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1、中性蛋白復(fù)合酶法提取大棗多糖的研究 　　　　目的考察中性蛋白復(fù)合酶法提取大棗多糖的工藝，并驗證大棗多糖的部分藥理作用。方法對不同提取方法作對比；以多糖的得率和純度為指標(biāo)，對效果較佳的中性蛋白復(fù)合酶提法安排正交實驗，篩選提取工藝；最后進行動物實驗。結(jié)果確定中性蛋白復(fù)合酶法提取的最佳工藝為：酶液濃度0.15%，pH 7.5，提取溫度37℃；大棗多糖的藥理實驗表明大棗多糖屬無毒級，大棗多糖大、中、小劑量對S180小鼠巨噬細胞吞噬率均有不同程度的提高作用。結(jié)論中性蛋白復(fù)合酶法提取大棗多糖工藝有效可行。 大棗多糖； 中性蛋白復(fù)合酶 ； 提??； 藥理實驗 　　Abstrac

2、t：ObjectiveTo study theextraction technology for polysaccharide by compound neutral protease from Ziziphus jujuba, and to test the pharmacological function of the polysaccharide .MethodsDifferent methods of polysaccharide extraction were compared .As for the best method ,the compound neutral proteas

3、e extraction , the orthogonal experiments were established to hunt its technology. Finally, the pharmacological experiments were carried out. ResultsThe optimum conditions were to add 0.15% neutral protease on the pH of 7.5 with 37℃. The ultimate pharmacologic experiments about Zizyphus jujuba polys

4、accharide showed that it had no toxicity and it could elevate the macrophage phagocytosis of S180 tumor mice.ConclusionThe way of the compound neutral protease extraction is effective and reasonable . 　　Key words：Jujuba polysaccharide;Compound neutral protease ;Extraction;Pharmacology experiment　

5、　大棗為鼠李科植物棗Zizyphus jujuba Mill 的成熟果實［1］，營養(yǎng)豐富，是傳統(tǒng)的中藥，其主要成分有多糖，蛋白質(zhì)，氨基酸，維生素，生物堿，皂苷及礦物質(zhì)等［2］。多糖能提高機體的免疫功能，是理想的免疫增強劑，同時對正常細胞沒有毒副作用［3］。從大棗中提取多糖及其藥理作用研究已有文獻報道［4，5］?！　鹘y(tǒng)高溫水提法易造成大棗多糖的生物活性降低，而且能耗大；溶劑萃取法則存在溶劑使用成本高，回收困難及產(chǎn)品溶劑殘留等問題。大多數(shù)含有豐富多糖的植物，細胞粗大且壁厚，使得多糖難以從細胞中擴散出來，采用復(fù)合酶協(xié)同作用于植物提取過程，可以促進多糖的溶出，過程條件溫和，目標(biāo)產(chǎn)物活性高，極大地提高

6、多糖的提取率以及純度［6］?！　〈髼椫械牡鞍踪|(zhì)對大棗多糖的提取分離造成一定的影響，大棗多糖普遍存在于原生質(zhì)中，而原生質(zhì)又處于細胞壁和細胞間質(zhì)的包裹下，鑒于這些特點，若選用含有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的復(fù)合酶液來參與反應(yīng)，就可以減少傳質(zhì)阻力，提高有效成分的提取率。 　　1器材與方法 　　1.1材料大棗購于陜北延安市場，選用質(zhì)地優(yōu)良的干品粉碎。 　　1.2試劑 中性蛋白復(fù)合酶液，酶活2 500 ug-1，酶液中含有少量纖維素酶、淀粉酶，由寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司提供。 　　1.3儀器DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪予華儀器廠；LD4-2低速離心機：北京低速

7、離心機廠；722型可見光分光光度計：上海第三分析儀器廠；HI 98107 酸堿度測試筆：美國哈納儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器：上海嘉鵬科技公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。 　　1.4分析方法多糖檢測方法為苯酚硫酸法；數(shù)據(jù)處理法為加權(quán)平均法。 　　2結(jié)果 　　2.1不同提取方法的對比因為不同溶劑對大棗實體及其多糖的作用不同，所以用不同溶劑進行提取具有不同的結(jié)果。定量稱取烘干棗粉20 g,采用添加總質(zhì)量濃度1%果膠酶復(fù)合液（pH為7），纖維素復(fù)合酶液（pH為7），中性蛋白復(fù)合酶液（pH為7），40℃下提取2 h，共進行兩次提取，并以傳統(tǒng)水提法

8、為參照，確立最佳提取方法，結(jié)果見表1。 　　表1不同提取液的提取結(jié)果（略） 　　由提取結(jié)果可看出，果膠復(fù)合酶，纖維素復(fù)合酶參與提取與傳統(tǒng)水提相比效果不是很顯著，果膠酶得到較好的得率，但純度反而下降，就是因為果膠酶在水解大棗中果膠質(zhì)的同時又進而水解掉一部分多糖。而纖維素酶則在水解大棗纖維素使其結(jié)構(gòu)變得松散的同時又直接將大棗中的糖蛋白和蛋白聚糖水解掉，直接導(dǎo)致得率下降。因此在大棗多糖提取中主要應(yīng)用以上兩種酶時并不能達到預(yù)期效果。中性蛋白復(fù)合酶參與提取效果顯著，主要是因為中性蛋白酶對大棗中的游離蛋白質(zhì)具有水解作用，且目標(biāo)性強。鑒于上結(jié)果，本研究采用中性蛋白復(fù)合酶作為大棗多糖的提取劑。 　　2.2中性蛋白復(fù)合酶最佳提取條件正交實驗稱取烘干棗粉20 g共9份，按正交設(shè)計表條件進行提取，提取液濃縮1∶3，體積分?jǐn)?shù)80%醇沉，低溫滅酶后，二次單純采用去離子水提取2h，得多糖用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，真空干燥。利用正交實驗對酶添加量、pH、溫度等因素進行考察。實驗因素水平見表2，最佳提取條件正交實驗結(jié)果見表3。由極差結(jié)果得，3個因素對大棗多糖中性蛋白復(fù)合酶法提取的影響順序為：B＞C＞A，由實驗結(jié)果確立主要影響因素參數(shù)為B3C2A3，即最佳提取條件為：中性蛋白酶對底物質(zhì)量濃度0.15%，加酶溫度37℃，反應(yīng)pH值7.5。