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1、第十一章 DNA的復(fù)制 第一節(jié) 半保留復(fù)制的驗(yàn)證 半保留模型 （ semioconservetive model） 全保留復(fù)制模型 (conservetive model) 分散模型 (Dispersive model)。 半保留復(fù) 全保留復(fù) 分散模型 制模型 制模型 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 第一次復(fù)制 1 4 N 15 N 15 N 14 N 15 N 15 N 14 N 14 N 14 N 14 N 15 N 15 N 15 N 15 N 14 N 14 N 第二次復(fù)制 圖 1 1 - 1 三種不同的復(fù)制模型 驗(yàn)證半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn) 一、 Meselson

2、-Stahl實(shí)驗(yàn) 二、 Taylar實(shí)驗(yàn) 三、 姐妹染色單體差別染色方法 （ sister- chromatid differential staining） 5溴脫氧尿嘧啶（ 5-Bromodeoxy uridine， 簡稱 BUdR） 斑色染色體 （ Harlequin chromosome） 四、 Cairns復(fù)制模型 型復(fù)制 15 N 15 N 14 N 14 N/ 15 N 1 5 N D N A 濃度 14 N 14 N/ 15 N 1 5 N 離心 第 1 4 N 一 14 N 15 N 14 N 15 N 次 離心 實(shí) 驗(yàn) 14 N 15 N 14 N 14 N 14 N 14

3、 N 14 N 15 N 離心 第 離心 二 次 實(shí) 驗(yàn) 14 N 15 N 離心 密 度 ( a ) ( b ) ( c ) 圖 1 1- 2 M e s el s o n- St ah l 實(shí)驗(yàn) ( a) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋 ( b) Ss C l 梯度離心的結(jié)果； ( c ) 離心后 DNA 的吸受率 圖 11-4 Taylor 蠶豆根尖放射自顯影實(shí)驗(yàn)。 (a)按半保留復(fù)制預(yù)期 DNA在復(fù)制過程中標(biāo)記情況； (b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。 (a ) 2 H 3 H 2 H 2 H (b) 2 H 3 H 2 H 2 H T/ T 第一周期 M 1 T/BUdR BUdR/T 第二周期

4、 M 2 B U d R 第三周期 M 3 第四周期 M 4 圖 11 - 5 姊妹染色單體差別染色的原理和結(jié)果 3 H + C E D 1 . 5 代 B A 放射自顯影 圖 1 1 - 7 C a i r n s 實(shí)驗(yàn)原理及過程 第二節(jié) 復(fù)制的起點(diǎn)、方向和終點(diǎn) 一 . 研究方法： 1. 用同位素標(biāo)記電鏡觀察及變性法 2. 用噬菌體插入標(biāo)記法 同步培養(yǎng) 不同步培養(yǎng) 3. 變性定性法 （ denaturation mapping） 4. 雙向電泳法 O r i t / O r i t (a) ( b) 圖 11 8 ( a ) 若有固定起始點(diǎn)，雙向負(fù)制， 則復(fù)制終點(diǎn)應(yīng)在起點(diǎn)的對面。 ( b )

5、 若有固 定起始點(diǎn) , 單向復(fù)制 ，則復(fù)制終點(diǎn)應(yīng)和 起點(diǎn)重疊。 圖例：未標(biāo)記 ，輕標(biāo)記 ， 重標(biāo)記 圖 1 1 - 1 0 用同位素標(biāo)記復(fù)制叉來確定是單向復(fù)制還是雙向復(fù)制 圖 11-11不同步培養(yǎng)時各標(biāo)記的拷貝數(shù)不同 復(fù)制起點(diǎn)標(biāo)記的拷貝數(shù)應(yīng)最多 1 2 3 4 1 2 3 1 2 1 R R 0 1 2 3 第一組中性瓊脂糖電泳 + 第二組堿性瓊脂糖電泳 + ( b) ( a ) ( c) 探針 1 雜交 探針 2 雜交 探針 3 雜交 圖 1 2 - 1 3 雙向電泳定位法 二、原核的復(fù)制起點(diǎn)和方向 E.coli定點(diǎn) 、 雙向?qū)ΨQ復(fù)制 。 T7在近一端的 17 處開始 ， 向兩端延伸 。 枯

6、草桿菌有固定的起始點(diǎn) ， 雙向不對稱復(fù)制 。 質(zhì)粒 R6K早期為單向復(fù)制 ， 復(fù)制了約 1/5基因組 進(jìn)行時雙向復(fù)制 。 質(zhì)粒 Col E1有固定起始點(diǎn) ， 但卻為單向復(fù)制 。 mt DNA進(jìn)行 D（ displaced loop） 環(huán)復(fù)制 真核有多個復(fù)制起點(diǎn) （ i） ， 雙向等速復(fù)制 。 O ri O ri O ri (a) 枯草桿菌 (b ) R 6 K 質(zhì)粒 ( c ) Co l E 1 圖 1 1 -1 4 原核生物中特殊的復(fù)制類型 D環(huán)復(fù)制 第三節(jié) DNA復(fù)制突變型的篩選 一. 根據(jù)溫度敏感性篩選 二. 同位素標(biāo)記法篩選 三. 5溴尿嘧啶摻入法 四. 質(zhì)粒溫度敏感性的篩選 五. 根

7、據(jù)抗藥性篩選 六. 根據(jù)與突變有關(guān)的生物學(xué)功能篩選 七. 快停突變與慢停突變 第四節(jié) 原核生物復(fù)制的酶系統(tǒng) 一. DNA合成酶 DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是： （ 1） 需要提供合成模板； （ 2） 不能起始新的 DNA鏈 ， 必須要有引 物提供 3 OH； （ 3） 合成的方向都是 5 3 （ 4） 除聚合 DNA外還有其它功能 。 表 11-1 E.coli 中的三種 DNA多聚酶 DNApol DNApol DNA pol 結(jié) 構(gòu) 分子量 109 KD 90 KD 900 KD 構(gòu)成 單體 單體 異多聚體 分子數(shù) /細(xì)胞 400 ？ 10-20 酶 活 性： 5 3聚合酶 + + + 3 5

8、外切酶 + + + 5 3外切酶 + (可切單鏈 ) 突 變 體 突變位點(diǎn) pol A pol B polC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT 突變表型 修復(fù)有缺陷 能修復(fù) 阻止復(fù)制 (一 ). DNA聚合酶 I的結(jié)構(gòu) DNA聚合酶有 6個結(jié)合位點(diǎn)： (1) 模板結(jié)合位點(diǎn)； (2) 引物結(jié)合位點(diǎn)； (3) 引物 3 OH結(jié)合位點(diǎn)； (4) 底物 dNTP結(jié)合位點(diǎn)； (5) 53 外切酶結(jié)合位點(diǎn)； (6) 35 校正位點(diǎn)。 聚合 3 5 外切 5 3 外切 3 5 dN TP N M P 5 3 圖 11-19 DN A 聚 合 酶的 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 (二 ).

9、DNA聚合酶 的功能 1. 5 3聚合功能 2. 3 5外切活性 3. 5 3外切活性 (1)切口平移 （ nick translation） ； (2)鏈的置換 ； (3)模板轉(zhuǎn)換 （ template-switching） 4. 內(nèi)切酶活性 5 3 G T A A G T C G C T C A G C 5 3 3 5 外切 核 酸酶水解部位 圖 1 1 - 2 0 D N A 聚合酶的 3 5 外切酶活性 ( 仿 D . Fre i f el d e r : M O L E C U L A R B I O L O G Y 1 9 8 3 , F i g . 8 - 1 6 ) 3 5 G

10、 G A C A A G A G A C G T T C T 5 3 內(nèi)切酸酶水解部位 圖 1 1 -2 2 D N A 聚合酶的內(nèi)切酸活性 ( 仿 D . Fre i f el d e r : M O L E C U L A R B I O L O G Y 1 9 8 3 , F i g . 8 - 2 0 ) 5 3 - O H 5 - P 3 5 3 3 5 缺口平移 鏈的置換 模板轉(zhuǎn)換 5 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 3 5 ( a ) ( b ) ( c ) 圖 1 2 - 2 1 D N A 聚合酶 5 3 外切活性的功能 (三 )DNA多聚酶 的結(jié)構(gòu) P o l *

11、核心酶 ： 1 3 0 K ( p o l C 即 d n a E) D N A 合成 ( 4 7 0 K ) ( 1 6 5 K ) ： 2 5 K ( dna ) 3 5 外切酶活性 , 校對 2 核心 2 合成 D N A ： 10K 使核心酶相互連接。 Pol 增加進(jìn)行性 ( 7 5 0 K ) ： 7 1 K ( d n a Z X ) 使核心酶形成二聚體，與模板連接。具有 全酶 使 復(fù) ATP 活性。 合成前 合體結(jié)合 導(dǎo) 鏈和 模板 ： 3 2 K E F , 催化 亞基轉(zhuǎn)移到模板鏈上。 E F 后滯鏈 復(fù)合體 ： 5 2 K ( d n a Z X ) 催化 亞基轉(zhuǎn)移到模板鏈上

12、。 ( 附加亞基 ) ： 35K ： 1 5 K ： 12K ： 4 0 K ( d n a N ) 識別模板鏈，將酶 “夾”到 D N A 鏈上。 圖 1 1 - 2 3 D N A 聚合酶 的成分與功能 全酶在 DNA上的裝配分為三個階段： （ 1） 一個 二聚體加上一個 復(fù)合體識別引 物模板形成一種 前起始復(fù)合物 。 （ 2） DNA在于 ,復(fù)合體結(jié)合的位點(diǎn)構(gòu)象 發(fā)生改變 ， 而對核心酶產(chǎn)生了高親和 。 使核心酶能與 DNA結(jié)合 。 （ 3） 二聚體結(jié)合核心聚合酶 ， 使其二聚化 。 二 . DNA連接酶 其作用機(jī)制是分三步進(jìn)行： 1、 E ATPE AMP ppi 在 E.coli中

13、， E NADE AMP NMN（ 煙酰胺單核苷酸 ） 2、 E-AMP上的 AMP轉(zhuǎn)移到 DNA的 5-PO4上使其活 化 3、 活化的 5 PO4與相鄰的 3 OH作用形成 3 5 磷酸二酯鍵 ， 并釋放出 AMP。 三 . 單鏈結(jié)合蛋白 又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（ helix destabilizing protein） 由 177個 aa組成 在 E.coli 中以四聚存在 分子量為 74KDa 在原核中 SSB與 DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。 （ 1） SSB之間的相互作用； （ 2） 第一個 SSB和 DNA的結(jié)合改變了 DNA的結(jié)構(gòu) 。 四 .解旋酶 (helicase) 表 1 1

14、 - 3 E . c o l i 及噬菌體的解旋酶 解 旋 酶 結(jié) 構(gòu) 功 能 D n a B 3 3 0 K 六聚體 結(jié)合與 O r i C , O r i 參與前引發(fā)分 離雙鏈，水解 ATP , 提供能量。 rep 蛋白 66 K 單體 ATP 依賴性解旋酶，在 X 1 7 4 滾環(huán) 復(fù)制中推進(jìn)復(fù)制叉 P r i A ( w 蛋白 ) 82 K 單體 X 1 7 4 R f 形成中參與前引發(fā)體 3 5 移動取代 S S B ，識別特異位點(diǎn)。 T r a Y / I 多聚體 F 因子滾環(huán)復(fù)制中解鏈。 基因 4 蛋白 58 K T7 噬菌體復(fù)制中延 5 3 解 鏈。 第五節(jié)原核生物，噬菌體和病

15、毒的復(fù)制起 始和終止 一 .環(huán)狀 DNA的復(fù)制 GATCTNTTNTTT TCTGGATA A T TtGG A TAA R 1 R 3 L M R 1 2 3 4 2 3 6 2 8 0 8 8 1 8 6 1 9 4 2 3 1 2 3 9 2 6 0 2 6 8 R 2 R 4 A A T A t G T G A A A T A G G T G T 1 3 聚體 9 聚體 2 4 5 b p 圖 1 1 - 2 7 E . c o l i 復(fù)制 起點(diǎn) O r i C 的結(jié)構(gòu) 復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是： （ 1） 富含 A T， 這可能和雙鏈易于解開起始 復(fù)制有關(guān)； （ 2） 含有多個回文結(jié)

16、構(gòu) （ 9 14個 GATC） 8個 GATC較保守 ,CATC中的 “ A”已甲基化 ; （ 3） 具有 4個反向重復(fù)順序 ， 作為蛋白結(jié)合 位點(diǎn)； （ 4） 此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個起動子 ， 其可能的作用是： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物； 產(chǎn)生復(fù) 制必要的蛋白； 產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的 RNA； 起 轉(zhuǎn)錄激活作用 。 復(fù)制起點(diǎn)具有 3 個 1 3 b p 和 4 個 9 b p 的重復(fù)順序 G A T CT N T T N T T T T T T A T N CA N A D n a A 單體結(jié)合在 9 b p 的重復(fù)順序上 1 3 b p 9 b p 20 40 個 D n a A 單體形成一個大的復(fù)合物

17、 在 1 3 b p 重復(fù)順序上 D N A 解鏈 D n a B / D n a C 結(jié)合成復(fù)合體，產(chǎn)生了復(fù)制叉 D n a B D n a B D n a C 圖 1 1 -2 8 前引發(fā)涉及到系列蛋白的連續(xù)裝配并導(dǎo)致 D N A 的解鏈 ( 引自 B. L ew i n : G E N E S , 1 9 9 7 ， Fi g 1 5 . 1 8 ) 表 1 1 - 4 在 O r i C 上前引發(fā)所需的六種蛋白 蛋白 功能 對蛋白質(zhì)的要求 D n a A ( S ) 協(xié)同結(jié)合于 9 bp 和 13 bp 重 復(fù)順序 2 0 - 4 0 單體 D n a B ( F , S ) 結(jié)合于

18、D n a A ，提供解旋酶 活性 1-2 六聚體 D n a C ( F , S ) 和 D n a B 形成復(fù)合體 六個單體 HU 組蛋白樣蛋白，激發(fā)復(fù)合 體形成 5 個雙體 G y r a s e 旋轉(zhuǎn)酶，解除正超螺旋， 引入負(fù)超螺旋 催化 s s B ( F ) 穩(wěn)定單鏈 化學(xué)劑量，四聚體 ( S ) : 慢停突變； （ F ）：快停突變 P R /O R O ri c r o c o p 右向轉(zhuǎn)錄 復(fù)制起 啟動子 始區(qū) 圖 1 1 - 3 1 噬菌體右向轉(zhuǎn)錄啟動子對復(fù)制起始的激活 是必須的 ( 仿 B . L ew i n : G E N E S , 1 9 9 7 ， Fi g 1

19、 9 . 1 8 ) 表 1 1 - 5 在 O r i C 和 O r i 上起始涉及相同的反應(yīng) 階段 O r i C Ori Ori 的識別與解鏈 D n a A O D n a B D n a B D n a C P 解旋酶的結(jié)合與解鏈 R N A p o l R N A p o l D n a J ? D n a J ?釋放復(fù)合體 D n a K ? D n a K G y r a s e ?復(fù)制叉的移動 SSB ? 引發(fā) D n a G D n a G 摘自 G e n e V ， 1 9 9 4 ， B . L e w i n . T a b l e 1 9 . 6 表 1 1 - 6 1 7 4 的復(fù)制周期 階段 時間 （分） 行為 SS RF 0 1 吸附和穿透。病毒單鏈經(jīng)復(fù)制 成復(fù)制形 （ RF1 ）， R F 1 轉(zhuǎn)錄。 RF SS 1 20 25 親代 RF 經(jīng)復(fù)制產(chǎn)生 60 個子代 RF ， RF 和宿主 D N A 的半保留復(fù) 制停止。 RF SS 20 33 40 子代 RF 形成 35 個滾環(huán)，復(fù)制 出 500 個 ss 分子，包裝入噬菌 體顆粒，細(xì)菌裂解。