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1、分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 核 酸 擴 增 技 術溫 州 醫(yī) 學 院檢 驗 醫(yī) 學 院 、 生 命 科 學 學 院 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 主 要 內 容第 一 節(jié) 聚 合 酶 鏈 反 應 技 術第 二 節(jié) 熒 光 定 量 PCR技 術第 三 節(jié) 其 他 核 酸 擴 增 技 術第 四 節(jié) 臨 床 基 因 擴 增 實 驗 室 的 管 理 與 質 量 控

2、 制 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 第 一 節(jié) 聚 合 酶 鏈 反 應 技 術 polymerase chain reaction, PCR一 、 PCR技 術 發(fā) 展 簡 史二 、 PCR技 術 原 理三 、 PCR反 應 體 系 、 條 件 及 其 優(yōu) 化四 、 擴 增 產 物 檢 測 及 分 析五 、 PCR常 見 問 題 與 原 因 分 析六 、 PCR衍 生 技 術 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine,

3、 Wenzhou Medical College PCR技 術 發(fā) 展 簡 史 Korana于 1971年 最 早 提 出 核 酸體 外 擴 增 的 設 想 。 1985年 Mullis等 發(fā) 明 了 具 有 劃時 代 意 義 的 聚 合 酶 鏈 反 應 ， 使用 的 DNA聚 合 酶 是 Klenow片 段 。 (1993年諾貝爾化學獎獲得者) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR技 術 發(fā) 展 簡 史 1988年 初 ， Keohanog改 用 T4 DNA聚 合 酶 進

4、 行 PCR。 1988年 Saiki 發(fā) 現(xiàn) Taq DNA聚 合 酶 ， 從 此 PCR技 術 得以 廣 泛 應 用 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 基本原理 N= N0(1+E)c 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR反 應 體 系 、 條 件 及 其 優(yōu) 化 PCR反 應 體 系 模 板 （ template） 引 物 （ primers） DNA

5、 聚 合 酶 (DNA polymerase) dNTP PCR緩 沖 液 （ PCR buffer） PCR反 應 條 件 變 性 退 火 延 伸 循 環(huán) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College DNA RNA： 總 RNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 病 毒 RNA 基 因 組 DNA質 粒 DNA模 板 （ template ） 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical Coll

6、ege 引 物 （ primers) 引 物 是 人 工 合 成 的 兩 段寡 核 苷 酸 序 列 ， 一 個 引物 與 感 興 趣 區(qū) 域 一 端 的一 條 DNA模 板 鏈 互 補 ，另 一 個 引 物 與 感 興 趣 區(qū)域 另 一 端 的 另 一 條 DNA模 板 鏈 互 補 。 3 355 Sense primer Antisense primer 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 的 重 要 性 在 整 個 PCR體 系 中 , 引 物 占 有 十 分 重 要

7、的地 位 。 PCR的 特 異 性 要 求 引 物 與 靶 DNA特 異 結 合 ， 不 與 其 他 非 目 的 DNA結 合 ，PCR的 靈 敏 性 要 求 DNA聚 合 酶 能 對 引 物進 行 有 效 的 延 伸 ， 可 見 引 物 設 計 好 壞 與PCR結 果 密 切 相 關 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 設 計 總 原 則 引 物 與 模 板 的 序 列 要 緊 密 互 補 引 物 與 引 物 之 間 避 免 形 成 穩(wěn) 定 的 二 聚 體 或發(fā) 夾

8、結 構 引 物 不 能 在 模 板 的 非 目 的 位 點 引 發(fā) DNA 聚合 反 應 (即 錯 配 )。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 設 計 一 般 原 則 引 物 長 度 堿 基 分 布 的 均 衡 性 Tm值 引 物 二 級 結 構 引 物 3端 引 物 5端 引 物 的 內 部 穩(wěn) 定 性 引 物 的 保 守 性 與 特 異 性 擴 增 區(qū) 域 的 二 級 結 構 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medic

9、ine, Wenzhou Medical College 引 物 長 度 一 般 為 15-30個 核 苷 酸 ， 常 用 的 是 18-24 bp。 在 做 長 片 段 PCR或 做 某 些 特 殊 的 PCR時 應 使 用 較 長 的 引 物 ， 但 最 多 不 超 過 50個 核 苷 酸 。 引 物 過 短 會 引 起 錯 配 現(xiàn) 象 ， 一 般 來 說 引 物 長 度 大 于 16bp是 必要 的 （ 不 容 易 引 起 錯 配 ） 。 例 如 ： 一 個 長 度 為 12bp的 引 物 在人 類 基 因 組 上 存 在 200個 潛 在 的 退 火 位 點 (3 x 109/412=

10、200 ).而一 個 長 度 為 20bp的 引 物 在 人 基 因 組 上 存 在 的 退 火 位 點 只 有1/400個 . 較 長 的 引 物 （ 28-35bp)一 般 是 用 來 區(qū) 分 同 源 性 較 高 的 模 板 序列 或 者 使 用 于 產 生 一 些 突 變 位 點 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 堿 基 分 布 的 均 衡 性 GC含 量 一 般 40-60%， 推 薦 45-55%或 50-60%。上 下 游 引 物 的 GC含 量 不 能 相 差 太

11、大 。 GC含 量 太 低 導 致 引 物 Tm值 較 低 ， 使 用 較 低 的 退 火溫 度 不 利 于 提 高 PCR的 特 異 性 GC含 量 太 高 也 易 于 引 發(fā) 非 特 異 擴 增 。 同 一 堿 基 連 續(xù) 出 現(xiàn) 不 應 超 過 5個 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 Tm值 一 般 要 求 ： 55 -65 。 計 算 ： 對 于 低 于 20個 堿 基 的 引 物 ， Tm值 可 根 據Tm=4(G+C)+2(A+T)來 粗 略 估 算 對 于

12、較 長 引 物 ， Tm值 則 需 要 考 慮 熱 動 力 學參 數 ， 從 “ 最 近 鄰 位 ” 的 計 算 方 式 得 到 ， 這也 是 現(xiàn) 有 的 引 物 設 計 軟 件 最 常 用 的 計 算 方 式 。 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 二 級 結 構 引 物 二 聚 體 盡 可 能 避 免 兩 個 引 物 分 子 之 間 3端 有 有

13、 較 多堿 基 互 補 發(fā) 夾 結 構 尤 其 是 要 避 免 引 物 3端 形 成 發(fā) 夾 結 構 ， 否 則將 嚴 重 影 響 DNA聚 合 酶 的 延 伸 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 3端 引 物 的 延 伸 從 3端 開 始 ， 因 此 3端 的 幾 個 堿 基 與 模 板 DNA均 需嚴 格 配 對 ， 不 能 進 行 任 何 修 飾 ， 否 則 不 能 進 行 有 效 的 延 伸 ，甚 至 導 致 PCR擴 增 完 全 失 敗 。 考 慮 到 密 碼

14、 子 的 簡 并 性 ， 引 物 3端 最 后 一 個 堿 基 最 好 不 與 密 碼 子 第 三 個 堿 基 配 對 。 引 物 3端不 要 出 現(xiàn) 3 個 以 上 的 連 續(xù) 堿 基 ， 如 GGG 或 CCC， 否 則 會 使 錯誤 引 發(fā) 機 率 增 加 。 引 物 3端 的 末 位 堿 基 對 Taq 酶 的 DNA合 成 效 率 有 較 大 的 影 響 。不 同 的 末 位 堿 基 在 錯 配 位 置 導 致 不 同 的 擴 增 效 率 ， 末 位 堿 基為 A 的 錯 配 效 率 明 顯 高 于 其 他 3 個 堿 基 ， 因 此 應 當 避 免 在 引 物的 3端 使 用 堿

15、基 A。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 5端 引 物 5端 可 以 有 與 模 板 DNA不 配 對 堿 基 ，在 5端 引 入 一 段 非 模 板 依 賴 性 序 列 。 5端 加 上 限 制 性 核 酸 內 切 酶 位 點 序 列 （ 酶 切 位點 5端 加 上 適 當 數 量 的 保 護 堿 基 ） 。 5端 的 某 一 位 點 修 改 某 個 堿 基 ， 人 為 地 在 產 物中 引 入 該 位 點 的 點 突 變 以 作 研 究 。 5端 標 記 放 射 性

16、 元 素 或 非 放 射 性 物 質 （ 如 生 物素 、 地 高 辛 等 ） 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 的 保 守 性 與 特 異 性 保 守 性 ： 通 用 引 物 檢 測 同 一 類 病 原 微 生物 盡 可 能 多 的 型 別 特 異 性 ： 避 免 非 特 異 性 擴 增 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 擴 增 區(qū) 域 的 二 級 結

17、 構 模 板 DNA的 某 些 區(qū) 域 具 有 高 度 復 雜 的 二 級 結 構 ， 在選 擇 引 物 時 ， 應 使 擴 增 區(qū) 域 盡 可 能 避 開 這 些 區(qū) 域 。 擴 增 區(qū) 域 的 自 由 能 （ G。 ） 小 于 58.61kJ/mol 引 物 Tm值 與 PCR產 物 Tm值 相 差 一 般 不 超 過 30 Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length (primer premier 5.0) l Tm product = 81.5 + 16.6(log10(Na+) +

18、0.41 (%G + %C) - 600/length (primer 3) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 與 PCR 引 物 濃 度 ： 一 般 為 0.1-0.5umol/L 引 物 濃 度 (uM)=n OD 33/（ A 312 C 288G 328 T 303-61） /VH2O VH2O (單 位 ： L) 退 火 溫 度 最 適 退 火 溫 度 （ Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 2

19、5 一 般 采 用 較 引 物 Tm值 低 5 作 為 PCR退 火 溫 度 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 設 計 軟 件 Primer Premier 5.0 Oligo Primer express primer 3 MethPrimer 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College DNA 聚 合 酶 (DNA polymerase) 特 性 ： 熱 穩(wěn)

20、定 性 :92.5 、 95 、 97.5 時 ， 半 衰 期 分 別 為130min、 40min、 5-6min 延 伸 效 率 :75-80 時 ， 150個 核 苷 酸 /s 校 正 功 能 :Taq DNA聚 合 酶 沒 有 3-5外 切 酶 活性 ， Vent 、 pfu等 具 有 3-5外 切 酶 活 性 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College dNTP dNTP： 包 括 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP。 量 ： 20-200umol/L dNTP會 絡

21、合 Mg2+， 當 PCR需 要 較 高 濃 度 的 dNTP時 ，應 在 反 應 體 系 中 適 當 增 加 Mg2+濃 度 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR緩 沖 液 （ PCR buffer） 一 般 組 成 ： 50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室 溫PH8.3) ， 1.5mM MgCl2 Mg2+濃 度 ： 附 加 成 分 ： 牛 血 清 白 蛋 白 、 明 膠 、 非 離 子 去 污劑 （ 如 Tween20， 濃 度 0.05%） 二

22、 甲 亞 砜（ DMSO） 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR一 般 方 案 反 應 組 成 50 ul PCR反 應 體 系 的 組 成 ： 樣 品 DNA 0.11ug； 正 、 負 鏈 引 物 （ 25umol/L） 各 1.0ul； 脫 氧 核 苷 三 磷 酸 （ dNTP各 2.5mmol/L） 4.0ul 10 PCR緩 沖 液 5.0ul ； MgCl2（ 25mmol/L） 3.0ul ； Taq DNA聚 合 酶 12.5u ； 蒸 餾 的 去 離 子 水

23、 補 至 50ul， 短 暫 離 心 混 勻 。 陽 性 對 照 、 空 白 對 照 分 別 以 陽 性 模 板 DNA、 蒸 餾 的 去 離 子 水 取 代 樣 品 DNA。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 94 , 300S 94 , 60S 30 55 , 60S 72 , 60S 72 , 5-10min PCR一 般 方 案 熱 循 環(huán) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical

24、 College PCR反 應 體 系 、 條 件 的 優(yōu) 化 三 磷 酸 脫 氧 核 苷 酸 耐 熱 DNA聚 合 酶 緩 沖 液 模 板 核 酸 引 物 Mg2+ 變 性 溫 度 與 時 間 復 性 溫 度 與 時 間 延 伸 溫 度 與 時 間 循 環(huán) 數 和 擴 增 效 率 降 落 PCR (Touchdown PCR) 熱 啟 動 PCR（ hot start PCR） 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 降 落 PCR(Touchdown PCR) 根 據 引 物 Tm

25、值 ， 選 定 一 個 退 火 溫 度 范 圍 （ 跨 越 10-20 的 溫 度 范圍 ， 引 物 Tm值 在 這 個 范 圍 之 內 ） 。 在 設 置 循 環(huán) 參 數 時 ， 讓 退 火溫 度 從 選 定 范 圍 的 最 高 溫 度 開 始 ， 逐 步 降 低 退 火 溫 度 （ 每 次 降 低1-5 ） ， 最 后 結 束 在 選 定 范 圍 的 最 低 溫 度 。 在 每 一 個 退 火 溫 度上 循 環(huán) 2-5次 。 舉 例 ： 如 果 一 對 引 物 的 Tm值 為 60 ， 可 設 置 退 火 溫 度 從 63 降低 到 48 ， 每 次 降 低 1 ， 每 個 退 火 溫 度

26、 循 環(huán) 兩 個 周 期 ， 最 后 在48 退 火 溫 度 下 做 15個 循 環(huán) 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 熱 啟 動 PCR（ hot start PCR） PCR反 應 體 系 中 先 不 加 Taq DNA聚 合 酶 ， 等 PCR擴 增 儀 的 溫 度 上升 到 80 以 后 再 加 Taq DNA聚 合 酶 。 將 石 蠟 珠 在 Ependorf管 中 PCR反 應 液 上 面 融 化 并 凝 固 ， 在 石 蠟 層上 面 加 上 Taq DNA聚 合

27、 酶 。 在 溫 度 上 升 到 變 性 溫 度 時 ， 石 蠟 融 化 ，Taq DNA聚 合 酶 進 入 反 應 體 系 ， 通 過 對 流 作 用 而 混 勻 。 在 PCR反 應 液 中 加 入 Taq DNA聚 合 酶 的 單 克 隆 抗 體 ， 再 加 入 Taq DNA聚 合 酶 ， 在 溫 度 上 升 到 將 此 抗 體 變 性 滅 活 前 ， 抗 體 中 和 Taq DNA聚 合 酶 活 性 ， Taq DNA聚 合 酶 對 引 物 無 法 進 行 延 伸 。 待 溫度 上 升 到 足 夠 高 時 ， 抗 體 失 活 ， 擴 增 反 應 開 始 。 分子生物學檢驗技術模塊8

28、核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 擴 增 產 物 的 檢 測 及 分 析 凝 膠 電 泳 ： 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 法 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 法 PCR-限 制 性 片 段 長 度 多 態(tài) 性 分 析 法 （ PCR-RFLP） 單 鏈 構 型 多 態(tài) 性 分 析 法 （ PCR-SSCP） 核 酸 探 針 雜 交 法 PCR產 物 測 序 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical Colleg

29、e 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 制 膠 加 樣 電 泳 紫 外 光 檢 測 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 特 點 ： 分 辨 力 高 ， 長 度 僅 相 差 1bp的 DNA分 子 即 可分 開 ； 上 樣 量 遠 大 于 瓊 脂 糖 凝 膠 ； 回 收 的 DNA純 度 高 ； 采 用 銀 染 色 DNA或 RNA， 靈 敏 度 高 ， 比 瓊 脂糖 凝 膠 電 泳 中 EB染 色 法 高 2-5倍 ， 而 且 避 免EB易 退 色 的 弱 點 。 用 途 ： PCR擴 增

30、 指 紋 圖 、 多 重 PCR。聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 據 目 的 基 因 序 列 可 查 出 所 包 含 的 酶 切 位 點 ， 用相 應 的 限 制 性 核 酸 內 切 酶 消 化 PCR擴 增 產 物 ，然 后 進 行 電 泳 ， 觀 察 消 化 片 段 的 大 小 是 否 與 序列 資 料 相 符 。 用 途 ： 傳 染

31、病 病 原 體 基 因 分 型 人 類 基 因 的 變 異 性 研 究 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 單 鏈 構 型 多 態(tài) 性 分 析 法（ PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） 將 PCR 產 物 雙 鏈 DNA（ dsDNA） 變 性 為 單 鏈DNA （ ssDNA） ， 加 樣 于 變 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 進行 電 泳 ， 由 于 DNA 分 子 在 凝 膠 中 的 電 泳 遷

32、移 率 與其 分 子 量 和 空 間 結 構 有 關 ， 而 空 間 結 構 又 與ssDNA序 列 有 關 。 因 此 ， 電 泳 結 束 后 ， ssDNA帶位 置 的 差 異 即 可 反 映 出 PCR產 物 序 列 的 差 異 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 核 酸 探 針 雜 交 法 點 雜 交 反 向 點 雜 交 微 孔 板 雜 交 熒 光 探 針 雜 交 法 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine,

33、Wenzhou Medical College 點 雜 交 （ dot blot） 原 理 ： 將 擴 增 產 物 變 性 后 直 接 點 在 尼 龍 膜 或 硝 酸 纖 維 素膜 上 ， 再 用 放 射 性 或 非 放 射 性 標 記 物 標 記 的 寡 核 苷 酸 探針 與 之 雜 交 。 探 針 ： 放 射 性 同 位 素 標 記 探 針 檢 測 的 敏 感 、 特 異 ， 具 有 不 穩(wěn) 定 性 和放 射 性 危 害 。 非 放 射 性 物 質 （ 如 生 物 素 、 地 高 辛 、 熒 光 素 等 ） 標 記 的 探 針穩(wěn) 定 性 高 、 使 用 安 全 、 檢 測 速 度 快 用

34、途 ： 主 要 用 于 PCR產 物 特 異 性 鑒 定 及 變 異 分 析 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 反 向 點 雜 交 (reverse dot blot) 原 理 ： 使 用 帶 有 標 記 物 的 引 物 進 行 PCR擴 增 ， 然 后 將 擴增 產 物 變 性 。 將 不 同 的 寡 核 酸 探 針 固 定 在 尼 龍 膜 上 ， 用變 性 的 PCR產 物 與 之 雜 交 。 探 針 ： 嚴 格 設 計 ， 具 有 相 同 的 雜 交 反 應 條 件 。

35、 用 途 ： 反 向 點 雜 交 特 別 適 用 于 遺 傳 性 疾 病 多 個 位 點 的 點突 變 分 析 。 結 果 分 析 ： 正 常 純 合 子 突 變 純 合 子 雜 合 子 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 微 孔 板 雜 交 ( microplate hybridization) 夾心雜交 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 熒 光 探 針 雜 交 法

36、 目 前 臨 床 上 常 用 熒 光 探 針 法 來 檢 測 PCR產物 ， 主 要 的 方 法 有 TaqMan技 術 、 分 子 信 標技 術 、 復 合 探 針 法 等 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR產 物 測 序 對 PCR產 物 進 行 測 序 是 檢 測 PCR產 物 特異 性 最 可 靠 的 方 法 ， 可 將 PCR產 物 克 隆到 載 體 上 進 行 測 序 ， 也 可 對 直 接 PCR產物 進 行 測 序 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增

37、技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 常 見 問 題 原 因 分 析 及 處 理 假 陽 性 非 特 異 性 PCR產 物 假 陰 性 引 物 二 聚 體 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 假 陽 性 PCR產 物 是 最 主 要 的 污 染 源 。 含 有 靶 DNA序 列 的 質 粒 的 污 染 。 陽 性 對 照 的 污 染 。 標 本 之 間 的 交 叉 污 染 。 Taq聚 合 酶 中 帶 有

38、 細 菌 DNA， 當 PCR擴 增 片 段 為 保 守 的 rRNA序 列 時 ， 易 造 成 假 陽 性 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 怎 么 可 能 全 家 人 都 得 了 性 病 ? 何 某 ， 女 ， 46歲 ， 某 部 隊 衛(wèi) 生 所 護 士 ， 離 婚 10年 ， 與 一 男 友 交 往5年 。 她 近 來 忽 然 感 到 陰 部 瘙 癢 ， 白 帶 有 異 味 ， 想 到 自 己 有 非 婚性 行 為 ， 怕 萬 一 得 性 病 被 人 知 道 ， 便 悄

39、 悄 到 郊 區(qū) 一 個 小 診 所 去 看病 。 結 果 被 告 知 是 淋 病 ， 用 了 許 多 藥 ， 未 見 明 顯 好 轉 。 她 通 過查 書 感 到 問 題 嚴 重 ” ， 擔 心 全 家 都 會 傳 染 ， 尤 其 是 正 讀 初 中 的女 兒 被 傳 染 上 怎 么 辦 ？ 為 了 孩 子 ， 顧 不 上 面 子 了 。 她 不 僅 帶 自 己的 女 兒 、 70歲 老 母 到 醫(yī) 院 檢 查 ， 還 動 員 最 近 與 其 同 居 一 處 的 妹 妹 、妹 夫 及 14歲 的 外 甥 女 都 到 醫(yī) 院 檢 查 。 醫(yī) 師 給 他 們 用 最 先 進 的PCR”檢 測 ，

40、 結 果 6個 人 都 是 淋 球 菌 感 染 ” ！ 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 非 特 異 性 PCR產 物 引 物 特 異 性 不 高 ， 引 物 用 量 過 多 ， 應 調 換 引 物 或 降 低 引 物用 量 。 Taq DNA聚 合 酶 質 量 不 好 或 用 量 偏 高 ， 應 降 低 酶 量 或 使 用質 量 較 好 的 酶 。 Mg2+ 濃 度 過 高 ， 可 適 當 調 節(jié) Mg2+濃 度 。 退 火 溫 度 過 低 ， 退 火 及 延 伸 時 間 偏

41、長 ， 可 提 高 退 火 溫 度 ，減 少 退 火 及 延 伸 時 間 ， 或 者 采 用 二 溫 循 環(huán) PCR進 行 擴 增 。 熱 循 環(huán) 次 數 過 多 ， 適 當 增 加 模 板 用 量 ， 減 少 循 環(huán) 次 數 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 假 陰 性 引 物 設 計 是 否 合 理 標 本 中 是 否 有 Taq酶 抑 制 劑 ， Taq酶 是 否 失 活 。 反 應 體 系 中 有 無 蛋 白 酶 或 核 酸 酶 降 解 DNA聚 合 酶 或 模 板

42、DNA，可 在 95 以 上 加 熱 10分 鐘 使 其 滅 活 。 反 應 體 系 中 是 否 有 較 難 去 除 的 蛋 白 質 抑 制 PCR系 統(tǒng) ， 用 蛋 白 酶 K重 新 處 理 常 可 獲 預 期 結 果 。 循 環(huán) 溫 度 ， 特 別 是 解 鏈 溫 度 是 否 準 確 ， 退 火 溫 度 是 否 過 高 。 有 些PCR儀 指 示 溫 度 與 實 際 溫 度 不 符 ， 過 高 則 酶 在 前 幾 個 循 環(huán) 中 迅 速失 活 ， 過 低 則 模 板 變 性 不 徹 底 檢 測 PCR產 物 方 法 靈 敏 度 不 夠 ， 如 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 法 敏 感 性 較

43、 低 。 靶 序 列 發(fā) 生 突 變 、 缺 失 等 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引 物 二 聚 體 v兩 個 相 同 的 或 不 同 的 引 物 分 子 之 間 有 較 多 的 堿 基 配 對 ，特 別 是 引 物 3端 有 互 補 區(qū) 。v引 物 模 板 比 例 太 高 ， 可 增 加 模 板 用 量 。v退 火 溫 度 過 低 。v熱 循 環(huán) 次 數 過 多 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, We

44、nzhou Medical College PCR污 染 及 預 防 措 施 分 開 操 作 區(qū) 域 。 耐 高 壓 的 試 劑 及 器 材 應 高 溫 高 壓 滅 菌 。 使 用 一 次 性 Tip頭 、 Eppendorf管 等 。 小 量 分 裝 試 劑 。 樣 品 制 備 應 按 無 菌 操 作 原 則 進 行 ， 避 免 樣 品 間 相 互 污 染 。 操 作 者 帶 手 套 操 作 ， 且 應 勤 換 手 套 。 使 用 尿 嘧 啶 -DNA-糖 基 化 酶 控 制 PCR產 物 交 叉 污 染 。 每 次 PCR操 作 都 應 設 陽 性 及 陰 性 對 照 。 分子生物學檢驗技

45、術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College RNA酶 的 污 染 與 預 防 去 除 外 源 RNase污 染 玻 璃 器 皿 常 規(guī) 洗 凈 后 ， 應 用0.1% DEPC處 理 。 所 有 溶 液 應 加 DEPC至0.05%0.1%， 室 溫 處 理 過 夜 ，然 后 高 壓 處 理 。 操 作 者 戴 口 罩 和 手 套 。 材 料 器 材 使 用 滅 菌 一 次 性 用 品 。 抑 制 內 源 性 RNase的 活 性 使 用 低 特 異 性 RNase抑 制 物 ： 如 皂 土 、復 合 硅

46、 酸 鹽 、 肝 素 、 DEPC等 。 去 除 蛋 白 質 物 質 ： 蛋 白 質 變 性 劑 、 蛋 白酶 K、 陰 離 子 去 污 劑 等 ， 常 與 RNA酶 抑制 物 聯(lián) 合 使 用 ， 以 加 強 對 RNase活 力 的抑 制 。 RNase的 特 異 性 抑 制 劑 ： 如 RNase阻 抑 蛋白 （ RNasin） 、 氧 釩 核 糖 核 苷 復 合 物 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR衍 生 技 術 巢 式 PCR（ nested PCR ） 逆

47、轉 錄 PCR（ reverse transcription-PCR， RT-PCR） 多 重 PCR(multiplex PCR) 重 組 PCR(recombinant PCR) 錨 定 PCR（ anchored PCR, A-PCR） 不 對 稱 PCR（ asymmetric PCR） 反 向 PCR（ inverse PCR） 擴 增 長 片 段 PCR（ long PCR， long-distance PCR） 免 疫 PCR(immuno-PCR) 定 量 PCR 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzho

48、u Medical College 巢 式 PCR（ nested PCR） 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 逆 轉 錄 PCR（ reverse transcription-PCR， RT-PCR） 逆轉錄酶AMV逆轉錄酶（最適溫度為42）MoMLV逆轉錄酶（最適溫度為37）逆轉錄引物隨機引物；Oligo(dT)；特異性引物。one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉錄酶、逆轉錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA 為模板進行逆轉

49、錄和PCR擴增，稱為一步法RT-PCR。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 多 重 PCR(multiplex PCR) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 重 組 PCR(recombinant PCR) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 錨 定 PC

50、R（ anchored PCR, A-PCR） 基本原理：抽提細胞總RNA或mRNA，在逆轉錄酶作用下合成cDNA，通過DNA末端轉移酶在cDNA 3端加上poly(dG)尾。據此設計錨定引物poly(dC)，為提高擴增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定引物5端可加上某些限制性內切酶識別序列或其它序列信息。根據已知的3端序列設計基因特異性引物，與錨定引物一起進行PCR擴增。用途：檢測T細胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 不 對 稱 PCR

51、（ asymmetric PCR） 基 本 原 理 ： 采 用 兩 條 不 同 濃 度 的 引 物 ， 即 非 限 制 引 物 (高 濃 度 引物 )與 限 制 性 引 物 (低 濃 度 引 物 )， 二 者 之 比 為 50-100： 1。 在 PCR最 初 10-15個 循 環(huán) 中 ， 擴 增 產 物 主 要 是 雙 鏈 DNA(dsDNA)； 第 15個 循 環(huán) 以 后 ， 限 制 性 引 物 已 被 耗 盡 ， 非 限 制 性 引 物 介 導 的 PCR就會 產 生 大 量 的 單 鏈 DNA(ssDNA)。 關 鍵 ： 控 制 限 制 性 引 物 的 絕 對 量 ， 需 多 次 摸

52、索 優(yōu) 化 兩 條 引 物 的 比例 。 也 有 人 先 用 等 濃 度 的 引 物 PCR擴 增 ， 制 備 雙 鏈 DNA； 然 后以 雙 鏈 DNA為 模 板 ， 再 以 其 中 的 一 條 引 物 進 行 第 二 次 PCR， 制備 單 鏈 DNA。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 反 向 PCR（ reverse PCR） 反 向 PCR用 于 快 速 擴 增 已 知 序 列 以 外 的 未 知 DNA片 段 ， 從 而 對 未 知 序 進 行 分 析 研 究 。 該

53、 法 首 先 用已 知 序 列 和 待 擴 增 序 列 都 沒 有 切 點 的 限 制 性 核 酸內 切 酶 將 模 板 DNA消 化 ， 再 用 連 接 酶 使 酶 切 產 物環(huán) 化 ， 使 已 知 的 和 待 擴 增 的 未 知 序 列 都 包 含 在 環(huán)中 。 在 已 知 序 列 內 設 計 一 對 反 向 的 引 物 ， 即 可 擴增 已 知 序 列 以 外 的 區(qū) 域 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 反 向 PCR已 知 序 列PCR用 途 ：未 知 序 列 的

54、研 究限 制 酶 切 點 （ X） 限 制 酶 切 點 （ X）限 制 酶 X酶 切連 接 未 知 序 列 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 擴 增 長 片 段 PCR（ long PCR） 模 板 完 整 性 ： 應 用 瓊 脂 糖 包 埋 細 胞 抽 提 法 模 板 DNA 。 引 物 ： 一 般 較 長 （ 22-35nt） ， Tm值 較 大 。 DNA聚 合 酶 ： 長 片 段 PCR應 采 用 錯 配 率 低 的 耐 熱 DNA聚 合 酶 ：如 Ampli Taq、

55、rTth、 Hot Tube、 Vent、 Deen Vent、 Pfu、 rTma等 。 Vent、 Deen Vent、 Pfu、 rTma等 聚 合 酶 有 3-5外 切 酶 活 性 。 PCR緩 沖 液 ： 增 加 Tris的 濃 度 或 改 用 Tricine緩 沖 液 以 增 強 緩 沖 能力 ， 并 使 緩 沖 液 pH適 度 升 高 。 此 外 ， 加 入 適 量 的 甘 油 、 DMSO（ 二 甲 亞 砜 ） 、 明 膠 、 聚 乙 二 醇 、 Tween 20等 物 質 ， 有 助 于 模 板變 性 和 維 持 DNA聚 合 酶 的 穩(wěn) 定 。 熱 循 環(huán) ： 增 加 延

56、伸 時 間 （ 一 般 1kb/min） ， 提 高 退 火 溫 度 ， 同 時采 用 熱 啟 動 。 熱 循 環(huán) 后 期 ， 適 當 增 加 延 伸 時 間 ， 以 保 證 產 物 充 分延 伸 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 免 疫 PCR(immuno-PCR) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 原 位 PCR（ in situ PCR ） 直 接 法

57、： 使 用 標 記 （ 放 射 性 同 位 素 、 生 物 素 、 地 高 辛 、 熒 光 素 等 ）的 引 物 或 脫 氧 三 磷 酸 核 苷 酸 （ 如 dUTP） 進 行 PCR擴 增 ， 則 標 記物 摻 入 到 PCR 產 物 中 。 最 后 用 放 射 自 顯 影 、 免 疫 組 化 或 熒 光 法檢 測 PCR 產 物 及 其 在 細 胞 內 位 置 。 間 接 法 ： 先 進 行 細 胞 內 DNA的 原 位 擴 增 ， 然 后 用 標 記 的 核 酸 探針 進 行 原 位 雜 交 。 原 位 逆 轉 錄 PCR（ in situ reverse transciption PC

58、R） 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 定 量 PCR 概 念 ： 通 過 對 PCR終 產 物 的 分 析 或 PCR過 程 的 監(jiān) 測 ， 對 PCR起 始 模 板 進 行 定 量的 技 術 。 N= N0(1+E)c 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 定 量 PCR中 擴 增 產 物 的 檢 測 方 法 凝 膠 電 泳 ： PCR-ELISA 熒 光 PCR法

59、 由 于 熒 光 PCR可 使 用 現(xiàn) 代 化 儀 器 對 PCR產 物 實 行 實 時 檢測 ， 很 容 易 保 證 擴 增 在 指 數 增 長 期 內 進 行 ， 是 定 量 PCR擴 增 產 物 檢 測 的 一 個 發(fā) 展 方 向 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 第 二 節(jié) 熒 光 定 量 聚 合 酶 鏈 反 應（ Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction， FQ-PCR） 一 、 熒 光 定 量 PCR技 術

60、 基 本 原 理 二 、 熒 光 定 量 PCR技 術 三 、 熒 光 定 量 PCR測 定 的 數 據 處 理 四 、 實 時 熒 光 定 量 PCR技 術 的 應 用 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 熒 光 定 量 PCR技 術 基 本 原 理 熒 光 擴 增 曲 線 圖 Ct值 標 準 定 量 曲 線 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College熒 光 擴 增曲 線 圖

61、 熒 光 定 量 PCR： 通 過 對 PCR 擴 增 反 應 中 每 一 個 循 環(huán) 產 物熒 光 信 號 的 實 時 檢 測 從 而 實 現(xiàn) 對 起 始 模 板 定 量 及 定 性 的 分 析 。 隨著 PCR 反 應 的 進 行 ,PCR 反 應 產 物 不 斷 累 計 ， 熒 光 信 號 強 度 也 等比 例 增 加 。 每 個 循 環(huán) 收 集 一 個 熒 光 強 度 信 號 ， 通 過 熒 光 強 度 變 化監(jiān) 測 產 物 量 的 變 化 ， 從 而 得 到 一 條 熒 光 擴 增 曲 線 . 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medi

62、cine, Wenzhou Medical College Ct 值 N= N0(1+E) c logN=logN 0+clog(1+e) 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College Ct值 的 重 現(xiàn) 性 PCR循 環(huán) 在 到 達 Ct值 所 在 的 循 環(huán) 數 時 ， 剛剛 進 入 真 正 的 指 數 擴 增 期 （ 對 數 期 ） ， 此時 微 小 誤 差 尚 未 放 大 ， 因 此 Ct值 的 重 現(xiàn) 性極 好 ， 即 同 一 模 板 不 同 時 間 擴 增 或 同 一 時間 不

63、同 管 內 擴 增 ， 得 到 的 Ct值 是 恒 定 的 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 初 始 模 板 量 的 對 數 與 C(T)循 環(huán) 數 之 間 呈 線 性 關 系標 準 定 量 曲 線 熒 光 強 度 -循 環(huán) 數 曲 線 初 始 模 板 量 對 數 -C(T)循 環(huán) 數 標 準 曲 線 分子生物學檢驗技術模塊8

64、核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 熒 光 定 量 PCR技 術 熒 光 染 料 法 熒 光 標 記 探 針 TaqMan熒 光 標 記 探 針 molecular Beacon熒 光 標 記 探 針 熒 光 標 記 雜 交 雙 探 針 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 熒 光 染 料 法 SYBR染 料 在 PCR反 應 體 系 中 ， 加 入 過 量 SYBR熒 光 染 料 ，SYBR熒

65、光 染 料 特 異 性 地 摻 入 DNA雙 鏈 后 ， 發(fā) 射熒 光 信 號 ， 而 不 摻 入 鏈 中 的 SYBR染 料 分 子 不 會發(fā) 射 任 何 熒 光 信 號 ， 從 而 保 證 熒 光 信 號 的 增 加 與PCR產 物 的 增 加 完 全 同 步 。 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College SYBR-Green I 535 3SGExcitation SGSGSGSG Emission雙 鏈 熒 光 染 料 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of

66、Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College SYBR-Green I 535 3SGSG SG SG SGExcitation Emission 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 溶 解 曲 線 分 析 （ Tm）特 異 性 問 題 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College TaqMan探 針 法 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 遵 循 一 般 引 物 設 計 原 則 ； 引 物 之 間 的 Tm相 差 避 免 超 過 2 ； 為 避 免 基 因 組 的 擴 增 ， 引 物 設 計 最 好 能 跨兩 個 外 顯 子 ；TaqMan技 術 引 物 設 計 原 則 分子生物學檢驗技術模塊8 核酸擴增技術 Sc