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1．2 基因工程的基本操作程序,,專題1 基因工程,學習導航,,專題1 基因工程,一、基因工程的基本操作程序 目的基因的獲取 ↓ __________________的構(gòu)建 ↓ 將____________導入受體細胞 ↓ 目的基因的____________,基因表達載體,目的基因,檢測與鑒定,二、目的基因的獲取 1．目的基因：主要是指______________的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。 2．目的基因的獲取方法 (1)從基因文庫中獲取 ①基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入_____________中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。,編碼蛋白質(zhì),受體菌的群體,③提取依據(jù)：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物____________，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。 (2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因 ①PCR的含義：是一項在生物____________復制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 ②目的：短時間內(nèi)大量擴增目的基因。 ③原理：___________________。,基因組,mRNA,體外,DNA雙鏈復制,④過程： 第一步：加熱至90～95 ℃，____________； 第二步：冷卻至____________℃，引物結(jié)合到互補DNA鏈； 第三步：加熱至70～75 ℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)從引物起始進行互補鏈的合成。 如此重復循環(huán)多次。 ⑤特點：指數(shù)形式擴增。 (3)人工合成 如果目的基因較小，核苷酸序列又已知，可通過DNA合成儀用____________人工合成。,DNA解旋,55～60,化學方法,三、基因表達載體的構(gòu)建 1．構(gòu)建基因表達載體的目的： (1)使目的基因在_____________中穩(wěn)定存在，并且可以_____給下一代。 (2)使目的基因能夠_______和____________。,受體細胞,遺傳,表達,發(fā)揮作用,2．基因表達載體組成：,3．基因表達載體的功能：通過基因表達載體將____________導入受體細胞。 巧記 兩子啟動和終止； 目的基因在中間； 標記基因來篩選。,目的基因,四、將目的基因?qū)胧荏w細胞 1．轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)______________________的過程。 2．將目的基因?qū)胫参锛毎?(1)____________法:將目的基因?qū)腚p子葉植物和裸子植物。 (2)基因槍法：將目的基因?qū)雴巫尤~植物常用的方法。 (3)____________法：我國科學家獨創(chuàng)的一種方法。,維持穩(wěn)定和表達,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,花粉管通道,3．將目的基因?qū)雱游锛毎?(1)方法：____________。 (2)常用受體細胞：受精卵。,顯微注射法,4．將目的基因?qū)胛⑸锛毎?(1)方法： ①用__________處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為____________)。 ②感受態(tài)細胞吸收________________________。 (2)受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌細胞)。 (3)原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少等。,Ca2＋,感受態(tài)細胞,重組表達載體DNA分子,五、目的基因的檢測與鑒定 1．分子水平檢測 (1)檢測轉(zhuǎn)基因生物DNA上是否插入了目的基因。 方法：_______________技術(shù)。 (2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。 方法：____________雜交技術(shù)。 (3)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。 方法：____________雜交技術(shù)。 2．個體生物學水平鑒定：抗蟲、抗病、抗逆性狀的有無及程度。,DNA分子雜交,分子,抗原—抗體,1．判一判 (1)所有的目的基因都可從基因文庫中直接獲得。( ) (2)標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因的細胞篩選出來。( ) (3)目的基因?qū)腚p子葉植物一般采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。( ) (4)基因工程常用的受體細胞都是動植物的體細胞。( ) (5)基因工程是否成功需進行個體生物學水平上的鑒定。( ),√,×,×,√,√,2．連一連 將下列方法技術(shù)與其對應內(nèi)容連線,目的基因的獲取,1．基因文庫：基因組文庫和cDNA文庫 (1)基因文庫的含義(如圖所示),(2)cDNA文庫與基因組文庫的主要區(qū)別：,小,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,2．提取目的基因方法的比較,操作簡單,專一性強,可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因,專一性強,可產(chǎn)生自然界中不存在的新基因,工作量大、盲目性大、專一性差,操作過程較麻煩，技術(shù)要求過高,需要嚴格控制溫度、技術(shù)要求高,適用范圍小,3．PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復制的比較,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,場所,體外復制,主要在細胞核內(nèi),酶,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內(nèi)含有的DNA聚合酶,溫度條件,需控制溫度，在較高溫度下進行,細胞內(nèi)溫和條件,結(jié)果,在短時間內(nèi)形成大量的DNA片段,形成整個DNA分子,原理,DNA雙鏈復制(堿基互補配對),原料,四種游離的脫氧核苷酸,條件,模板、ATP、酶等,特別提醒 獲取目的基因需在受體細胞中表達 (1)真核細胞的基因編碼區(qū)含有不能表達的區(qū)域，因此不能直接用于基因的擴增和表達。獲得真核細胞中的目的基因時，一般用人工合成的方法。 (2)基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動子才比較有利于基因的表達。 (3)通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞中無法轉(zhuǎn)錄。,下列獲取目的基因的方法中需要模板的是( ) ①從基因文庫中獲取目的基因 ②利用PCR技術(shù)擴增目的基因 ③反轉(zhuǎn)錄法 ④通過DNA合成儀利用化學方法人工合成DNA A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ [解析] PCR技術(shù)利用的是DNA雙鏈復制原理。即將DNA雙鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為聚合反應的模板。反轉(zhuǎn)錄法是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，先反轉(zhuǎn)錄形成互補的單鏈DNA，再合成雙鏈DNA。①④則均不需要模板。,D,(2014·甘肅蘭州一中高二檢測)獲取目的基因的方法有多種，下列不屬于目的基因獲取方法的是( ) A．從基因組文庫中獲取 B．從cDNA文庫中獲取 C．直接從受體細胞中獲取目的基因 D．利用PCR技術(shù)獲取 解析：應該直接從供體細胞中獲取目的基因。,C,基因表達載體的構(gòu)建,2．構(gòu)建方法：,特別提醒 啟動子和終止子、起始密碼子與終止密碼子的區(qū)別 啟動子≠起始密碼(子)；終止子≠終止密碼(子)。 (1)啟動子和終止子都在DNA上，在遺傳信息轉(zhuǎn)錄時起作用。啟動子是啟動轉(zhuǎn)錄的開始，終止子是DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的一段DNA序列，其組成單位都是脫氧核苷酸。 (2)起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上三個相鄰堿基。起始密碼子決定翻譯的開始，終止密碼子決定翻譯的停止。,(2014·聊城高二檢測)下列關(guān)于基因表達載體的構(gòu)建描述錯誤的是( ) A．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心 B．基因表達載體的構(gòu)建包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分 C．目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因 D．構(gòu)建的基因表達載體都是相同的 [解析] 基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一個基因表達載體的組成除目的基因外還必須具有啟動子、終止子、標記基因等部分；目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因；由于受體細胞不同，基因表達載體的構(gòu)建也會有差別，不可能都是相同的。,D,由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，加上目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構(gòu)建也會有差別，不可能千篇一律。,(2014·安徽屯溪一中高二質(zhì)檢)人們常選用的細菌質(zhì)粒分子往往帶有一個抗生素抗性基因，該抗性基因的主要作用是 ( ) A．提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B．有利于對目的基因是否導入進行檢測 C．增加質(zhì)粒分子的分子量 D．便于與外源基因連接 解析：抗生素抗性基因為標記基因，便于對目的基因是否導入進行檢測。,B,1．目的基因?qū)胧荏w細胞的過程：,目的基因?qū)胧荏w細胞,2．不同受體細胞的常用導入方法,顯微注射法,Ca2＋處理法,體細胞,受精卵,原核細胞,目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA中→表達,目的基因表達載體提純→取卵 (受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物,Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子,特別提醒 目的基因能否穩(wěn)定遺傳的判斷 目的基因能否在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并表達的關(guān)鍵是目的基因是否插入到受體細胞染色體上的DNA分子中。圖中過程b與過程a相比，b會使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達，而a細胞分裂時，細胞質(zhì)是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。,(2014·山東濟南高二檢測)農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。如圖為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖，試回答下列問題：,(1)一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是____________，利用農(nóng)桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現(xiàn)________________________。具體原理是在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上存在T-DNA片段，它具有可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到受體細胞________________上的特點，因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入到____________________(部位)即可。,單子葉植物,目的基因?qū)胫参锛毎?染色體的DNA,T-DNA片段(內(nèi)部),(2)根據(jù)T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點，推測該DNA片段上可能含有控制________________________(酶)合成的基因。 (3)圖中c過程中，能促進農(nóng)桿菌向植物細胞轉(zhuǎn)移的物質(zhì)是________類化合物。 (4)植物基因工程中除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還可采取________________________。(至少寫出兩種),DNA連接酶、限制酶,酚,基因槍法、花粉管通道法,[解析] (1)一般農(nóng)桿菌不能感染的植物是單子葉植物，可感染雙子葉植物和裸子植物。利用其感染性，可實現(xiàn)目的基因?qū)胫参锛毎?。真正可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上的是農(nóng)桿菌T-DNA片段，因此目的基因必須插入到該部位才能成功。(2)根據(jù)T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點，可以推測該DNA片段能控制合成DNA連接酶、限制酶以實現(xiàn)與雙子葉植物細胞染色體DNA的整合。(3)植物細胞受傷后可產(chǎn)生酚類物質(zhì)，促進農(nóng)桿菌向植物細胞轉(zhuǎn)移。(4)植物基因工程中除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還有基因槍法和花粉管通道法等。,(1)能促進含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中的常用方法是什么？ (2)怎樣操作可促進單子葉植物受農(nóng)桿菌的感染？ 提示：(1)用Ca2＋(或CaCl2溶液)處理可增加農(nóng)桿菌細胞壁的通透性而達到促進含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中的目的。 (2)可在單子葉植物受損處加涂酚類物質(zhì)來吸引更多的農(nóng)桿菌感染。,下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞的描述不正確的是( ) A．基因槍法導入植物體細胞的方法比較經(jīng)濟有效 B．顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物中采用最多的方法 C.大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變 D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒?解析：不同生物目的基因?qū)氲姆椒ú煌糠N方法都有利有弊。目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，該方法比較經(jīng)濟有效，基因槍法成本較高；目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ秋@微注射法；大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法就是用鈣離子處理細胞，使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變,完成轉(zhuǎn)化過程。,A,目的基因的檢測與鑒定,目的基因是否進入受體細胞,DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間),目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA,分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間),目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì),抗原—抗體雜交技術(shù),是否成功顯示出雜交帶,包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同,特別提醒 在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時，所用的探針都是用放射性同位素等標記的含有目的基因的單鏈DNA片段。,回答有關(guān)基因工程的問題： (1)構(gòu)建基因工程表達載體時，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生________末端。若要在限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后使其直接進行連接，則應選擇能使二者產(chǎn)生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。,平,相同,(2)利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時，構(gòu)建的表達載體含有人胰島素基因及其啟動子等，其中啟動子的作用是_____________________________。在用表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時,常用____________處理大腸桿菌，以利于表達載體進入;為了檢測胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交,該雜交技術(shù)稱為 _______________。為了檢測胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成____________,常用抗原—抗體雜交技術(shù)。,RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,Ca2＋,分子雜交技術(shù),蛋白質(zhì),[解析] (1)限制酶切割產(chǎn)生兩種末端；黏性末端和平末端；若用DNA連接酶連接兩個末端，兩個末端必須是相同的。 (2)基因工程檢測的方法：檢測目的基因是否導入，使用DNA分子雜交技術(shù)；檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄，使用分子雜交技術(shù);檢測是否形成蛋白質(zhì)，使用抗原—抗體雜交技術(shù)。,(2014·陜西西安高二檢測)下列哪項表述說明了目的基因表達成功( ) A．用DNA探針檢測目的基因出現(xiàn)雜交帶 B．用DNA探針檢測mRNA出現(xiàn)雜交帶 C．用抗原—抗體雜交檢測蛋白質(zhì)出現(xiàn)雜交帶 D．以上都不能說明 解析：由于基因工程產(chǎn)生與天然產(chǎn)品的功能不一定相同，往往需要進行活性的比較，才能確定功能程度，最終說明目的基因是否表達成功。,D,