīng) 當(dāng)金屬離子與有機(jī)顯色劑形成配合物時(shí)，通常會(huì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷，產(chǎn)生很強(qiáng)的紫外—可見(jiàn)吸收光譜。,氧化還原顯色反應(yīng),例如：鋼中微量錳的測(cè)定，Mn2＋不能直接進(jìn)行光度測(cè)定 2 Mn2＋ ＋5 S2O82-＋8 H2O =2 MnO4- + 10 SO42-＋ 16H+ 將Mn2＋ 氧化成紫紅色的MnO4-后，在525 nm處進(jìn)行測(cè)定。,44,1.配位顯色反應(yīng)類型 二元配合物體系 三元配合物體系 多元配合物體系,混合配合物顯色體系 離子締合物顯色體系 金屬離子-配體-表面活性劑顯色體系,,45,混合配合物顯色體系：由一種金屬離子與兩種不同配體通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合成有色配合物的顯色體系。如：V：H2O2：PAR（吡啶偶氮間苯二酚） 離子締合物顯色體系：金屬離子首先與配體生成配陰離子或陽(yáng)離子，然后再與帶相反電荷的離子締合物的顯色體系。如：Ag+:鄰二氮菲：溴鄰苯三酚紅（深藍(lán)色離子締合物）。 特點(diǎn)： 第一配體已使金屬離子配位飽和，但電荷尚未飽和，可與帶相反電荷的離子締合； 這類締合物在水中溶解度低，易溶于有機(jī)溶劑，多用于萃取光度法。,46,金屬離子-配體-表面活性劑顯色體系 如：稀土元素：二甲酚橙：溴化十六烷基吡啶（藍(lán)色配合物，測(cè)定稀土總量） 常用的表面活性劑： 溴化十六烷基吡啶、 溴化十六烷基三甲基銨 十二烷基磺酸鈉 曲通X-100、OP等。,47,2. 對(duì)顯色反應(yīng)的要求,選擇性好 靈敏度足夠高：? 104 對(duì)比度要大：?? 60 nm 有色化合物的組成恒定，且穩(wěn)定性好。 顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。,48,二、無(wú)機(jī)離子的常用顯色劑,：,：,：,：,助色團(tuán)：－NH，－OH，－X (孤對(duì)電子)ne,,,,,,,,,,,,,O,生色團(tuán)：－N＝N－，－N＝O，,O,C=S,－N （共軛雙鍵）πe,,,,,,,無(wú)機(jī)顯色劑: SCN- [Fe(SCN)]2+ ；H2O2 [TiO·H2O2]2+,有機(jī)顯色劑:,49,OO型：,ON型：,PAR,S型：,雙硫腙,NN型：,丁二酮肟,鄰二氮菲,磺基水楊酸,有機(jī)顯色劑,50,三、影響顯色反應(yīng)的因素,c(R),c(R),c(R),1. 顯色劑用量,Mo(SCN)32+ 淺紅 Mo(SCN)5 橙紅 Mo(SCN)6- 淺紅,Fe(SCN)n3-n,選擇曲線變化平坦處。,51,2. 溶液的酸度,OH-,酸度的影響,影響被測(cè)物質(zhì)的存在狀態(tài),M + nR = MRn,,H+,影響顯色劑的平衡濃度和顏色,RH = R- + H+,影響配合物的組成和顏色,例，磺基水楊酸(ssal) – Fe 3+,pH = 2 ~ 3,FeR,紫紅色,pH = 4 ~ 7,FeR2,橙色,pH = 8 ~ 10,FeR3,黃色,pH12 Fe(OH)3,沉淀,52,pH1pHpH2,選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū),酸度的影響,53,鄰二氮菲－亞鐵反應(yīng)完全度與pH的關(guān)系,pH3～8(檸檬酸鹽介質(zhì))為適宜的酸度范圍,54,3、顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度,（1）顯色時(shí)間：不同的顯色反應(yīng)需要放置不同的時(shí)間，才能達(dá)到溶液顏色的穩(wěn)定形成。另一方面，不同的顯色物具有不同的穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間，測(cè)定一定要在其穩(wěn)定期進(jìn)行，否則，有較大的測(cè)定偏差。,（2）顯色溫度,55,4. 有機(jī)溶劑和表面活性劑 有機(jī)溶劑：降低有色化合物的接力度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度；影響顯色反應(yīng)速率、配合物的顏色、溶解度和組成等。 表面活性劑：具有膠束增溶、增敏作用，提高顯色反應(yīng)的靈敏度，增加有色化合物的穩(wěn)定性。,56,共存干擾離子的消除,Co2＋, Fe3+,Co2+ FeF63-,Co(SCN)2 (藍(lán)),⑴NaF,SCN－,Co2+ Fe2+,Sn4+,(2)Sn2+,Co(SCN)2,SCN－,測(cè)Co2＋(含F(xiàn)e3+) : (掩蔽法),化學(xué)法,5. 共存離子的干擾,57,如無(wú)法通過(guò)控制酸度和掩蔽的辦法消除干擾，則需采取分離法。,測(cè)Fe3＋:(控制pH)，用磺基水楊酸,Fe3+, Cu2+,Fe(ssal)+（紫紅） Cu2+,pH 2.5,ssal,,58,物理法,—選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng),415,500,鈷-亞硝基紅鹽,A,絡(luò)合物,試劑,,,,?/nm,59,測(cè)量條件的選擇：除高效顯色劑外，分光光度法的準(zhǔn)確度和靈敏度還與適宜的測(cè)量條件相關(guān)，包括入射光波長(zhǎng)、吸光度讀數(shù)范圍和參比溶液的選擇。,§11.4 吸光度的測(cè)量及誤差控制,60,1. 測(cè)量波長(zhǎng)的選擇,原則：“吸收最大，干擾最小”,一、測(cè)量波長(zhǎng)和參比溶液的選擇,61,2. 參比溶液的選擇,試液無(wú)吸收，顯色劑無(wú)吸收,試液有吸收，顯色劑無(wú)吸收,試液無(wú)吸收，顯色劑有吸收,試液有吸收，顯色劑有吸收,,,,,62,二、比爾定律的偏離,依據(jù)Beer定律，A與C關(guān)系應(yīng)為 經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的直線 偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面,（一）光學(xué)因素 （二）化學(xué)因素,63,（一）光學(xué)因素,1．非單色光的影響： Beer定律應(yīng)用的重要前提——入射光為單色光,照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光 其波長(zhǎng)寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定 為了保證透過(guò)光對(duì)檢測(cè)器的響 應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度 這就使分離出來(lái)的光具一定的 譜帶寬度,64,2．雜散光的影響： 雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度 范圍內(nèi)，與所選波長(zhǎng)相距較遠(yuǎn) 雜散光來(lái)源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成 雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值,3．反射光和散色光的影響： 反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光 直接對(duì)T產(chǎn)生影響 散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形 注：一般可用空白對(duì)比校正消除 4．非平行光的影響： 使光程↑，A↑，吸收光譜變形,65,（二）化學(xué)因素,Beer定律適用的另一個(gè)前提：稀溶液 濃度過(guò)高會(huì)使C與A關(guān)系偏離定律,（三）介質(zhì)均勻程度,66,微分：,兩式相除得：,以有限值表示可得：,若讀數(shù)的絕對(duì)誤差為△T=1%，用不同的T代入上式，可得相應(yīng)濃度測(cè)量的相對(duì)誤差△c/c，作圖,測(cè)定結(jié)果的精度常用濃度的相對(duì)誤差△c/c表示, （Δc/c）不僅與儀器的透光度誤差ΔT 有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)T 的值也有關(guān),三、吸光度測(cè)量的誤差,67,濃度測(cè)量的相對(duì)誤差與T(或A)的關(guān)系,實(shí)際工作中，應(yīng)控制T在10～70％, A在0.2～0.7之間 (調(diào)c, b, ?),最佳值,最佳讀數(shù)范圍,68,【例】某一有色溶液在2.0cm的吸收皿中，測(cè)得透光率T＝1％，若儀器透光度的絕對(duì)誤差△T＝0.5％，計(jì)算 （1）測(cè)定的濃度的相對(duì)誤差△c/c （2）為使測(cè)得吸光度在最適讀數(shù)范圍內(nèi)，溶液應(yīng)稀釋或濃縮多少倍？ （3）若濃度不變，而改變比色皿厚度（0.5cm, 1.0cm，2.0cm,3.0cm）,則應(yīng)選擇那種厚度的吸收皿最合適，此時(shí)△c/c為多少？,69,解：（1）,（2）A=-lgT=-lg1%=2 設(shè)有色溶液原始濃度為co，當(dāng)b一定時(shí)，A＝εbc＝K?c,要使A＝0.2～0.7，則,即稀釋3～10倍,70,（3）當(dāng)c一定時(shí)即co，A＝εbc＝K?b,要使A＝0.2～0.7，則,bo=2cm,b=0.5cm,71,四、共存組分的干擾及消除,控制溶液酸度 加入掩蔽劑 配位掩蔽劑 氧化還原掩蔽劑,72,§11. 5 吸光光度分析方法,1. 校準(zhǔn)曲線法 (校準(zhǔn)曲線，工作曲線法，外標(biāo)法）,A＝? b c,,,,0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL),A,。 。 。 。,*,,,0.80 0.60 0.40 0.20 0.00,Ax,cx,一、經(jīng)典光度分析方法,73,1.單一組分的測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法 先配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最大吸收波長(zhǎng)處，測(cè)出它們的吸光度，作圖，同條件測(cè)未知液的吸光度，從圖中查出未知液的濃度,,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖,,,,,,,,Ax,cx,74,微量鐵的測(cè)定,氨基酸的測(cè)定,鄰二氮菲法,茚三酮法(紫色化合物),蛋白質(zhì)的測(cè)定,考馬斯亮藍(lán)法,總磷的測(cè)定,海水中營(yíng)養(yǎng)鹽的測(cè)定,磷鉬藍(lán)法,單組分的測(cè)定,75,磷的測(cè)定：DNA中含P～9.2%, RNA中含P～9.5%，可得核酸量。,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 =(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷鉬黃(?小),磷鉬(V)藍(lán)(ε大) λmax=660nm,76,2. 多組分的測(cè)定,根據(jù)加合性原則,解聯(lián)立方程，可求得Cx, Cy,為物質(zhì)的特征參數(shù)，可通過(guò)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得:由x,y標(biāo)液在?1, ?2處分別測(cè)得. 如果兩組分吸收峰相互不重疊，可在不同λmax處測(cè)定,x,y組分不能直接測(cè)定,77,在?1處測(cè)組分x, 在?2處測(cè)組分y.,b) 在?1處測(cè)組分x; 在?2處測(cè)總吸收,扣除x吸收,可求y.,2. 多組分的測(cè)定,78,二、示差光度法,以濃度為 Cs 的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比,（Cx Cs）,ΔAx,適宜 高 濃度的測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)溶液cs 、 c1、 c2、c3……。以cs作參比，調(diào)A = 0. 測(cè) c1 、 c2、c3……的△A，用△A對(duì)△c作圖.同條件下測(cè)△Ax. 從差示工作曲線中查出△cx.,79,示差法提高準(zhǔn)確度的實(shí)質(zhì),常規(guī)法,Tx,,50,100,落在測(cè)量誤差較 大 的范圍,示差法,,,Tr,Ts,Ts,落在測(cè)量誤差較 小 的范圍,結(jié)論：示差法通過(guò)提高測(cè)量的準(zhǔn)確度提高了方法的準(zhǔn)確度,標(biāo)尺擴(kuò)展10倍,80,三、絡(luò)合物組成的測(cè)定,(1)摩爾比法(飽和法) 固定cM ,改變cR 從 0 開(kāi)始增大,M + nR = MRn,81,在特定波長(zhǎng)測(cè)定,CR/CM,82,(2)等摩爾連續(xù)變化法（Job） :,CM / C 從 0 →1,n = 1, CM / C =0.5,n = 2, CM / C =0.33,83,定性法簡(jiǎn)介：目視比色法,特點(diǎn),利用自然光,比較吸收光的互補(bǔ)色光,準(zhǔn)確度低(半定量),不可分辨多組分,方法簡(jiǎn)便，靈敏度高,84,1.了解分子對(duì)光的吸收。吸收曲線—定性分析基礎(chǔ)。 2. 掌握光吸收基本定律：朗伯-比爾定律—定量分析的基礎(chǔ) A=Kbc=-lgT 式中各參數(shù)的物理意義，定量計(jì)算。 3. 分光光度計(jì)基本部件； 4. 靈敏度的表示—? 、S 5.顯色反應(yīng)及條件的確定：顯色劑用量、酸度、時(shí)間、溫度、干擾及消除。 6.吸光測(cè)量條件的選擇：波長(zhǎng)、濃度、參比的選擇 7.應(yīng)用及方法：?jiǎn)我唤M分測(cè)定示例、多組分測(cè)定、高濃度組分測(cè)定、絡(luò)合物組成的測(cè)定。,本章要求,85,思考題： 1. 取鋼樣1.00g，溶解，將其中錳氧化成高錳酸鹽，準(zhǔn)確配制成250mL，測(cè)得其A為1.00×10-3mol·L-1KMnO4溶液A的1.5倍。計(jì)算鋼樣中錳的百分含量。（錳的原子量為54.94） 2.含鐵約0.2%的試樣，用鄰二氮菲光度法（ε=1.1×10 4）測(cè)定。試樣溶解后稀釋至100mL，用1.00cm比色皿，在508nm波長(zhǎng)下測(cè)定A。 a）為使A測(cè)量引起的濃度相對(duì)誤差最小，應(yīng)當(dāng)稱取試樣多少克？b）如果所用光度計(jì)吸光度最適宜范圍為0.200至0.650，測(cè)定時(shí)應(yīng)控制含鐵的濃度范圍為？（鐵的原子量為55.85）,86,本章作業(yè)：,Thanks for Your Attention!,87,關(guān)于期末考試,一、選擇題（共20題 30分） 二、判斷題（共15題 15分） 三、填空題（共20空 20分） 四、簡(jiǎn)答題（共2題 10分） 五、計(jì)算題（共4題 25分）,以期中考試以后的內(nèi)容為重點(diǎn)，但期中考試前的內(nèi)容同樣會(huì)涉及到。,88,一、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 (校準(zhǔn)曲線，工作曲線法，外標(biāo)法）,A＝? b c,§ 11.5 紫外—可見(jiàn)分光光度測(cè)定的方法,,,,0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL),A,。 。 。 。,*,,,0.80 0.60 0.40 0.20 0.00,Ax,cx,89,標(biāo)準(zhǔn)曲線法,在儀器、方法和條件都固定的情況下，標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以多次使用而不必重新制作，因此它適用于大量的經(jīng)常性的工作。 也可用直線回歸的方法，求出回歸的直線方程，再根據(jù)試樣溶液所測(cè)得的吸光度，從回歸方程求得試樣溶液的濃度。在帶有微機(jī)的分光光度計(jì)上，這些工作都能自動(dòng)完成,90,2、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法,又稱直接對(duì)照法：不是用標(biāo)準(zhǔn)系列，而是用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣溶液在相同條件下進(jìn)行顯色、定容，并用同樣大小的比色皿分別測(cè)定其吸光度A。 根據(jù)朗伯-比爾定律： Ax=kbCx; As=kbCs 即：Cx=AxCs /As （k、b 都相等） 樣品較少，非經(jīng)常性工作使用。,91,3、吸光系數(shù)法,在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)使用。用于計(jì)算試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。因?yàn)椋篴樣= A / bc 從文獻(xiàn)上查出a標(biāo)， 然后按文獻(xiàn)規(guī)定條件測(cè)定樣品吸光度A，即可得a樣(c為試樣配制的濃度，b為所用比色皿的厚度）。則樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量為： W = （a樣/a標(biāo)）×100%,92,作業(yè)：,93,