海洋酸化對(duì)脊尾白蝦抗氧化酶活性研究
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1、海洋酸化對(duì)脊尾白蝦抗氧化酶活性研究 海洋酸化對(duì)脊尾白蝦抗氧化酶活性研究 2019/01/28 摘要:采用高純度CO2和空氣的混合氣體調(diào)配試驗(yàn)所需酸化海水,研究不同海水酸化條件脅迫對(duì)脊尾白蝦超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)濃度的影響.結(jié)果表明,1000μL/LCO2酸化組SOD,CAT和GSH-Px活性表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì),其中SOD和CAT活性分別在7d和14d時(shí)受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)
2、,而GSH-Px活性在7d和14d時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05);1900μL/L酸化組SOD,CAT和GSH-Px活性在暴露過程中受到不同程度的抑制,其中SOD活性在14d和28d時(shí)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),CAT和GSH-Px活性均在14d時(shí)受到顯著抑制(P<0.05);1000μL/L和1900μL/LCO2酸化組的MDA濃度均呈現(xiàn)先增加后回落的趨勢(shì),1000μL/L組在14d時(shí)MDA濃度顯著增加(P<0.05),而1900μL/L組則在7d和14d時(shí)MDA濃度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)且在14d時(shí)達(dá)到最大值.由此可見,海洋酸化對(duì)脊尾白蝦的抗氧化酶活性具有明顯的刺激作用,
3、且在輕度酸化脅迫時(shí)抗氧化酶活性受到誘導(dǎo),而在較高強(qiáng)度的酸化脅迫時(shí)其活性被抑制. 關(guān)鍵詞:海洋酸化;脊尾白蝦;超氧化物歧化酶;過氧化氫酶;谷胱甘肽過氧化物酶;丙二醛 引言 自工業(yè)革命以來,化石燃料燃燒等人類活動(dòng)導(dǎo)致大氣中CO2從工業(yè)革命前的280μL/L增長至2013年的394μL/L,增長了約40%[1].據(jù)IPCC(聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會(huì))預(yù)測(cè),2100年大氣中CO2將會(huì)達(dá)到1000μL/L,表層海水pH將繼續(xù)下降0.3~0.4;至2300年時(shí)有可能達(dá)到1900μL/L,pH可能將再下降0.7~0.8[2-3].多年來,人們認(rèn)為海洋酸化
4、的進(jìn)程是緩慢而不易察覺的,但調(diào)查結(jié)果大大超乎人們的預(yù)料.據(jù)調(diào)查,在海洋酸化的影響下,意大利那不勒斯附近海域的有孔蟲種類急劇減少,由24種減少到6種[4].美國Tatoosh島附近海域海水pH實(shí)際上升的平均速度也比預(yù)測(cè)的速度快10倍以上[5].由此可見,海洋酸化正以人們無法估計(jì)的速度加劇影響著海洋化學(xué)變化,對(duì)海洋生物的生存及海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡構(gòu)成嚴(yán)重的威脅.目前,對(duì)海洋酸化的研究主要集中在海洋酸化對(duì)無脊椎動(dòng)物(腔腸動(dòng)物、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物)及魚類的生長率、成活率、鈣化率、感官能力、繁殖能力等的影響方面[6-7],特別是關(guān)于海洋酸化對(duì)海洋生物的受精、胚胎早期發(fā)育及幼體存活率影響開展了較多
5、的研究.研究表明,海洋酸化會(huì)導(dǎo)致許多無脊椎動(dòng)物的早期胚胎和幼體發(fā)育遲緩,甚至產(chǎn)生致畸、致死效應(yīng).劉文廣等[8]的研究結(jié)果表明海洋酸化對(duì)馬氏珠母貝的受精率無顯著影響,但會(huì)導(dǎo)致其幼蟲發(fā)育受阻,存活率降低.在甲殼動(dòng)物中也存在類似的現(xiàn)象,如海洋酸化處理帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)胚胎,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4%的眼變大和5%的卵黃變小,而且平均孵化周期延長33%;酸化處理幼體時(shí),其存活率下降[9].但不同物種間甚至同一物種的不同發(fā)育階段對(duì)海洋酸化的響應(yīng)也存在差異.如在同樣的較高CO2濃度條件下,梅氏長海膽(Echinometramathaei)和馬糞海膽(Hemicentrotus
6、pulcherrimus)的受精率有所不同[10].由此可見,生長環(huán)境的差異和不同海洋生物自身機(jī)能、生活習(xí)性及發(fā)育特點(diǎn)等方面的不同使不同海洋生物產(chǎn)生了不同的酸堿調(diào)節(jié)能力,其機(jī)制也存在很大的差異.脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國沿海重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一,具有環(huán)境適應(yīng)性廣、繁殖周期短、生長速度快等優(yōu)點(diǎn),而且能在室內(nèi)通過控溫促使其繁育而不受季節(jié)的影響,可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得不同發(fā)育時(shí)期的試驗(yàn)材料.因此,脊尾白蝦是一種理想的測(cè)試生物體,可用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)海洋水體環(huán)境和質(zhì)量變化.本文研究脊尾白蝦在海水酸化暴露脅迫下,體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過
7、氧化物酶(GSH-Px)等酶活性的變化及其體內(nèi)丙二醛(MDA)濃度的變化,評(píng)價(jià)SOD,CAT,GSH-Px和MDA作為海水酸化暴露的生物標(biāo)志物的適用性,為預(yù)測(cè)未來海洋酸化對(duì)海洋生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響提供依據(jù). 1材料與方法 1.1試驗(yàn)材料脊尾白蝦取自連云港忠玉水產(chǎn)養(yǎng)殖場,蝦體長(4.970.14)cm,體質(zhì)量(2.750.12)g.試驗(yàn)前選擇健康的脊尾白蝦放入室內(nèi)水族箱中馴養(yǎng)7d以上,馴養(yǎng)期間,每日換水一次,并在自然死亡率低于2%的情況下選擇身體健康、大小基本一致的脊尾白蝦供試驗(yàn)用. 1.2海水酸化暴露試驗(yàn)CO2體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為400μL/L(對(duì)
8、照組)、1000μL/L和1900μL/L,對(duì)應(yīng)的pH分別為8.1,7.7和7.4.采用“一種獲取不同二氧化碳濃度的裝置”(ZL201720578617.0)將空氣與純CO2氣體混合得到相應(yīng)CO2體積分?jǐn)?shù)的混合氣體,通入到30L養(yǎng)殖容器的過濾(0.45μm微孔濾膜過濾)海水中,待海水酸化穩(wěn)定后用于試驗(yàn).將馴養(yǎng)后的180尾脊尾白蝦隨機(jī)分到9個(gè)養(yǎng)殖容器中,每個(gè)養(yǎng)殖容器內(nèi)放置20尾,每個(gè)CO2體積分?jǐn)?shù)組設(shè)置3個(gè)重復(fù).在酸化海水暴露期間的1,3,7,14和28d時(shí)分別?。澄参r,解剖后取肝胰腺置于離心管中,做好標(biāo)記并在-20℃冰箱中冷凍保存. 1.3組織勻漿制備及酶活性測(cè)定將各個(gè)時(shí)期取樣
9、的肝胰腺在冰浴中與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%的生理鹽水(配方)用玻璃勻漿器制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的勻漿,4℃10000r/min離心15min,取上清液用于總蛋白、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性及MDA濃度測(cè)定.1.3.1總蛋白的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍(lán)法總蛋白(TP)測(cè)試盒的操作步驟測(cè)定組織蛋白含量,用于計(jì)算SOD,CAT和GSH-Px酶活性及MDA濃度.1.3.2SOD,CAT和GSH-Px活性的測(cè)定按南京建成生物工程研究所提供的SOD測(cè)試盒(WST-1法)、CAT測(cè)試盒(可見光法)和GSH-Px測(cè)試盒(比色法)的操作步驟測(cè)定該3種酶的活性.1.3.3MDA濃度的測(cè)定按
10、南京建成生物工程研究所提供的MDA測(cè)試盒(TBA法)操作步驟測(cè)定組織中MDA濃度. 1.4數(shù)據(jù)處理酶活性用“平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差(meansSD)”表示.試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用方差分析(ANOVA)法分析試驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異,并用Student-Newman-Keul’s檢驗(yàn)法分析組間顯著性,P<0.05表示差異顯著. 2結(jié)果與分析 2.1海水酸化對(duì)脊尾白蝦SOD活性的影響由圖1可見,隨著暴露時(shí)間的延長,1000μL/L酸化組的脊尾白蝦SOD活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì).暴露1d和7d時(shí)1000μL/L酸化組SOD活性與
11、對(duì)照組之間的差異并不顯著(P>0.05);暴露14d時(shí)酸化組SOD活性受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)且達(dá)到最大值;暴露28d時(shí),其SOD活性高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05).暴露于1900μL/L酸化組的脊尾白蝦SOD活性在暴露過程中受到不同程度的抑制.1d和7d時(shí)1900μL/L組與對(duì)照組的SOD活性無顯著差異(P>0.05);14d和28d時(shí)1900μL/L組SOD活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且在14d時(shí)達(dá)到最低值. 2.2海水酸化對(duì)脊尾白蝦CAT活性的影響不同程度酸化暴露對(duì)脊尾白蝦CAT活性的影響如圖2所示.暴露于1000μL/LCO2的脊尾白蝦CAT活性
12、表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì),在1d時(shí)1000μL/L組與對(duì)照組的CAT活性無顯著差異;在7d時(shí)CAT活性受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)且達(dá)到最大值;14d和28d時(shí)1000μL/L組CAT活性高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05).暴露于1900μL/LCO2的脊尾白蝦CAT活性隨著暴露時(shí)間延長先抑制后逐漸回升.暴露1d和7d時(shí)酸化組CAT活性略低于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05);暴露14d時(shí)酸化組CAT活性受到顯著抑制(P<0.05)且達(dá)到最低值;暴露28d時(shí)酸化組CAT活性低于對(duì)照組,但無顯著差異(P>0.05). 2.3海水酸化對(duì)脊尾白蝦GSH-Px活性的影響由圖3可以看
13、出,隨著暴露時(shí)間的延長,1000μL/L酸化組脊尾白蝦GSH-Px活性呈現(xiàn)先增加后逐漸下降的趨勢(shì).暴露1d時(shí)酸化組GSH-Px活性與對(duì)照組無顯著差異;7d和14d時(shí)酸化組GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且在7d時(shí)達(dá)到最大值;暴露28d時(shí)酸化組GSH-Px活性雖然高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05).暴露于1900μL/L酸化組的脊尾白蝦GSH-Px活性與SOD及CAT活性類似,在暴露過程中受到不同程度的抑制.1d和7d時(shí)1900μL/L組與對(duì)照組的GSH-Px活性無顯著差異;14d時(shí)1900μL/L酸化組GSH-Px活性受到顯著的抑制(P<0.05)且達(dá)到最低值;28d時(shí)1
14、900μL/L組GSH-Px活性低于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05). 2.4海水酸化對(duì)脊尾白蝦MDA濃度的影響在不同CO2體積分?jǐn)?shù)酸化條件下,脊尾白蝦MDA濃度變化如圖4所示.暴露于1000μL/LCO2的脊尾白蝦MDA濃度隨著暴露時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì).暴露1d和7d時(shí)MDA濃度與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05);暴露14d時(shí)MDA濃度顯著增加(P<0.05)且達(dá)到最大值;暴露28d時(shí)MDA濃度與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05).在1900μL/LCO2酸化條件下,脊尾白蝦MDA濃度隨著暴露時(shí)間的延長表現(xiàn)為先增加后回的趨勢(shì).1d時(shí)1900μL/L組的MDA
15、濃度低于對(duì)照組但無顯著差異(P>0.05);7d和14d時(shí)MDA濃度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)且在14d時(shí)達(dá)到最大值;28d時(shí)1900μL/L酸化組MDA濃度高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05) 3討論 抗氧化酶系統(tǒng)在清除體內(nèi)活性氧物質(zhì)、使細(xì)胞免受氧化損傷過程中發(fā)揮著重要作用.當(dāng)生物體受到外界不利因素脅迫時(shí),其體內(nèi)將產(chǎn)生過量的活性氧,打破機(jī)體內(nèi)抗氧化防御性功能酶與活性氧自由基之間的平衡關(guān)系,過量的活性氧將攻擊各種生物大分子,引發(fā)生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化,對(duì)細(xì)胞和機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[11].SOD和CAT是生物體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶,正常情況下
16、,SOD,CAT和GSH-Px協(xié)同作用可以有效清除脅迫所產(chǎn)生的活性氧自由基,從而使機(jī)體細(xì)胞免受自由基損傷[12-14].已有研究表明,生物體的SOD和CAT等抗氧化酶在不同pH的環(huán)境脅迫下,其酶活性可能會(huì)受到誘導(dǎo)或抑制兩種現(xiàn)象.金頭鯛(Sparusaurata)在用CO2模擬海水酸化的試驗(yàn)中,SOD活力隨酸化梯度呈現(xiàn)出規(guī)律性變化[15].樊甄姣等[16]研究發(fā)現(xiàn),略低于正常值(pH8.0)的pH脅迫下,櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)血清中SOD和CAT活性明顯升高,但低pH(7.0)時(shí),SOD和CAT活性受到顯著抑制.與此類似的情況在背角無齒蚌(Anodontawoodiana)中也
17、存在,低pH(6.0)或高pH(8.5)均會(huì)使背角無齒蚌血清中SOD和CAT活性有不同程度的降低[17];馬廣智等[18]研究發(fā)現(xiàn)草魚(Cteno-pharyngodonidellus)在低pH環(huán)境脅迫下SOD活性被抑制.克林雷氏鯰(Rhamdiaquelen)在pH5.0的環(huán)境下脅迫其肝、鰓和肌肉中的CAT活力也顯著低于pH7.0對(duì)照組[19].本研究發(fā)現(xiàn),1000μL/LCO2酸化組,脊尾白蝦的SOD,CAT及GSH-Px酶活性先上升后下降,3種酶活性在1d時(shí)酸化組與對(duì)照組均無顯著差異,在7d時(shí)CAT和GSH-Px兩種酶活性受到顯著誘導(dǎo)且達(dá)到最大值,SOD酶活性則在14d時(shí)顯著高于對(duì)照組.
18、與此類似的是菲律賓簾蛤(Ruditapesphilippinarum)在海水CO2酸化條件下,pH7.6組的SOD活性顯著高于pH7.9對(duì)照組[20].這是由于CO2溶解于海水后引起水體環(huán)境pH的下降,破壞了脊尾白蝦體內(nèi)體液的酸堿平衡,而機(jī)體酸堿平衡失調(diào)伴隨氧化應(yīng)激反應(yīng),同時(shí)激活抗氧化防御機(jī)制,從而影響抗氧化酶的活性[21].本研究中,暴露于1900μL/LCO2酸化組的脊尾白蝦,其SOD,CAT及GSH-Px酶活性則受到不同程度的抑制;該3種酶活性在1d和7d時(shí)酸化組與對(duì)照組均無顯著差異,而在14d時(shí)這3種酶活性均受到顯著抑制且達(dá)到最低值.這可能是隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的升高,環(huán)境pH進(jìn)一步降低
19、,使機(jī)體H+濃度增加,而多余的H+促機(jī)體生成更多的活性氧自由基,破壞機(jī)體活性氧平衡,引起SOD等酶活性降低[21].此外,本研究結(jié)果與李信書等[22]發(fā)現(xiàn)隨著Cd和Cu濃度增加亞心形扁藻(Platynonassubcordi-formis)的SOD酶活性也隨之增加,但濃度過高時(shí)反而下降的研究結(jié)論基本一致;與此類似的是,日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)在pH7.2水體脅迫下其SOD的活性隨脅迫時(shí)間延長而逐漸降低[23].這可能是生物機(jī)體的SOD,CAT及GSH-Px等抗氧化酶活性在受到嚴(yán)重脅迫時(shí)被抑制,而在輕度脅迫時(shí)往往受到誘導(dǎo)而升高[24].樊甄姣等[16]的研究結(jié)果也
20、表明,pH在一定范圍內(nèi)隨刺激強(qiáng)度的增加對(duì)櫛孔扇貝呈現(xiàn)免疫活性的正調(diào)節(jié);但在高強(qiáng)度pH刺激下,免疫活性呈現(xiàn)出負(fù)調(diào)節(jié),這種調(diào)節(jié)可能與高強(qiáng)度刺激引起的免疫機(jī)能疲勞或損傷有關(guān).但Flexopectenglaber扇貝暴露于pH7.4的海水酸化環(huán)境中,其消化腺和鰓組織的CAT活性均高于對(duì)照組[25],厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)暴露于低pH(7.3)的海水酸化中時(shí),其鰓組織的SOD,CAT和GSH-Px活性均受到顯著誘導(dǎo)[26].上述研究結(jié)果表明,海水酸化對(duì)機(jī)體抗氧化酶的反應(yīng)是比較復(fù)雜的,具體的機(jī)理還需更加深入研究.MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一,正常生理狀態(tài)下,體內(nèi)的MDA濃度是極低的
21、,其濃度可間接反映機(jī)體的活性氧自由基和脂質(zhì)的過氧化水平,從而間接反映出細(xì)胞受損傷的程度,因此MDA被廣泛地作為指示生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的檢測(cè)指標(biāo)[27-28].研究表明,在有機(jī)磷農(nóng)藥的暴露下,沼水蛙蝌蚪的MDA濃度會(huì)隨著暴露濃度的增加而上升[29];磺胺類藥物暴露也會(huì)使羅非魚(Oreochromisniloticus)肝臟組織的MDA顯著提高[30].陶易凡等[31]研究發(fā)現(xiàn)pH脅迫克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)時(shí)其MDA濃度在肝胰腺中的積累量會(huì)顯著增加.本研究結(jié)果顯示,暴露于體積分?jǐn)?shù)1000μL/LCO2的脊尾白蝦MDA濃度先升后降且暴露14d時(shí)MDA濃度顯著增加;1900μL/LCO2時(shí)MDA濃度先增加后減少,7d和14d時(shí)MDA濃度均顯著高于對(duì)照組且在14d達(dá)到最大值;28d時(shí)其MDA濃度也略高于對(duì)照組.這可能是由于pH的脅迫會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基通過與生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而產(chǎn)生大量的MDA[17],而且隨著pH的進(jìn)一步降低,抗氧化酶SOD,CAT和GSH-Px活性明顯降低,使脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧堆積而導(dǎo)致MDA濃度不斷增加,導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的進(jìn)一步下降或受損。
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