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1、 成纖維生長因子-21通過激活AMPK–SIRT1–PGC-1α信號通路調節(jié)能量代謝 成纖維細胞生長因子-21已經被證實是一種潛在的代謝調節(jié)因子。對經飲食誘導或遺傳的肥胖的糖尿病嚙齒類和恒河猴施用重組成纖維細胞生長因子-21后，其表現(xiàn)出了很強的抗高血糖和降低甘油三酯并減輕體重的作用。盡管成纖維細胞生長因子-21在調節(jié)葡萄糖、脂質和能量平衡中發(fā)揮了重要的作用，但是成纖維細胞生長因子作為一種代謝調節(jié)因子的作用機制仍然不是很清楚。本實驗證明了，成纖維細胞生長因子-21是通過激活AMP激活蛋白激酶(AMPK)和SIRT1，從而增強了線粒體的氧化能力，對脂肪組織細胞進行能量平衡的調節(jié)的。FGF-

2、21作用于來自OB/OB小鼠的脂肪細胞和白色脂肪組織都增強了AMPK的磷酸化水平。FGF-21的應用增強了細胞內的NAD+水平，從而激活了SIRT1及對其下游的靶位點進行了脫乙?；饔?，過氧化物酶體增殖子激活受體-γ輔助因子-1α (PGC-1α)和第3位組氨酸。FGF-21作用脂肪細胞后激活了AMPK和SIRT1，進而增強了線粒體氧化能力，表現(xiàn)為耗氧量、檸檬酸合成酶的活性的增加，以及誘導關鍵代謝基因的轉錄與表達。FGF-21增強線粒體功能的能力需要絲氨酸-蘇氨酸激酶11 (STK11/LKB1)，STK11/LKB1可以激活AMPK .抑制了AMPK,SIRT1和PGC- 1α的活性，F(xiàn)G

3、F-21對氧耗和基因表達的影響降低了，這表明FGF-21的調節(jié)線粒體功能和增加氧化能力是通過依賴AMPK–SIRT1–PGC1α信號通路的這一機制在脂肪細胞細胞中實現(xiàn)的。 AMP激活蛋白激酶（AMPK）是一個主要能量代謝效應器和主要的代謝平衡的調節(jié)因子。LKB1，一種絲蘇氨酸激酶，是激活AMPK的主要調節(jié)因子。LKB1直接對AMPK的第172位的蘇氨酸進行磷酸化進而激活AMPK激酶的活力。LKB1的表達是由運動誘導的，它作為肝臟中葡萄糖生成的關鍵介質之一。最近，AMPK被指出，其在治療二型糖尿病及代謝綜合癥的基本療法中，如二甲雙胍、噻唑啉二酮類、運動等發(fā)揮了重要作用。AMPK的激活，開啟

4、了分解代謝通路，增強氧化代謝和線粒體的生物合成，從而維持了能量平衡。最近，AMPK被發(fā)現(xiàn)通過增加細胞內NAD+ 水平來增強NAD+依賴的三型脫乙酰化酶SIRT1的活性，從而調節(jié)SIRT1下游靶位點的基因的活性。 SIRT1在哺乳動物調節(jié)代謝功能和延長壽命中起到了重要作用。SIRT1的激活同樣利于營養(yǎng)物質的選擇性利用和通過增強線粒體氧化功能調節(jié)能量平衡。AMPK 和SIRT1通過協(xié)同作用，對線粒體生物合成，PGC-1α進行調節(jié)，從而調節(jié)機體對環(huán)境和營養(yǎng)的刺激后的能量平衡。PGC-1α通過與多種轉錄因子相互作用來刺激線粒體的代謝調節(jié)能力。 成纖維細胞生長因子-21已經被證實是一種潛在的

5、代謝調節(jié)因子。對經飲食誘導或遺傳的肥胖的糖尿病嚙齒類和恒河猴施用重組成纖維細胞生長因子-21后，其表現(xiàn)出了很強的抗高血糖和降低甘油三酯并減輕體重的作用。最近研究表明，β-klotho,是一種與klotho相似的單次跨膜蛋白，最為一種FGF-21的信號的輔助受體因子來發(fā)揮其作用。由于β-klotho在FGF-21信號中，作為一種關鍵的輔助因子，所以它的表達使得FGF-21僅在肝臟、胰臟和脂肪細胞組織中特異性表達，因為β-klotho主要在這些部位表達。 最近，F(xiàn)GF-21在肝臟中的作用已被證實，F(xiàn)GF-21在饑餓中對能量平衡起到了重要的調節(jié)作用。FGF-21可通過禁食誘導表達。在禁食中，肝

6、臟中脂肪氧化、甘油三酯的清除及生酮代謝中，都需要FGF-21的存在。盡管，F(xiàn)GF-21在肝臟代謝調節(jié)中起到了重要的作用，但是我們對于其在脂肪組織中所起到的作用還知道的很少。此外，F(xiàn)GF-21在調節(jié)葡萄糖和能力平衡中的作用機制，我們仍然不清楚。 這里我們證明了FGF-21是在脂肪細胞中，通過LKB1激活來調節(jié)AMPK和SIRT1的活性來調節(jié)能量消耗的。FGF-21改變了細胞內NAD+的水平，導致SIRT1的激活，其下游靶基因的脫乙?；?，即PGC-1α and histone 3 (H3)。這些關鍵代謝效應器的激活，導致了線粒體氧化功能的增加，從而闡明了FGF-21在代謝調節(jié)中的作用。 結果

7、 FGF-21增強了AMPK 的活性 為了深入研究FGF-21調節(jié)能量消耗的作用機制，我們用FGF-21 (4.0 μg/mL)處理3T3-L1細胞3天，通過Western blot來分析被激活的AMPK的水平。FGF-21的作用，使磷酸化的AMPK增加了53% (P < 0.05; n = 3),但是AMPK總蛋白(t-AMPK)的水平始終沒有改變(Fig. 1A).有趣的是，F(xiàn)GF-21 (4.0 μg/mL for 3 d)作用于分化的人的脂肪細胞后，使得p-AMPK (P < 0.05;n = 3)有了很大的增加（58%），但是t-AMPK的水平沒有改變(Fig. 1B).。對

8、人脂肪細胞用腺病毒過表達AMPK的alpha2 亞單位的副結構域(DN-AMPK)抑制AMPK的活性，消除了FGF-21刺激P-AMPK的增加(Fig. 1B)。 Fig.1.FGF-21增強了AMPK的活性。（A和B）Western blot 和（A）用FGF21 (4.0 μg/mL)處理3天的3T3-L1細胞中P-AMPK的定量和（B）用FGF21 (4.0 μg/mL)處理3天的人的脂肪細胞中P-AMPK的定量。數據是三次單獨實驗的平均值。（C和D）是Western blot和在WAT中（C）p-AMPK和（D）p-ACC，空白對照組，F(xiàn)GF-21處理組，對照處理組中，n = 8

9、 animals/group. *P < 0.05 (Student’s t test). **P < 0.01. 為了探索FGF-21在體內是否增加AMPK的活性，我們用滲透泵連續(xù)的給ob/ob小鼠灌注重組人FGF-21蛋白來兩周。與以前的報告一致，F(xiàn)GF-21的作用導致了總體重的顯著降低 (Fig. S1A),這與10到14天中少量但是顯著的攝食量下降伴隨著發(fā)生(Fig. S1B)。身體和組織的組成測定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-21處理后的動物體中，總的身體中的脂肪的質量和肝臟脂肪的含量都有明顯的下降(Fig. S1C).我們分析對照組和FGF-21實驗組老鼠體內的WAT中的P-AMPK的含量時，F(xiàn)

10、GF-21實驗組老鼠體內的WAT中的P-AMPK的含量增加了53%，表明增加了AMPK的激活(Fig. 1C).這些數據說明，F(xiàn)GF-21通過激活AMPK來調節(jié)能量消耗。 為了確定FGF-21的作用是否不依賴于體重，我們做了對照飼養(yǎng)研究實驗來比較對照組和FGF-21處理組的體重。與之前的研究一致，F(xiàn)GF-21處理的老鼠未禁食的血糖水平被明顯降低，而對照組則沒有(Fig. S1D).。一個口服葡萄糖耐受實驗顯示，F(xiàn)GF-21處理后可明顯提高葡萄糖的耐受(Fig. S1E)并且降低至曲線下的區(qū)域為45% (Fig. S1F).重要的是，F(xiàn)GF-21處理組動物的p-AMPK的水平增加了53%，但是

11、在對照組中則沒有(Fig. 1C).此外，F(xiàn)GF-21處理的動物的P-ACC的水平增加了（66%）,它是AMPK下游的一個靶基因(Fig. 1D).這些數據表明FGF-21可以增強細胞內AMPK的激酶的活性。這些結果說明，F(xiàn)GF-21對能量平衡的影響與AMPK激活是對立的改變體重的。 FGF-21增加NAD+新城代謝和SIRT1的活性 現(xiàn)在，已經被證明，AMPK直接通過調節(jié)胞內NAD+/NADH的水平來直接激活SIRT1(8).因為FGF-21增加AMPK的活性，我們猜測FGF-21是否能改變胞內NAD+/NADH的水平。與我們的假設一致，F(xiàn)GF-21分別使3T3-L1細胞和人脂肪細

12、胞中的NAD+/NADH增加了48% (P < 0.05;n = 3) 和52% (P < 0.05, n = 3) (Fig. 2 A and C).重要的是，NAD+/NADH的水平，在FGF-21處理的ob/ob的WAT中增加了40%(P < 0.05, n = 8),但是空白對照組中卻沒有(Fig. 2B).用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激的NAD+/NADH的增加，說明FGF-21激活AMPK在SIRT1激活的上游。 為了確定FGF-21誘導的升高的NAD+/NADH是否影響SIRT1的活性，我們確定了已知的SIRT1底物的乙?；饔媚Ｐ蚉G

13、C-1α and H3. 3T3-L1脂肪細胞被轉染進腺病毒表達的shRNA的不含SIRT1的和腺病毒表達的一個Flag–PGC-1α結構。轉染的細胞用FGF21 (4.0 μg/mL) 處理 3 d。用FGF-21處理過的3T3-L1脂肪細胞PGC-1α 的乙?；档土?8% (P < 0.05;n = 3),.shRNA敲出SIRT1 (Fig. 2D)的基因，降低了它的影響。此外，在降低H3的乙?；缴?(68%;P < 0.05; n = 8) 經過FGF21處理的老鼠要比空白對照組明顯 (Fig. 2E). 這些數據表明，在體外脂肪細胞中，F(xiàn)GF21 改變 NAD+代謝水平并且激

14、活了 SIRT1 a的活性?？傊?，這些結果表明FGF-21是通過激活AMPK 和SIRT1來控制能量代謝的。 FGF-21增加線粒體基因和蛋白的表達 AMPK和 SIRT1都是線粒體生物合成的關鍵調節(jié)因子。為了檢驗FGF-21在線粒體生物合成和功能中的作用，我們對3T3-L1脂肪細胞進行熒光定量PCR來測定線粒體功能相關基因的表達。FGF-21處理3T3-L1脂肪細胞后，導致其CPT1a的顯著增加（CPT1a是參與游離脂肪酸跨線粒體膜進行脂肪β-氧化），Idh3a增加了1.6倍（是TCA循環(huán)的限速步驟），CytC增加了 (Fig. S2A).2.1倍。此外，這些基因水平上的改變相互關聯(lián)，

15、增加了Cyt A蛋白的表達水平(6%; P < 0.05; n = 3; Fig. 3A). 此外，F(xiàn)GF21處理人的脂肪細胞后，顯著增加了與線粒體生物合成、β-脂肪酸氧化，包括CPT1a (45%), PPARδ（ 23%), 和PGC-1α (20%)的表達 (Fig. S2C).這些基因表達水平的改變也導致了CytC蛋白的表達水平 (P < 0.05; n = 3) (Fig. 3B). Fig2.FGF-21增加細胞內的NAD+并且降低H3的乙?；饔?。(A)NAD+/NADH在3T3-L1脂肪細胞中的水平。3T3-L1脂肪細胞是經過FGF-21 (4.0 μg/mL; bla

16、ck bars) 或者 PBS空白處理3天。（B）)NAD+/NADH在對照組，F(xiàn)GF-21實驗組，和空白組老鼠（N=8只動物/組）的WAT中的水平。（C）)NAD+/NADH在人的脂肪細胞中，用腺病毒表達對照載體和DN-AMPK轉染脂肪細胞.轉染后的脂肪細胞用 FGF21 (4.0 μg/mL)或者;PBS 處理。（D）Western blot定量檢測3T3-L1細胞中(Ac-PGC-1α) 3T3-L1 脂肪細胞經過腺病毒表達SIRT1-shRNA 和Flag–PGC-1αadipocytes 。 Flag–PGC-1α 是用表面乙?；馁嚢彼峥贵w免疫沉淀和點雜交的。 t-PGC-

17、1α, 是總的 PGC-1α.（E）Western blot定量檢測在對照組，F(xiàn)GF-21實驗組，和空白組老鼠（N=8只動物/組）的WAT中的Ac-H3的水平。所以的數據都是通過三個獨立的實驗的平均值得來的。N=8只/組*P < 0.05 (學生實驗). FGF-21曾經被證明其能在體內增加基因的表達。因此，我們檢測了實驗組的WAT中線粒體蛋白的表達水平。FGF-21處理的實驗組動物的CytC蛋白的表達水平增加了32%(P <0.05; n = 8)，在對照組或者對照鼠中，沒有改變(Fig. 3C). FGF-21增強線粒體的氧化能力 為了更深入的了解FGF-21對線粒體功能的影響，我

18、們檢測了FGF-21處理的3T3-L1細胞中，線粒體酶的活性，主要是檢測檸檬酸合酶的活性，它是TCA循環(huán)中的一個關鍵的組成部分。FGF-21顯著增加了檸檬酸合酶的活力，大約增加了1.7倍，表明FGF-21增強了TCA循環(huán)的活力。 為了進一步了解FGF-21在增加線粒體氧化功能的能力，我們測定了FGF21處理后的 3T3-L1 和人的脂肪細胞的氧耗量。FGF-21增加了基礎氧耗量達1.2倍 (P < 0.05; n = 3)并且增加了寡霉素處理后的3T3-L1細胞的氧耗量達1.3倍(P < 0.05; n = 3; Fig. 3E). FCCP是一種化學耦合器，它能廢除呼吸鏈和氧化磷酸化系統(tǒng)之

19、間的聯(lián)系，并且最大化的增加線粒體的呼吸能力。FGF-21處理后的3T3-L1細胞中，顯著增強了FCCP刺激氧耗的能力，分別增加了1.9和1.7倍(P < 0.01; n = 3)，表明FGF-21增加了氧耗，并且增強了氧化能力(Fig. 3 E and F).。 FGF-21在對線粒體功能的影響時，需要LKB1, AMPK, and SIRT1的幫助 為了確定FGF-21誘導的對線粒體功能的刺激是否需要AMPK，我們有新病毒表達DN-AMPK來轉染人的脂肪細胞。用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激增加CPT-1a and PGC-1α 基因表達和增加氧耗的能力

20、 (Fig. 4B). 因為LKB1調節(jié)AMPK的活性，我們通過使用慢性病毒表達shRNA而不表達LKB1和對照shRNA來預測FGF-21在線粒體功能的作用是否也需要LKB1。含LKB1-shRNA的慢病毒轉導后的PBS 和FGF-21處理后的脂肪細胞LKB1 mRNA 的水平增加了大于70%(Fig. 4C). FGF21顯著增強了在基礎水平上的氧耗率(1.3-fold;P < 0.01; n = 3) 和 FCCP 的處理(1.4-fold; P < 0.001;n = 3) (Fig. 4D). 因為AMPK激活SIRT1，我們接下來要探討AMPK下游的SIRT1是否介導FGF-2

21、1對線粒體功能的影響 用腺病毒轉染3T3-L1脂肪細胞表達SIRT1-shRNA 或者對照 shRNA.這些細胞是經過FGF21 (4.0 μg/mL)處理3天。在PBS- and FGF21處理后的 3T3-L1 脂肪細胞中SIRT1 mRNA 水平被SIRT1-shRNA降低了大于 60% 。FGF21的作用顯著增加了在基礎水平上的氧耗率(1.5-fold; P < 0.05; n = 3)，同樣的效果也表現(xiàn)在寡霉素處理的細胞中(1.4-fold; P < 0.05; n = 3) 和 FCCP(1.7-fold; P < 0.01; n = 3) 處理的細胞中(Fig. 4F)

22、. FGF21誘導氧耗量的增加的能力在用shRNA敲出的SIRT1基因后有所降低 (Fig. 4F).總之，結果證明FGF-21是通過依賴 LKB1-,AMPK-, and SIRT1通路來增強線粒體功能的。 Fig3.為FGF-21在（A）FGF-21處理后的3T3-L1細胞和（B）人脂肪細胞，空白，PBS處理，背景空白，F(xiàn)GF-21處理中增加線粒體蛋白的表達和功能CytC蛋白水平的結果分析。（C）CytC 蛋白的水平在對照組, FGF21處理的實驗組，和 空白組老鼠的WAT中 (D)CS 的活性FGF-21處理的3T3-L1 的脂肪細胞. (E)氧耗量在3T3-L1 細胞 和 (F)

23、人的脂肪細胞用 PBS (white bars) 或FGF21(black bars). 數據是三次獨立實驗的平均值. *P < 0.05;**P < 0.01 (Student’s t test). Fig. 4. FGF21 effects in adipocytes require AMPK activity. (A)Gene expression in human adipocytes infected with adeno-virus expressing DN-AMPK or GFP (Ctrl) and treated with PBS(white bars) or

24、 FGF21 (black bars). (B) Oxygen consumption inhuman adipocytes infected with adenovirus expressing DN-AMPK or GFP (Ctrl) and treated with PBS (white bars) orFGF21 (black bars). (C) Gene expression in human adipocytesinfected with lentivirus expressing shRNA against LKB1 orcontrol s

25、hRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) or FGF21 (black bars). (D) Oxygen consumption in 3T3-L1 adipo- cytes infected with lentivirus expressing shRNA against LKB1or control shRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) orFGF21 (black bars). (E) Gene expression in human adipocytesinf

26、ected with adenovirus expressing shRNA against SIRT1 orcontrol shRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) orFGF21 (black bars). (F) Oxygen consumption in 3T3-L1 adipo-cytes infected with adenovirus expressing shRNA against SIRT1or control shRNA (Ctrl) and treated with PBS (white bars) o

27、rFGF21 (black bars). Data are averages of three independentexperiments. All gene-expression data are quantitative RT-PCRs,normalized to the housekeeping gene, TATA box binding pro-tein. *P < 0.05; **P < 0.01 (Student’s t test). ***P < 0.001. FGF21介導的影響線粒體功能上需要PGC-1α 因為AMPK 和 SIRT1 都調節(jié)PGC-1α 表達

28、和活性，我們通過定量PCR來鑒定FGF-21處理的3T3-L1脂肪細胞中PGC-1α的增加。有趣的是，經過處理的細胞中，F(xiàn)GF21 并沒有表現(xiàn)出增加PGC-1α的mRNA的表達(Fig. 5A).可是，我們發(fā)現(xiàn)FGF21通過對 SIRT1的去乙?；瘉碚{節(jié)PGC-1α的活性(Fig. 2D).為了驗證FGF-21調節(jié)線粒體的功能是否需要PGC-1α,我們完成了3T3-L1細胞中shRNA敲出研究。在經過PGC-1α–shRNA 轉染的3T3-L1脂肪細胞與空白相比PGC-1α 的mRNA 水平降低了大于70% 在3T3-L1脂肪細胞中(Fig. 5A).敲除了PGC-1α降低了FGF-21在CT

29、P-1a 和CytC基因表達上的影響，完全抑制了FGF21誘導的氧耗量的在基礎水平上，與寡霉素和FCCP處理的結果同(Fig. 5B)。因此，我們的結果顯示，F(xiàn)GF-21在調節(jié)線粒體功能的綜合作用中需要PGC-1α.。 Fig. 5. FGF21 effects in adipocytes require PGC-1α. (A) PGC-1α expression in 3T3-L1 adipocytes infected with shRNA-cytomegalovirus (CMV) (Ctrl) or shRNA–PGC-1α adenovirus and treated wi

30、th PBS (white bars) or FGF21 (black bars). Data shown are from quantitative RT-PCRs, normalized to the housekeeping gene,TATA box binding protein. (B) Oxygen consumption in 3T3-L1 adipocytes infected with shRNA-CMV (Ctrl) or shRNA–PGC-1α adenovirus and treated with PBS(white bars) or FGF21 (black ba

31、rs). Data are averages of three independent experiments. *P < 0.05; **P < 0.01 (Student’s t test). (C) Schematic diagramshowing FGF21 activation of AMPK via LKB1, which indirectly activates SIRT1 by increasing the cellular NAD+/NADH ratio. The pathway converges on reg-ulation of PGC-1α activity and,

32、 ultimately, on mitochondrial oxidative function. 討論 這里 我們證實了FGF21能通過增強線粒體的功能和效率來調節(jié)能量的自我平衡，這是通過在體內外的實驗中增強AMPK和SIRT1實現(xiàn)的。在圖5C中我們的數據提供了FGF21的工作模型。FGF21通過LKB1增加了AMPK的磷酸化水平。AMPK的激活導致了細胞內NAD+水平的增加，又激活了SIRT1隨后影響了多種代謝通路。這里我們調查了調節(jié)線粒體氧化功能的通路。結果顯示FGF21在增加線粒體功能上的效果是通過PGC1-ɑ介導的。 再FGF21治療的脂肪細胞中，AMPK和SIRT

33、1的活化集中增強了線粒體的氧化功能，包括氧耗量的增加，檸檬酸合成酶的活性以及一些關鍵代謝基因的誘導，這些基因包括CPT1ɑ和CytC。通過顯性失活和shRNA腺病毒和慢病毒來抑制LKB1，AMPK和SIRT1的活性弱化了FGF-21在氧耗量和基因表達方面的作用，顯示FGF-21是通過依賴于AMPK和SIRT1的機制來調節(jié)線粒體功能和增加氧容量。在體內外實驗中我們都觀察到FGF-21對AMPK和SIRT1的作用，證明這些作用很可能直接與體重和肥胖的變化有關而非間接地。 Ｗａｎｇ等人已經證實，在脂肪形成過程中，PPARγ的配體結合域的７個螺旋對于PPARγ對內源性配體的應答是必須的，同樣對于一些

34、小分子的表達也是必須的如ＦＧＦ２１。這些小分子基因的表達式受SIRT1抑制的，使SIRT1抑制能夠產生與PPARγ配體相同的作用效果。有趣的是，我們的結果還證實了，在用FGF-21治療肥胖的過程中抑制了PPARγ的表達增強了AMPK和SIRT1的活性，很有可能SIRT1抑制FGF-21的表達在脂肪形成過程中是必要的，但是在成熟的脂肪細胞中FGF-21能增強SIRT1的活性來維持能量的自我平衡。 Ｃｏｓｋｕｎ等人先前證明FGF-21在ＷＡＴ中能誘導PGC1-ɑ的表達，與他們的結果相一致，我們也證實FGF-21在線粒體功能上起作用需要PGC1-ɑ，我們進一步顯示了FGF-21能增加AMPK和SI

35、RT1的活性與PGC1-ɑ協(xié)同作用來維持能量的自我平衡。 最近通過饑餓實驗表明PGC1-ɑ能夠下調肝臟中FGF-21的表達。在老鼠中慢性的減少PGC1-ɑ的表達能夠增加FGF-21的表達。當PGC1-ɑ水平很低FGF-21能介導生酮作用，這種情況下動物代謝水平與饑餓情況相似。與先前的研究相似，F(xiàn)GF-21在肝臟的脂代謝中起作用需要PGC1-ɑ，我們的結果顯示用ＦＧＦ２１治療肥胖能增肌線粒體的氧容量同時也需要PGC1-ɑ。 與我們的假說相一致，使用FGF-21治療肥胖小鼠引出了本來的代謝作用與過表達SIRT1的轉基因小鼠相似。FGF-21治療的和SIRT1轉基因的都顯示體重，血漿中胰島素及葡

36、萄糖水平的下降也增強了葡萄糖的耐受性。另外，使用AMPK激活因子如二甲雙胍引起的代謝作用與FGF-21相似包括葡萄糖的下降。我們觀察到在FGF-21治療的小鼠中產生了匯聚性的生物學效應如AMPK和SIRT1的活化與我們的假說FGF-21能夠誘導AMPK和SIRT1的活性相一致。 我們結果顯示FGF-21能通過LKB1激活AMPK的活性，F(xiàn)GF-21對線粒體功能起作用需要LKB1。FGF-21的信號通路是通過β-klotho和FGF受體介導了ERK 1/2的活化從而調節(jié)了LKB1的活性。很有可能FGF-21是通過ERK 1/2和LKB1相互作用來調節(jié)AMPK的。 FGF的作用限于表達β-kl

37、otho的組織，包括肝臟胰腺和脂肪組織。我們的研究顯示FGF-21在脂肪組織中能夠刺激AMPK和SIRT1的活性。最近發(fā)現(xiàn)FGF-21能增加PGC1-ɑ的表達以及激活肝臟中脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)。將會很有意思去確定FGF-21在肝臟中是否能激活AMPK和SIRT1的活性與PGC1-ɑ協(xié)調一致作用。先前研究已經證明FGF-21能夠保護胰島β細胞免受糖脂毒性誘導的細胞凋亡和功能障礙，已經證實SIRT1和NAD＋的代謝在胰島的功能和代謝上起到關鍵作用，也很有興趣去研究FGF-21在β細胞存活和功能上是受SIRT1介導的。很有可能FGF-21在這些通路中的作用在其他的組織中也有發(fā)生，例如肝臟胰腺和脂肪

38、組織中，他們共同調節(jié)了能量的自我平衡。 總之，我們的結果揭示了FGF-21增強線粒體功能和氧化能力的大體過程。FGF-21主要通過激活AMPK和SIRT1以及他們下游靶位點， 包括脂肪細胞中的PGC-1α。因此，對于這些改變的綜合反映生理的能力生產和脂肪酸的氧化提高了脂肪酶和胰島素的敏感性，表明了FGF-21在代謝調節(jié)上的優(yōu)勢。我們的在人的脂肪細胞的結果顯示，在嚙齒類和人的細胞中對線粒體功能有相同的促進作用，也表現(xiàn)出了FGF-21在治療肥胖和二型糖尿病上的潛在價值。 方法 動物及治療 8周齡的雄性ob/ob小鼠來源于杰克遜實驗室，所有的操作過程都符合美國健康管理局及人類服務

39、中心的標準，也得到動物保護及 委員會的批準。小鼠隨機分配成治療組和空白組。通過飲食時的體重指數和血糖水平進行區(qū)分，空白對照組給予PBS，治療組通過滲透泵持續(xù)給予FGF-21皮下注射。通過尾靜脈采血，血糖通過精確的G葡糖糖測試系統(tǒng)，禁食過夜后進行葡糖糖耐受實驗，裝載量為1G/KG. 細胞培養(yǎng) 體外治療 腺病毒轉染 3T3-L1細胞來源于美國細胞培養(yǎng)中心，3T3-L1在生長培養(yǎng)基中會發(fā)生富集，將細胞孵育在分化培養(yǎng)基中進行分化，時間為四天，然后再孵育在生長培養(yǎng)基中四天，讓其完全的脂肪細胞轉變。在第八天，細胞孵育在加油FGF-21（4ug/ml）或者PBS的生長培養(yǎng)基中，孵育72小時.每24

40、小時進行換液。人脂肪細胞來源于細胞應用中心，人前脂肪細胞在前脂肪細胞中培養(yǎng)進行富集，將細胞在分化培養(yǎng)基中分化10天進行分化培養(yǎng)。對于基因沉默實驗，通過脂質體轉染，將表達阻抗SIRT1 、PGC-1 α等基因表達的腺病毒shRNA轉染進人的3T3-L1細胞。對于LKB1的基因沉默，通過慢病毒轉染shRNA阻抗LKB1基因的表達。LKB1-shRNA慢病毒是從Santa Cruz 生物技術中心購買的。DN-AMPKα2購買于Eto生物科學中心，對于PGC-1 α乙?；瘜嶒?，通過表達SIRT1-shRNA慢病毒感染3T3-L1細胞。 表達和純化重組人的FGF-21 cDNA編碼位于TEV

41、酶切位點后的N端帶有六個HIS標簽33–209的氨基酸殘基，克隆在pET-15b的NcoI和Xhol位點之間。HIS標簽可以通過TEV蛋白酶切除，樣品之后可以進行5K分子量濃縮，然后泵入Superd ex 200的凝膠柱，用PBS平衡柱子，蛋白濃度通過Bradford蛋白法。 RNA分離 逆轉錄 熒光定量PCR RNA通過TRIzo試劑從細胞和組織中提取出來，再通過Qi agen RNA酶試劑盒進行純化，分離的RNA按照試驗步驟逆轉錄成cDNA，樣品一式三份通過ABI Prism 790 0H T進行熒光定量PCR，試驗需要的引物及探針來源于A pplied B iosystem

42、s. 氧消耗及檸檬酸合成活性試驗 檸檬酸合成活性通過檸檬酸合成試劑盒檢測，總共需要2ug蛋白進行試驗，XF24細胞外流量分析進行氧消耗量檢測，氧消耗量通過fi xed delta機器產生的斜率進行計算。 NAD+/NADH and CytC 的分析. NAD+和 NADH 的水平是通過 NAD/NADH分析試劑盒來確定（購自Abcam）. CytC 蛋白的水平是通過 CytC ELISA 來測定的（通過R&D 系統(tǒng)獲得）。 蛋白免疫印跡和免疫沉淀反應 在裂解緩沖液（含有蛋白酶和磷酸鹽抑制劑）中裂解細胞，裂解物超聲破碎1min，4C14,000g離心10min，為

43、了進行免疫沉淀實驗，將800μg的蛋白在4C與帶有抗Flag的瓊脂糖顆粒孵育，跑SDS-PAGE膠并轉移到硝酸纖維素膜上 統(tǒng)計分析 數據的分析使用的是學生實驗差異顯著用星號表示 參考文獻 1. Hardie DG (2007) AMP-activated/SNF1 protein kinases: Conserved guardians of cellular energy. Nat Rev Mol Cell Biol 8:774–785. 2. Shaw RJ, et al. (2004) The tumor suppressor LKB

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