2、養(yǎng)微生物。,無(wú)菌技術(shù)的操作。,二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：,三、技能目標(biāo)：,（2）按培養(yǎng)基的物理形態(tài)分： 液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基,一 基礎(chǔ)知識(shí):,,（3）按培養(yǎng)基的功能分： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,（1）按培養(yǎng)基的化學(xué)成分分： 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基 閱讀課本分別說(shuō)出它們的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)。,培養(yǎng)基的種類,常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種,用于微生物的分離、計(jì)數(shù),常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于分類、鑒定,在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)，從而分離到酵母菌和霉菌
3、。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，但不影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。,根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來(lái)鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目
4、的基因的受體細(xì)胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定;成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn)：來(lái)源受限;成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,天然培養(yǎng)基：,固體培養(yǎng)基：菌落,液體培養(yǎng)基：,表面生長(zhǎng),均勻混濁生長(zhǎng),沉淀生長(zhǎng),
5、半固體培養(yǎng)基：,無(wú)動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散),,,(是否運(yùn)動(dòng)),培養(yǎng)基的配制原則：,目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。 營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比41時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為31時(shí)，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。 pH要適宜：細(xì)菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。 細(xì)菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0,微生物的五種營(yíng)養(yǎng)要素,碳源,氮源（nitrogen source）,生長(zhǎng)因子 微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)叫生長(zhǎng)因子。維生素 氨
6、基酸 堿 基,無(wú)機(jī)鹽（mineral salts）,水（wahtor）,凡能為微生物提供生長(zhǎng)繁殖所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源 。,凡是能為微生物提供所需氮元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。,無(wú)機(jī)C源：CO2、碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用 有機(jī)C源：各種糖類，其次是有機(jī)酸、醇類、 脂類和烴類化合物,碳源種類,分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源 無(wú)機(jī)態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用 有機(jī)態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物 a實(shí)驗(yàn)室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等,氮源種類,構(gòu)成微生物細(xì)胞的組成成分 調(diào)解微生物細(xì)胞的滲透壓， PH值和
7、氧化還原電 位 有些無(wú)機(jī)鹽如S、Fe還可做為自養(yǎng)微生物的能源 構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。Mg、Ca、K是多種酶的激活劑,無(wú)機(jī)鹽（mineral salts）,無(wú)機(jī)鹽功能,構(gòu)成微生物細(xì)胞以C、H、O、N、P、S六種元素為主，約占細(xì)胞干重的95以上； Ca、K 、Mg、Fe為大量元素，以無(wú)機(jī)鹽陽(yáng)離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。 Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來(lái)水原料中已夠用，不需另加。,無(wú)機(jī)鹽種類,碳源、氮源、生長(zhǎng)因子的比較,各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？ 答：不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮
8、源、 無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 注： 另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,二 無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)常用消毒的方法：,1、灼燒滅菌: 2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、
9、121 下維持15-30min.,(2)常用滅菌的方法：,無(wú)菌技術(shù)：,常識(shí),1 無(wú)菌技術(shù)包括： （1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行 清潔和消毒 ； （2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行 滅菌 ； （3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在 酒精燈火焰附近 旁進(jìn)行； （4）避免已滅菌處理的材料用具與 周圍物品 相接觸。 2 消毒方法： （1）日常生活經(jīng)常用到的是 煮沸 消毒法； （2）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用 巴氏 消毒法（作簡(jiǎn)要介紹）； （3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用 紫外線 進(jìn)行物理消毒。 （4）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使
10、用 酒精 進(jìn)行消毒； （5）飲水水源用 氯氣 進(jìn)行消毒。 3滅菌方法： （1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用 灼燒 滅菌法； （2）玻璃器皿、金屬用具等使用 干熱 滅菌法，所用器械是 干熱滅菌箱 ； （3）培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用 高壓蒸汽 滅菌法，所用器械是 高壓蒸汽滅菌鍋 。 （4）表面滅菌和空氣滅菌等使用 紫外線 滅菌法，所用器械是 紫外燈 。,1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？,2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答：
11、無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,3.微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌 2、培養(yǎng)基的配制 3、培養(yǎng)基的滅菌 4、倒平板 5、微生物接種 6、恒溫箱中培養(yǎng) 7、菌種的保存,,三、實(shí)驗(yàn)操作,1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）,1)配制：計(jì)算、稱量、熔化 2)調(diào)節(jié)pH：用3%的HCI/NaOH調(diào)節(jié) pH 70--- 72 3)分裝：分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾 在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。 4)包扎：,操作步驟:,5)滅菌: 將50ml培養(yǎng)
12、基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。 將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 6)倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種. 7)無(wú)菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。,倒平板:,,,,,菌種的保存,1)、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4冰箱保存。 2)、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法,1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦
13、法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,問(wèn)題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？,答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,注意:,3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4).在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不
14、要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,2、純化大腸桿菌:,接種方法有： 平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫(huà)線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫(huà)線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),菌落：,單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,菌落,細(xì)菌的菌落特征因種而異,霉菌的菌落特征 因種而異,菌落,,,,,,,,,,,,,,,,,,劃線后 培養(yǎng)一段時(shí)間后,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),問(wèn)題討
15、論,1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2).在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3).在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是
16、從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。,四、課題成果評(píng)價(jià),（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無(wú)菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀
17、察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。,本課題知識(shí)小結(jié):,【典例解析】,例1關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是: A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽 D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源
18、，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無(wú)機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無(wú)機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無(wú)機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無(wú)機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是: A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌 C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,答案：B,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說(shuō)的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯(cuò)誤的，因?yàn)闇缇?/p>
19、目的是防止雜菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門(mén)接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會(huì)把所接菌種也殺死。,例3右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請(qǐng)據(jù)此回答： （1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是 （2）若不慎將過(guò)量NaCl加入培養(yǎng)基中。 如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入 . 用于培養(yǎng) 金黃色葡萄球菌.,自養(yǎng)型微生物,含碳有機(jī)物,（3）若除去成分，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。 （4）表中營(yíng)養(yǎng)成分共有 類。 （5）不論何種培養(yǎng)基，
20、在各種成分都溶化后分裝前，要進(jìn)行的是 。 （6）右表中各成分重量確定的原則是 。 （7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分是 。,固氮微生物,3,調(diào)整pH,依微生物的生長(zhǎng)需要確定,瓊脂（或凝固劑）,解析： 對(duì)于一個(gè)培養(yǎng)基，它能培養(yǎng)何種微生物，要看它的化學(xué)成分。當(dāng)然這只適用于合成培養(yǎng)基，如果是一個(gè)天然培養(yǎng)基就不能從培養(yǎng)基的成分上區(qū)分它是培養(yǎng)何種微生物的。分析化學(xué)成分要從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的類型出發(fā)。右表中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有水、無(wú)機(jī)鹽、氮源三類，缺乏碳源和特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有的微生物是不需要的，但沒(méi)有微生物是不需要碳源的。該培養(yǎng)基中沒(méi)有碳源，說(shuō)明培養(yǎng)的微生物是從空氣中獲得碳源的，即可培養(yǎng)的微生物就是自養(yǎng)型微生物了。該培養(yǎng)基中加入了過(guò)量食鹽，就可以成為金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基，但金黃色葡萄球菌是異養(yǎng)型微生物，這個(gè)培養(yǎng)基就還需要加入有機(jī)碳源。該培養(yǎng)基若加入（CH2O），培養(yǎng)基中就有了碳源，但除去成分，卻使培養(yǎng)基中沒(méi)有了氮源，這時(shí)就只能用于培養(yǎng)固氮微生物了。對(duì)于菌種鑒定，往往用的是固體培養(yǎng)基，而表中沒(méi)有凝固劑，需要加入常見(jiàn)的凝固劑瓊脂。,謝謝大家,
高中生物選修1微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用.ppt
