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1、以PU/PVA包埋菌體顆粒於氣舉式反應(yīng)器中處理含甲苯與乙酸乙酯廢氣之研究第一年度：造成抑制現(xiàn)象的原因探討,計畫編號：CHU-94-TR-05,主 持 人： 黃思蓴 教授 環(huán)境資源與能源科技研究所 參與人員： 張慧玫 助理教授 生物資訊系 徐增興 助理教授 土木與工程資訊學(xué)系,1.0 簡介,國內(nèi)許多作業(yè)製程常用到大量的揮發(fā)性有機溶劑（VOCs），逸散所造成之污染相當(dāng)普遍，對於環(huán)境及人類會造成重大的衝擊。 對於含VOCs的廢氣，一般皆採用物理化學(xué)方法來處理，雖然處理效果良好，但相對的處理成本較高且可能會產(chǎn)生二次污染的問題，所以近年來以具低成本、高處理效率且無二次污染問題等優(yōu)點的生物處理法最具發(fā)展

2、潛力。 就噴塗業(yè)來說，其製程中所產(chǎn)生之廢氣以甲苯和乙酸乙酯為主，而甲苯和乙酸乙酯皆為高生物分解性之揮發(fā)性有機化合物，所以很適合用生物濾床來處理 。本實驗室過去發(fā)現(xiàn)在高濃度乙酸乙酯存在下，甲苯與二甲苯之去除會受到抑制而導(dǎo)致處理效果大幅下降。 本研究首先想了解噴塗業(yè)所排放含甲苯和乙酸乙酯廢氣，在生物濾床處理時所產(chǎn)生的抑制現(xiàn)象，並且進一步探討使用固定化後來，該抑制現(xiàn)象是否能夠有效改善。,2.0 材料與方法,菌株來源 Rhodococcus fascians AC6（只分解乙酸乙酯；中興李季眉教授）Rhodococcus sp.B5（可分解甲苯和乙酸乙酯；中興李季眉教授）Pseudomonas put

3、ida F1 ATCC 700007（只分解甲苯；新竹市食品所BCRC）。 菌種保存方法為採用繼代培養(yǎng)方法與低溫保存方法。 繼代培養(yǎng)方法為將純菌以平板法培養(yǎng)，保存約1個月。藉由替換固態(tài)培養(yǎng)皿，以重複進行培養(yǎng)達(dá)到菌種保存之目的。 低溫保存方法為將菌液與甘油（glycerol溶液濃度為20）以1：1（v/v）混合注入2 ml之冷凍離心管中，並置入-20之低溫保存箱中進行保存。,2. 材料與方法,培養(yǎng)基 菌種的活化培養(yǎng)基為甲苯或乙酸乙酯等基質(zhì)，以及酵母萃取液及豐味通。工作培養(yǎng)基則如表1所示。 氣相甲苯及乙酸乙酯分析 以氣密針筒抽取0.5 ml待測氣體樣品，注入氣相色層分析儀（GC/FID）中。 氣相

4、層析儀（GC/FID）的操作條件，使用管柱：J&W, DB-5 融合矽膠毛細(xì)管柱，長30m, 內(nèi)徑0.53mm ID，吸附膜為5.0 m。操作溫度依序為：管柱加熱器：120 oC, 注射器：210 oC, 偵測器：230 oC。,表1HCMM2培養(yǎng)基組成 (Ridgway et al., 1990),2. 材料與方法,菌量測定方法 (1) 光學(xué)密度測量法 菌體量測定方法為濁度測定法（optical density，O.D.），利用波長為600 nm之分光光度計，測量待測樣品菌液之吸光度（O.D.600），並以培養(yǎng)液的上澄液校正之。樣品經(jīng)過稀釋後之光學(xué)密度讀值需達(dá)0.5以下，方可進行測量。 (2

5、) 蛋白質(zhì)分析方法 蛋白質(zhì)的測定採BCA測定法（BCA Protein Assay）（Pierce chemical company, 1997），可測定的蛋白質(zhì)濃度範(fàn)圍為202,000g/mL。 BCA分析試劑包括A、B兩試劑及2.0 mg / ml Albumin standard。將A與B試劑以50：1（v/v）的方式均勻混合作為Working Solution，有效保存期限為24小時。 取0.1 ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)試劑或樣品，加入2 ml的Working Solution，置於37水浴槽中反應(yīng)30分鐘後靜置至室溫，再以分光光度計於波長562 nm下量測其吸光度（O.D.562）。,3.1

6、 單一菌株分解甲苯及乙酸乙酯的能力及最佳的成長條件,最佳培養(yǎng)條件 20%的植種率、pH 7、28 oC 菌株分解能力 就乙酸乙酯而言，菌株AC6的分解能力明顯優(yōu)於菌株B5 就甲苯而言，菌種B5的分解能力些微優(yōu)於菌株F1。 而當(dāng)甲苯及乙酸乙酯的負(fù)荷增加時，每一種菌株分解有機物所需的時間都明顯增加，但是仍然在可以分解的範(fàn)圍之下。,,圖1、在相同T/E比，但增加VOC的負(fù)荷下，各種菌株生物分解甲苯與乙酸乙酯的情形：菌株AC6 (a)、菌株B5 (b,c)及菌株F1 (d)。註：菌株AC6 不能分解甲苯，而菌株F1 不能分解甲苯。,3.2 等比例增加T/E負(fù)荷對混合菌株分解有機物的影響,懸浮菌株降解9

7、5%甲苯所需時間 各獨立菌株皆因為甲苯和乙酸乙酯的添加量增加，需要更多的時間來分解甲苯；即使是也是如此。 混合菌株所需的時間卻因為混合而造成嚴(yán)重的延遲；而且是愈高負(fù)荷，影響愈大。按推論，這是群族之間競爭的結(jié)果；而菌株AC6和B5對此效應(yīng)比較輕微。 依據(jù)（Hwang et al., 2003），得知菌株AC6在某些條件下，的確可以幫助菌株B5快速分解乙酸乙酯，而讓菌株B5可以更專一地去分解甲苯，在生態(tài)學(xué)上形成了互助的效應(yīng)。,表2在懸浮狀態(tài)下，同T/E比但增加負(fù)荷的條件下，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5, strains B5 & F1, and strains AC

8、6 & F1) 而能達(dá)到95%甲苯去除率所需的時間,: 需要大於24 h以上的時間來分解,3.2 等比例增加T/E負(fù)荷對混合菌株分解有機物的影響,懸浮菌株降解95%乙酸乙酯所需時間 各獨立菌株也會因為甲苯和乙酸乙酯的添加量增加，而些微增加所需要的時間來有效分解乙酸乙酯；即使是混合菌株也是如此。 混合菌株所需的時間卻只有在菌株B5和F1的組合下，才會造成嚴(yán)重的延遲，其他並不會太嚴(yán)重。 按推論，這也是群族之間競爭的結(jié)果；而菌株B5和F1因為使用相同的甲苯做為碳源，且效率相當(dāng)，所以彼此之間有較嚴(yán)重的抑制現(xiàn)象。,表3在懸浮狀態(tài)下，同T/E比但增加負(fù)荷的條件下，使用單一或任兩組菌株組合 (strains

9、 AC6 & B5, strains B5 & F1, and strains AC6 & F1) 而能達(dá)到95%乙酸乙酯去除率所需的時間,,3.2 等比例增加T/E負(fù)荷對混合菌株分解有機物的影響,微生物固定化後對有機物分解的影響 由圖2(a)、2(b)的比較，得知在微生物固定化之後，分解甲苯所需的時間，亦隨有機物的負(fù)荷增加而些微增加；但所需要的時間不再為無限長。 至於乙酸乙酯，亦可見微生物固定化的幫助，但是沒有對甲苯顯著。 由於固定化的作法是將各菌株以固定的空間隔離開來，在理論上是不會有族群競爭的問題存在。,,3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對混合菌株分解甲苯的影響,懸浮菌株降解9

10、5%甲苯所需時間 各獨立菌株在輕負(fù)荷時，皆因為甲苯的量固定，並不會隨乙酸乙酯的添加量增加，而需要更多的時間來分解甲苯?；旌暇陞s會因乙酸乙酯添加量增加而增加分解甲苯所需的時間。 這說明固定量的甲苯受到乙酸乙酯增加的間接效應(yīng)而增加所需的時間，例如，菌株B5和F1的組合最為嚴(yán)重（基質(zhì)競爭衍生的族群競爭）。 菌株AC6和F1在乙酸乙酯的負(fù)荷較輕微時，因為沒有共同的基質(zhì)，各菌株可以專一地進行甲苯或乙酸乙酯的分解；但在高負(fù)荷時，可能溶氧不足，而抑制。,表4在懸浮狀態(tài)下，以固定甲苯添加量（4 l）下增加乙酸乙酯添加量 (不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5、stra

11、ins B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達(dá)到95%甲苯去除率所需的時間,,3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對混合菌株分解甲苯的影響,微生物固定化後對有機物分解的影響 由圖3(a)、2(b)的比較，得知固定化菌體顆粒，分解固定量甲苯所需的時間，並不太會隨有機物的負(fù)荷增加而增加。 菌株B5和F1在固定化之後，可以有效地改善其原先在懸浮狀態(tài)下分解時間嚴(yán)重落後的現(xiàn)象。 由於固定化的作法，在理論上是不會有族群競爭的問題存在。由此可見，之前推論的基質(zhì)抑制所衍生的族群競爭是正確的。,,圖3、在固定甲苯添加量 (4-l) 下改變T/E比，各種菌群以懸浮 (a) 的或是固定化(

12、b) 的型式來分解甲苯時，去除率達(dá)95%所需的時間：菌群AC6 & B5 (square )、菌群B5 & F1 (circle )及菌群AC6 & F1 (triangle )。,3.4 固定添加4l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響,懸浮菌株降解95%乙酸乙酯所需時間 由表中得知各獨立菌株皆因為乙酸乙酯的量固定，並不會隨甲苯的添加量而增加，而需要更多的時間來分解乙酸乙酯；但是混合菌株B5和F1卻會因甲苯的量增加而增加分解乙酸乙酯所需的時間。 由於甲苯量的增加，對於乙酸乙酯的分解時間沒有改變，這說明在此基質(zhì)抑制的效應(yīng)是不存在的。由於這次又以菌株B5和F1的組合所受到的抑制最

13、為嚴(yán)重，由此可見他們在生態(tài)學(xué)上形成互斥的效應(yīng)。,表5在懸浮狀態(tài)下，以固定乙酸乙酯添加量（4 l）下增加甲苯添加量 (不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達(dá)到95%乙酸乙酯去除率所需的時間,3.4 固定添加4l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響,微生物固定化後對有機物分解的影響 由圖4(a)、2(b)的比較，得知在微生物固定化之後，分解固定量乙酸乙酯所需的時間，並不太會隨甲苯添加量的增加而增加。 菌株B5和F1在固定化之後，可以有效地改善其原先在懸浮狀態(tài)下分解時間嚴(yán)

14、重落後的現(xiàn)象。,3.5 固定添加8l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響,懸浮菌株降解95%乙酸乙酯所需時間 各獨立菌株在固定量的乙酸乙酯下，些微因為甲苯的添加量而增加，而需要更多的時間來分解乙酸乙酯，可見得增加固定量的乙酸乙酯也會造成微生物生理機能上的負(fù)荷而無法作適當(dāng)?shù)恼{(diào)適。 混合菌株B5和F1會因甲苯的添加量增加而增加分解乙酸乙酯的時間，此時在較高的乙酸乙酯添加量，其受到的影響加巨。 這說明在高負(fù)荷時，乙酸乙酯基質(zhì)抑制的效應(yīng)會漸漸因為甲苯添加量的增加而存在。 另外，菌株AC6和B5的組合，對於乙酸乙酯的分解並沒有助益。這事實菌株AC6和B5互助的現(xiàn)象僅止於對於甲苯的分解不同

15、。,表6在懸浮狀態(tài)下，以固定乙酸乙酯添加量（8 l）下增加甲苯添加量（不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達(dá)到95%乙酸乙酯去除率所需的時間,3.5 固定添加8l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響,微生物固定化後對有機物分解的影響 由圖5(a)、2(b)的比較，得知在微生物固定化之後，分解固定量乙酸乙酯所需的時間，亦開始隨甲苯進料量的增加而些微增加，明顯地受到較高的乙酸乙酯添加量所影響。 菌株B5和F1所需要的時間與菌株AC6和F1的組合，在固定化之後，可以有效地

16、改善其原先在懸浮狀態(tài)下分解時間嚴(yán)重或些微落後的現(xiàn)象。,4.0 評估展望,論文結(jié)論 以T/E比為基準(zhǔn)，同步增加甲苯和乙酸乙酯的負(fù)荷，或者在固定甲苯添加量下增加乙酸乙酯的添加量，及固定不同的乙酸乙酯添加量下增加甲苯的添加量，各個實驗中皆發(fā)現(xiàn)混合菌株有明顯的族群抑制現(xiàn)象存在，在經(jīng)固定化後有明顯的改善。 在菌株的組合上，發(fā)現(xiàn)菌株AC6和B5仍然存在些微生態(tài)學(xué)上互助的效應(yīng)，但沒有菌株AC6和F1效果來得好，但後者會因為甲苯的添加量的增加而失去優(yōu)勢。 菌株B5和F1，有明顯的族群抑制現(xiàn)象，不論是同比例增加甲苯或乙酸乙酯的添加量或是增減T/E比，皆是如此；幸而，使用固定化技術(shù)可以有效地解決該問題。,4.0 評估展望,計畫結(jié)論 本計畫於去年十二月底才完成重要設(shè)備的採購驗收。因此，很多如基因鑑定與動力現(xiàn)象模擬的數(shù)據(jù)仍在進行中，針對本計畫第一年度的執(zhí)行成效，仍具信心，相信未來第二年度，更可以看出本計畫前一年度的整體成效。 基於本年度的經(jīng)驗，未來第二年度與第三年度的採購，應(yīng)提早進行，尤其是重要裝備，必須事先採購，並且試車。 對於本計畫建立針對微生物族群結(jié)構(gòu)的分析技術(shù)，未來有助於本校對於自身環(huán)境衛(wèi)生的檢測分析，甚至擴及病源菌的檢測，都可以以此為基礎(chǔ)。,簡報結(jié)束,謝謝聆聽！,