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1、核 酸 和 蛋 白 質 分 析 技 術 第 一 節(jié) 核 酸 分 析 技 術n 講 述 內 容 ： 1、 核 酸 電 泳 2、 雜 交 技 術 3、 PCR技 術 4、 基 因 芯 片 一 、 核 酸 電 泳 n （ 一 ） DNA的 凝 膠 電 泳n 凝 膠 電 泳 是 分 子 克 隆 的 中 心 技 術 之 一 。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于2001000bp的片段; 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離5500bp的片段; 效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 的 基

2、 本 過 程n 材 料 ： 電 泳 緩 沖 液 （ 常 用 TAE或 TBE） 、 電 泳 級 瓊 脂 糖 、 溴 化 乙 錠 溶液 （ 核 酸 顯 示 劑 ） 、 加 樣 緩 沖 液 （ 保 證 核 酸 不 在 加 樣 孔 中 擴 散 和 用 于 電 泳時 間 的 指 示 系 統(tǒng) ） 、 水 平 凝 膠 電 泳 裝 置 及 制 膠 系 統(tǒng) 、 直 流 電 源 系 統(tǒng) 。 n基本過程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時間后停止電泳 取出凝膠進行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結果 n 注

3、意 ： 溴 化 乙 錠 具 有 致 癌 性 ， 操 作 時 要 帶 手 套 不 同 濃 度 瓊 脂 糖 的 凝 膠 分 離 范 圍瓊 脂 糖 濃 度 （ ， W/ V ) DNA分 子 的 有 效 分 離 范 圍 （ kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2 影響DNA在凝膠中遷移速率的因素： n 1 DNA分 子 的 大 小n 2 構 象n 3 凝 膠 濃 度n 4 電 壓n 5 緩 沖 液 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 細 胞 凋 亡 過 程 中 DNA Ladder的 形 成 PCR產 物 的 瓊 脂 糖 電 泳 聚 丙 烯

4、 凝 膠 電 泳 的 銀 染 結 果 分 析 特 殊 的 凝 膠 電 泳n倒轉電場凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量102000kb的DNA分子；n鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子 基本過程同DNA電泳一樣，但應明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因為RNA分子有二、三級結構可以影響其電泳結果，因此電泳時應在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 （ 二 ） RNA 電 泳 二 核 酸 雜 交 技 術

5、n （ 一 ） Southern Blotn 原 理 ：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。 Southern Blot 操 作 步 驟 ：DNA 瓊 脂 糖 電 泳 印 跡 轉 移 預 雜 交 雜 交

6、（ 變 性 探 針 ） 洗 膜 放 射 自 顯 影 或 顯 色 n原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。n用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物（mRNA）及其含量。 （ 二 ） Northern Blot 操 作 過 程 mRNA提 取 甲 醛 變 性 電 泳 印 跡 轉 移 預 雜 交 雜 交 （ 變 性 探 針 ） 洗 膜 放 射 自 顯 影 或 化 學 發(fā) 光 （ 三 ） 探 針 標 記 技 術n 1 標 記 物 ： 放 射 性 和 非 放 射 性 兩 種n 放 射 性 ： n 非 放 射 性

7、 ：生物素、地高辛素、熒光素 n 2、標記方法 n （ 1）切口平移法 n （ 2） 隨 機 引 物 法n （ 3） 末 端 標 記 法n （ 4） 單 鏈 DNA探 針 標 記n （ 5）寡核苷酸探針標記法 32P、35S和3H 三 PCR技 術n PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性退火DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產物是以指數形式積累的，經2530個循環(huán)后，擴增倍數可達106。 n Dr. Karry Mullis 1985年 發(fā) 明 ， 獲 1993年 度 諾 貝 爾 化 學獎 ；

8、目 的 : 用 于 擴 增 位 于 兩 段 已 知 序 列 之 間 的 DNA區(qū) 段 。 （ 一 ） 原 理 ：雙 鏈 DNA通 過 高 溫 變 性 解 離 成 互 補 單 鏈 DNA 變 性 與 一 對 寡 核 苷 酸 引 物 （ 5， 3） 降 低 溫 度 退 火 DNA加 熱 變 性 +引 物 慢 慢 冷 卻 使 其 結 合 ， 形 象 地 稱 為 退 火 適 溫 延 伸 5/3引 物 形 成 新 鏈 變 成 4條 鏈 DNA 延 伸 第 二 輪 ： 變 性 退 火 延 伸 呈 指 數 增 長 理 論 值 ： 一 輪 一 倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109

9、理 論 模 板 擴 增 30輪 1ng-1g 實 際 模 板 擴 增 30輪 1ng-10g n1 Taq DNA聚 合 酶 ：n 水 生 棲 熱 菌 (thermus aquaticus,Taq)的 DNA聚 合 酶n 53DNA聚 合 酶 活 性 ；n 無 35外 切 酶 活 性 ，n 35輪 0.25%錯 配 ， 與 原 始 模 板 有 差 別 ；n 最 適 聚 合 酶 溫 度 72 ， 選 擇 72 延 伸n 半 衰 期 ： 92.5 130min n 95 40min n 97.5 56minn 變 性 溫 度 ： 95 使 其 在 整 個 擴 增 循 環(huán) 中 保 持 足 夠 活 性

10、（ 二 ） 基 本 要 素 pfu DNA 聚 合 酶n 耐 熱n 53DNA聚 合 酶 活 性n 3 5外 切 酶 活 性n 精 確 度 ： pfu Taq 但 pfu擴 增 效 率 通 常 比 Taq酶 略 差 n 文 獻 報 道 ： Taq+pfu 會 起 到 較 好 效 果n n 2 .引 物n 人 工 合 成 短 寡 核 苷 酸 20bp-25bp Tm=55 -60 ，n Tm值 要 相 近 ， 每 條 10-50pmol /100l n 設 計 原 則 ： （ 1） 靠 近 5上 游 Primer與 雙 鏈 DNA正 鏈 相 同n 3下 游 Primer與 雙 鏈 DNA正 鏈

11、互 補 ， 與 負 鏈 相 同n 正 鏈 5 3 上 游 Primern 下 游 Primer 負 鏈 3 5 n 例 如 ：n IL-3正 鏈n 5GCTCCATGACCCAG- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3n 負 鏈 3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5n 上 游 ： 與 其 相 同n 下 游 ： 先 寫 出 相 應 負 鏈 3 5然 后 倒 過 來 5 3n 所 以 負 鏈 Primer： 5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3 （ 2） Primer 本 身 不 要 出 現(xiàn) 內 部 互 補 序 列 形 成 loop環(huán) ， 內 部 二 級 結 構 如

12、： GGGTCGATTCCTACCCATGC（ 3） 注 意 減 少 Primer間 互 補 序 列 導 致 2個 Primer形 成 dimer 一 般 不 要 超 過 3個 互 補 bp 如 ： CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC n n n 修 飾n 如 ： 32P、 生 物 素 、 熒 光 素 ， 不 影 響 其 效 果n 突 變 ：n AGCTCCATGACCCAG n 5CGCTCCATGACCCAG 3n 注 意 ： 絕 不 可 以 在 3端 進 行 上 述 改 造n DNA聚 合 酶 是 5 3聚 合 ， 若 3

13、端 改 造 不 能 互 補 不 能 延 伸n （ 4） Primer 5未 端 可 修 飾 、 突 變 : n （ 5） primer 5 端 增 加 堿 基n n n 內 切 酶 識 別 點 ：n （ G） GAATTC GCTCCATGACCCAG n 保 護 bpn 對 PCR產 物 cloning有 很 大 好 處 n 便 于 內 切 酶 消 化 ， 不 同 內 切 酶 需 保 護 bP數 量 不 同n EcoRI 1 BglII 2-3n XbaI 2-3 Hind 3n BamHI 2-3 PstI 4n XhoI 4 NotI 10n 如 果 所 用 保 護 bp數 量 不 合

14、適 影 響 內 切 酶 消 化 影 響 下 步 克 隆n 未 切 開 ， 連 接 不 上n ATG起 始 密 碼 TAA、 TAG、 TGA終 止 密 碼如 ：可 溶 性 受 體 的 表 達 ， 無 膜 內 區(qū) 、 穿 膜 區(qū) ， 只 有 膜 外區(qū) 。 3.模 板 ： 可 選 ： DNA mRNA 逆 轉 錄 cDNA DNA包 括 ： 質 粒 噬 菌 體 染 色 體 DNA 較 小 較 大 目 的 gene是 單 拷 貝 變 性 較 易 變 性 較 難 非 常 大 ， 變 性 難 模 板 用 量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注 意 ： 防 止 交 叉 污

15、 染 4.dNTP：四 種 脫 氧 核 苷 酸 ， 基 本 原 料終 濃 度 ： 50M 注 意 ： 不 穩(wěn) 定 ， 保 存 時 間 長 會 失 效 5.Mg2+ TaqDNA聚 合 酶 作 用 時 需 要 Mg2+ 不 同 的 酶 需 不 同 Mg2+ Taq： 較 少 ， Mg2+ 對 反 應 影 響 很 大 ， 0.5-1.5mM終 濃 度 pfu： Mg2+ 2-3mM， dNTP、 primer用 量 約 增 加 一 倍 外 界 影 響 ： EDTA鰲 合 Mg 2+ 選 較 低 濃 度 TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模 板 、 引 物 和 dNTP 的 磷 酸

16、 基 團 均 可 與 Mg2+ 結 合 ， 降 低 Mg2+ 有 效 濃 度 。 如 果 擴 增 產 物 或 效 率 不 理 想 ， 要 注 意 調 整 合 適 的 Mg2+濃 度 （ 1） 變 性 溫 度 ： 94-95 Templete： GC比 例 高 、 長 度 很 長 ， 則 變 性 T （ 2） 退 火 ： 溫 度 越 高 ， 擴 增 特 異 性 越 好取 決 于 Tm值 ： Tm 退 火 T ； Tm 退 火 T若 Tm較 高 ， 可 使 退 火 和 延 伸 在 同 一 溫 度（ 3） 延 伸 ：500nt-1min 500nt 3min一 般 ： 40 60sec 6.溫 度

17、和 時 間 ： （ 三 ） PCR技 術 的 應 用n 1. 基 因 檢 測 ：n 2. 基 因 克 隆 化n 3. DNA突 變n 4. DNA序 列 分 析 四 、 基 因 芯 片n 利 用 核 酸 雜 交 的 原 理 ， 應 用 于 DNA、 RNA的 研 究背 景 資 料 基 因 芯 片 （ ） 就 是 利 用 點 樣 機 等 機 械 裝 置 ， 在 玻 璃等 支 持 物 表 面 整 齊 地 點 上 高 密 度 的 、 成 千 上 萬 個 “ 點 ” ， 每 個 “ 點 ” 含 有可 與 一 種 基 因 雜 交 的 一 條 探 針 。 由 于 芯 片 上 有 序 地 排 列 著 探針

18、， 因 此 也 被 稱 為 微 陣 列 （ ） 。 在 芯 片 上 滴 加 樣 品后 ， 在 合 適 的 條 件 下 ， 樣 品 中 含 有 的 各 種 核 酸 片 段 （ 或 ）就 與 相 應 的 探 針 雜 交 。 由 于 核 酸 片 段 上 已 標 記 有 熒 光 素 ， 激 發(fā) 后 產 生 的 熒光 強 度 就 與 樣 品 中 所 含 有 的 相 應 核 酸 片 段 的 量 成 正 比 ， 也 就 代 表 該 基 因 的表 達 量 。 經 激 光 共 聚 焦 掃 描 儀 等 裝 置 掃 描 后 ， 所 獲 得 的 信 息 經 專 用 軟 件 分 析 處 理 ， 即 可 獲 得 成 千

19、上 萬 種 基 因 的 表 達 情 況 。 正 因 為 這 種 特 點 ， 基 因 芯片 技 術 已 成 為 當 前 生 命 科 學 研 究 的 熱 點 之 一 。 操作流程 n（1）探針的設計、合成與芯片的制作（商品化產品）；n（2）靶基因樣品的制備；n 靶基因的制備：RT-PCR （設實驗組和對照組）n 標記方法：分別進行熒光素標記如：Cy3和Cy5n（3）生化雜交反應；與常規(guī)的分子雜交過程基本相似n 封閉 預雜交 雜交 洗脫n（4）雜交信號的檢測與結果的分析 n 激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號，計算機分析n 基 因 芯 片 的 應 用n用于基因轉錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究

20、 舉例：美國斯坦福大學Davis等用PCR法從外周血淋巴細胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細胞和未處理的T細胞種提取的mRNA反轉錄出的單鏈cDNA片段雜交，經激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個差異表達的基因，其中11個是被熱誘導的，6個是被熱抑制的。經序列分析證實，其中3個是未報導的新基因。 第 二 節(jié) 蛋 白 質 分 析 技 術n 講 述 內 容 ：一、Western Blot 二、ELISA三、免疫熒光技術四、免疫組織化學技術 五、蛋 白 質 與 蛋 白 質 相 互 作 用 的 研 究 技 術 一 Western Blotn 1 原 理 ：n

21、 將 通 過 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 分 離 的 蛋 白 質 轉 移 到 硝 酸 纖維 素 或 PVDF膜 上 ， 然 后 與 能 特 異 性 識 別 待 檢 蛋 白 的 抗 體進 行 反 應 ， 洗 滌 去 除 沒 有 結 合 的 特 異 性 抗 體 后 ， 加 入 標記 的 、 能 識 別 特 異 性 抗 體 的 種 屬 特 異 性 抗 體 ， 反 應 一 段時 間 后 再 次 洗 滌 去 除 非 特 異 性 結 合 的 標 記 抗 體 ， 加 入 適合 標 記 物 的 檢 測 試 劑 進 行 顯 色 或 發(fā) 光 等 ， 觀 察 有 無 特 異性 蛋 白 條 帶 的 出 現(xiàn) ，

22、 也 可 通 過 條 帶 的 密 度 大 小 來 進 行 特異 性 蛋 白 的 半 定 量 。 2 操 作 過 程n SDS-PAGE電 泳 轉 膜 （ PVDF或 硝 酸 纖 維 素 膜 ）n 封 閉 一 抗 洗 滌 酶 標 二 抗 反 應n 洗 滌 顯 色 或 化 學 發(fā) 光 顯 影 H ours 0 4 8 16 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, c

23、ells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control 0h 4h 8h 16h Western Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cel

24、ls were treated with 10M gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. Cyto-CX-Protein 3 注 意 的 問 題n （ 1） 蛋 白 質 電 泳n 常 用 SDS-PAGE： 單 一 亞 基 組 成 的 蛋 白 質n 非 變 性 PAGE： 多 個 不 同 亞 基 組 成 的 蛋 白 質n Tris-Tric

25、ine膠 中 電 泳 ： 用 于 分 子 量 小 于 10kDa的 多 肽 和蛋 白 的 電 泳 ， 能 夠 獲 得 較 好 的 分 離 效 果 。聚 丙 烯 酰 胺 具 有 神 經 毒 性 ， 操 作 時 要 戴 手 套 （ 2） 轉 膜n 戴 手 套 ， 避 免 用 手 接 觸 濾 紙 、 凝 膠 和 膜 ， 因 為 手 上 的 油 脂 會阻 斷 轉 印 。 濾 紙 和 膜 的 尺 寸 與 凝 膠 大 小 一 致n 以 適 量 的 轉 移 Buffer室 溫 平 衡 濾 紙 、 凝 膠 和 膜 15 30min，如 果 是 PVDF膜 ， 必 須 先 用 甲 醇 激 活 后 浸 泡 。n

26、方 向 正 確 ： 凝 膠 在 陰 極 ， 膜 在 陽 極n 排 去 濾 紙 、 膠 和 膜 間 的 氣 泡 。n 電 轉 時 間 ： 100V 1-2h,可 根 據 蛋 白 分 子 量 的 大 小 靈 活 選 擇 n 轉 移 結 束 后 ， 凝 膠 用 考 馬 氏 亮 蘭 染 色 以 確 定 轉 移 效 率n 膜 用 麗 春 紅 染 色 觀 察 蛋 白 分 子 量 標 準 的 位 置 （ 3） 封 閉n 用 5 脫 脂 奶 粉 或 3 BSAn （ 含 0.1 Tween20 TBS或 PBS配 制 ）n 時 間 ： 室 溫 2h或 4C過 夜 （ 4） 顯 色 或 顯 影n 顯 色n 辣

27、根 過 氧 化 物 酶 ： 底 物 為 DABn 堿 性 磷 酸 酶 ： 底 物 為 BCIP/NBTn 化 學 發(fā) 光 顯 影n 最 常 用 。 辣 根 過 氧 化 物 酶 和 堿 性 磷 酸 酶 有 不 同 的 發(fā) 光 底 物 （ 商 品化 產 品 ） n 注 意 ： 化 學 發(fā) 光 前 將 膜 用 不 含 Tween20的 TBS或 PBS洗 滌 一 次n 曝 光 的 時 間 和 顯 影 的 時 間 根 據 實 際 情 況 而 定 （ 5） 膜 的 再 利 用n 化 學 發(fā) 光 后 的 硝 酸 纖 維 素 膜 用 Stripping Buffer洗 滌 后（ 洗 滌 Buffer: 62

28、.5mm pH6.7 的 Tris-HCI含 2 SDS和100mm的 2ME ） 用 不 同 的 一 抗 進 行 雜 交 ， 檢 測其 它 蛋 白 的 表 達 情 況 。 一 張 膜 可 以 重 復 使 用 3 4次 。 n 堿 性 磷 酸 酶 顯 色 的 膜 不 能 再 進 行 雜 交 n 1 原 理 ：n ELISA的 基 礎 是 抗 原 或 抗 體 的 固 相 化 及 抗 原 或 抗 體 的 酶 標 記 。 結合 在 固 相 載 體 表 面 的 抗 原 或 抗 體 仍 保 持 其 免 疫 學 活 性 ， 酶 標 記 的抗 原 或 抗 體 既 保 留 其 免 疫 學 活 性 ， 又 保

29、留 酶 的 活 性 。 在 測 定 時 ，受 檢 標 本 與 固 相 載 體 表 面 的 抗 原 或 抗 體 起 反 應 。 再 加 入 酶 標 記 的抗 原 或 抗 體 ， 也 通 過 反 應 而 結 合 在 固 相 載 體 上 。 此 時 固 相 上 的 酶量 與 標 本 中 受 檢 物 質 的 量 呈 一 定 的 比 例 。 加 入 酶 反 應 的 底 物 后 ，底 物 被 酶 催 化 成 為 有 色 產 物 ， 產 物 的 量 與 標 本 中 受 檢 物 質 的 量 直接 相 關 ， 故 可 根 據 呈 色 的 深 淺 進 行 定 性 或 定 量 分 析 。 測 定 方 法 具有 很

30、高 的 敏 感 度 （ pg-ng/ml水 平 ） ， 并 且 重 復 性 好 。 二 、 ELISA ELISA 常 用 的 酶 和 底 物n 辣 根 過 氧 化 物 酶 ， 底 物 為 OPD, 深 桔 黃 色 ， 檢 測 波 長 492nmn TMB， 藍 綠 色 ， 檢 測 波 長 450nm 堿 性 磷 酸 酶 ， 底 物 為 PNPP（ 對 消 基 苯 磷 酸 酯 ） , 黃 色 檢 測 波 長 405nm ELISA各 步 驟 的 反 應 時 間 包 被 ： 24 36h， 蛋 白 濃 度 為 1 5ug/ml 封 閉 ： 37C 2h 或 4C過 夜 （ 3 BSA） 樣 本

31、反 應 時 間 ： 37C 45min-1h 酶 標 抗 體 反 應 時 間 ： 37C 45min-1h 顯 色 時 間 ： 15min(避 光 ） 設 對 照 可 以 一 次 包 被 多 塊 板 ， 凍 存 備 用 2 類 型（ 1） 間 接 法 測 抗 體間 接 法 是 檢 測 抗 體 常 用 的 方 法 。 其 原 理 為 利 用 酶 標 記 的 抗抗 體 ， 檢 測 與 固 相 抗 原 結 合 的 受 檢 抗 體 ， 故 稱 為 間 接 法 。常 用 于 臨 床 血 清 中 自 身 抗 體 的 檢 測 ， 以 及 雜 交 瘤 上 清 特 異 性抗 體 的 篩 選 。 如 血 清 中

32、PDCD5自 身 抗 體 的 檢 測 。方 法 ： 抗 原 包 被 封 閉 待 檢 抗 體 洗 滌 酶 標 二 抗 洗 滌 顯 色 反 應 終 止 反 應 ELISA Reader檢 測 OD值 (2) 雙 抗 體 夾 心 法 測 抗 原n 是 檢 測 抗 原 最 常 用 的 方 法 。 只 要 獲 得 針 對 受 檢 抗 原 的 特 異 性 抗 體 ， 就 可 用 于 包 被固 相 載 體 和 制 備 酶 結 合 物 。 常 用 的 組 合 ： 單 克 隆 抗 體 多 克 隆 抗 體 單 克 隆 抗 體 單 克 隆 抗 體 后 一 組 合 是 兩 種 單 克 隆 抗 體 針 對 抗 原 上

33、不 同 的 相 距 較遠 的 兩 個 抗 原 決 定 簇 ， 分 別 用 于 包 被 固 相 載 體 和 制 備酶 結 合 物 。 用 途 ： 測 定 二 價 或 二 價 以 上 的 大 分 子 抗 原 ， 但 不 適 用 于 測 定 半 抗 原 及 小 分 子 單 價 抗 原 ， 因 其 不 能 形 成 兩 位 點 夾 心 。 例 如 各 種 細 胞 因 子 的 檢 測 。 n 雙 抗 體 夾 心 法 測 抗 原 的 方 法 ： 捕 獲 抗 體 包 被 封 閉 （ 3 BSA） 待 測 抗 原 洗 滌 （ 含 0.1 Tween的 PBS) 酶 標 單 抗 或 多 抗 洗 滌 顯 色 檢 測

34、 (3)競 爭 法 測 抗 原n 1） 抗 體 固 相 測 抗 原 小 分 子 抗 原 或 半 抗 原 因 缺 乏 可 作 夾 心 法的 兩 個 以 上 的 位 點 ， 因 此 不 能 用 雙 抗 體 夾 心 法 進 行 測 定 ， 可 以 采用 競 爭 法 模 式 。n 其 原 理 是 標 本 中 的 抗 原 和 一 定 量 的 酶 標 抗 原 競 爭 與 固 相 抗 體 結 合 。標 本 中 抗 原 量 含 量 愈 多 ， 結 合 在 固 相 上 的 酶 標 抗 原 愈 少 ， 最 后 的顯 色 也 愈 淺 。 n 方 法 ： 抗 體 包 被 封 閉 同 時 加 入 待 測 抗 原 和 酶

35、 標 抗 原n 洗 滌 酶 底 物 顯 色 ELISA reader檢 測 n 2） 抗 原 固 相 測 抗 原其 原 理 是 標 本 中 的 抗 原 和 固 相 抗 原 與 一 定 量 的 抗 體 競 爭 結 合 。標 本 中 抗 原 含 量 愈 多 ， 結 合 在 固 相 上 的 抗 體 愈 少 ， 最 后 的 顯色 也 愈 淺 。方 法 : a: 抗 原 包 被 96孔 板 ； b:封 閉 ; c: 待 測 抗 原 與 抗 體 反 應 一 定 時 間 ； d: 加 入 96孔 板 e: 洗 滌 f： 加 入 酶 標 二 抗 g： 洗 滌 h： 顯 色 和 檢 測如 臨 床 血 清 樣 本

36、 的 檢 測 以 及 細 胞 培 養(yǎng) 上 清 的 檢 測 （ 4） IgM抗 體 的 檢 測1） 間 接 法 ： 間 接 法 ELISA一 般 僅 適 用 于 檢 測 總 抗 體 或 IgG抗 體 。 如 用 抗 原包 被 的 間 接 法 直 接 測 定 血 清 中 的 IgM抗 體 ， 因 標 本 中 一 般 同 時 存在 較 高 濃 度 的 IgG抗 體 ， 后 者 將 競 爭 結 合 固 相 抗 原 而 使 一 部 分 IgM抗 體 不 能 結 合 到 固 相 上 ， 將 出 現(xiàn) 假 陰 性 結 果 。 因 此 ， 如 果 用 抗IgM作 為 二 抗 ， 間 接 測 定 IgM抗 體 ，

37、 必 須 先 將 標 本 用 A蛋 白 或 抗IgG抗 體 處 理 ， 以 除 去 IgG的 干 擾 。方 法 a: 抗 原 包 被 96孔 酶 標 板 ； b:封 閉 ; c: 待 測 血 清 與 A蛋 白 反 應 一 定 時 間 后 離 心 d: 吸 取 上 清 液 加 入 96孔 酶 標 板 e: 洗 滌 f： 加 入 酶 標 抗 IgM的 抗 體 g： 洗 滌 h： 顯 色 和 檢 測 2） 捕 獲 包 被 法 （ 夾 心 法 ）先 用 抗 人 IgM抗 體 包 被 ELISA板 ， 以 捕 獲 血 清 標 本 中 的 IgM（ 包 括 針對 抗 原 特 異 性 的 IgM和 非 特

38、異 性 的 IgM)。 然 后 加 入 相 應 抗 原 ， 繼 而加 入 針 對 抗 原 特 異 的 酶 標 抗 體 ， 再 與 底 物 作 用 ， 顏 色 的 深 淺 即 與 標本 中 的 IgM含 量 成 正 相 關 。方 法 ： a: 抗 人 IgM抗 體 包 被 96孔 酶 標 板 ； b:封 閉 ; c: 加 入 待 測 血 清 ； d: 洗 滌 96孔 酶 標 板 e: 加 入 相 應 抗 原 f： 加 入 抗 原 特 異 的 酶 標 抗 體 g： 洗 滌 h： 顯 色 和 檢 測 （ 5） ABS-ELISA技 術 （ Avidin Biotin system-ELISA原 理親

39、 和 素 是 一 種 分 子 量 是 60， 000的 堿 性 蛋 白 ， 由 四 個 相 同 亞 基 組 成 ，每 個 亞 基 有 一 個 生 物 素 分 子 結 合 點 。 兩 者 均 可 與 抗 體 等 大 分 子 生 物 活性 物 質 相 偶 聯(lián) ， 又 可 被 酶 類 等 多 種 材 料 所 標 記 ， 成 為 一 種 生 物 反 應 放大 系 統(tǒng) 。 生 物 素 化 抗 體 可 捕 獲 多 個 親 和 素 ， 后 者 再 與 酶 結 合 ， 加 入 底物 后 ， 產 生 顏 色 反 應 。 這 一 系 統(tǒng) 可 以 大 大 提 高 ELISA的 靈 敏 度 。操 作 過 程 ：抗 原

40、 包 被 封 閉 待 檢 標 本 生 物 素 化 抗 體 洗 滌 酶 標 記 親 和 素 洗 滌 加 底 物 顯 色 和 檢測 三 免 疫 熒 光 技 術 n 利 用 某 些 熒 光 素 ， 如 FITC、 R-PE等 通 過化 學 反 應 與 抗 體 或 其 它 蛋 白 結 合 制 備 成熒 光 探 針 ， 然 后 與 被 測 抗 原 或 配 體 發(fā) 生特 異 性 結 合 ， 形 成 的 熒 光 復 合 物 在 一 定波 長 光 的 激 發(fā) 下 可 產 生 熒 光 ， 因 此 利 用熒 光 顯 微 鏡 或 流 式 細 胞 儀 可 檢 測 未 知 抗原 或 相 應 配 體 。 （ 一 ） 細

41、胞 膜 蛋 白 分 子 的 檢 測n 原 理 ：n 細 胞 膜 表 面 的 抗 原 或 受 體 可 特 異 地 與 相 應 的 抗體 或 配 體 結 合 ， 將 針 對 細 胞 表 面 抗 原 的 抗 體 或配 體 用 不 同 的 熒 光 素 標 記 ， 根 據 不 同 熒 光 物 質的 最 大 激 發(fā) 和 發(fā) 射 波 長 的 不 同 ， 即 可 準 確 定 量每 種 熒 光 物 質 的 強 度 ， 從 而 推 出 相 應 細 胞 表 面抗 原 表 達 量 n 1 直 接 法 ： 細 胞 熒 光 素 標 記 的 抗 CD分 子 的 抗 體 4C反 應 30-60min 熒 光 顯 微 鏡 觀

42、察 或 流 式 細 胞 計 分 析 。n 2 間 接 法 ： 細 胞 抗 CD分 子 的 抗 體 4C 反 應 30-60min 熒 光 素 標 記 的 二 抗 4C 反 應 30-60min 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 或 流 式 細胞 計 分 析懸 浮 細 胞 ： 用 PBS洗 二 次 后 再 做 染 色貼 壁 細 胞 ： 先 用 胰 酶 消 化 成 懸 浮 細 胞 再 染 色1 細 胞 膜 CD分 子 的 檢 測 2 Annexin V檢 測 技 術 (檢 測 細 胞 凋 亡 的 一 個 常 規(guī) 指 標 )n 磷 脂 酰 絲 氨 酸 （ Phosphatidylserine, PS） 正

43、 常 位 于 細 胞 膜的 內 側 ， 但 在 細 胞 凋 亡 的 早 期 ， PS可 從 細 胞 膜 的 內 側 翻 轉到 細 胞 膜 的 表 面 ， 暴 露 在 細 胞 外 環(huán) 境 中 。 Annexin-V是 一種 分 子 量 為 3536KD的 Ca2+依 賴 性 磷 脂 結 合 蛋 白 ， 能 與PS高 親 和 力 特 異 性 結 合 。 將 Annexin-V進 行 熒 光 素 （ FITC、PE） 或 biotin標 記 ， 以 標 記 了 的 Annexin-V作 為 熒 光 探 針 ，利 用 流 式 細 胞 儀 或 熒 光 顯 微 鏡 可 檢 測 細 胞 凋 亡 的 發(fā) 生

44、。 原 理 樣 本 處 理 和 染 色 方 法 1 懸 浮 細 胞 的 染 色 ： 將 正 常 培 養(yǎng) 和 誘 導 凋 亡 的 懸 浮 細 胞（ 0.51 106） 用 PBS洗 2次 ， 加 入 100ul Binding Buffer和 FITC標 記 的 Annexin-V（ 20ug/ml） 10ul， 室 溫 避 光 30min， 再 加 入PI（ 50ug/ml） 5ul， 避 光 反 應 5min后 ， 加 入 400ul Binding Buffer， 立 即 用 FACScan進 行 流 式 細 胞 術 定 量 檢 測 （ 一 般 不 超過 1h） ， 同 時 以 不 加 A

45、nnexinV-FITC及 PI的 一 管 作 為 陰 性 對 照 。 2 貼 壁 培 養(yǎng) 的 細 胞 染 色 ： 先 用 0.25%的 胰 酶 消 化 ， 洗 滌 、染 色 和 分 析 同 懸 浮 細 胞 。 3 爬 片 細 胞 染 色 ： 同 上 ， 最 后 用 熒 光 顯 微 鏡 和 共 聚 焦 激 光掃 描 顯 微 鏡 進 行 觀 察 。 （ 二 ） 細 胞 內 蛋 白 分 子 的 檢 測細 胞 內 細 胞 因 子 的 檢 測 、 凋 亡 相 關 蛋 白 TFAR19的 檢 測 等 。操 作 過 程 ：（ 1） 直 接 法 ： 細 胞 3 多 聚 甲 醛 固 定 和 滲 透 化 封 閉

46、 熒 光 素 標 記 的 抗 體 洗 滌 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 或 流 式 細 胞 計 分 析 （ 2） 間 接 法 ： 細 胞 3 多 聚 甲 醛 固 定 和 滲 透 化 封 閉 針 對 蛋 白 的 特 異 抗 體 洗 滌 熒 光 素 標 記 的 二 抗 洗 滌 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 或 流 式 細 胞 計 分 析 凋 亡 相 關 蛋 白 TFAR19蛋 白 的 表 達 和 細 胞 定位 分 析 n TFAR19（ PDCD5） 是 由 本 研 究 室 在 國 際 上 首 先 報 導 的 一 個 擁 有 自己 知 識 產 權 的 人 類 新 基 因 ， 前 期 的 功 能 研 究

47、 表 明 ， 它 是 促 進 細 胞 凋亡 的 增 強 劑 。 利 用 熒 光 素 （ FITC） 標 記 的 TFAR19單 克 隆 抗 體 為 探針 ， 對 細 胞 凋 亡 過 程 中 TFAR19蛋 白 的 表 達 水 平 及 定 位 研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 凋亡 早 期 TFAR19表 達 水 平 增 高 并 出 現(xiàn) 快 速 核 轉 位 現(xiàn) 象 。 同 時 我 們 發(fā) 現(xiàn) ，凋 亡 早 期 TFAR19蛋 白 的 核 轉 位 早 于 磷 脂 酰 絲 氨 酸 （ PS） 外 翻 和 細胞 核 DNA的 片 段 化 ， 提 示 TFAR19蛋 白 的 核 轉 位 是 細 胞 凋 亡 更 早 期

48、 發(fā)生 的 事 件 之 一 。 進 一 步 的 研 究 證 明 ， 凋 亡 早 期 TFAR19的 核 轉 位 具 有普 遍 意 義 ， 不 同 細 胞 凋 亡 早 期 均 出 現(xiàn) TFAR19高 表 達 和 核 轉 位 。 這 為研 究 細 胞 凋 亡 早 期 所 發(fā) 生 的 事 件 ， 提 供 了 一 種 新 的 技 術 和 指 標 。 n 1 懸 浮 細 胞 的 染 色 ： （ 1） 收 獲 正 常 和 誘 導 凋 亡 的 細 胞 （ 0.51 106） ， PBS洗 2次 ， （ 2） 3%多 聚 甲 醛 冰 浴 10min， PBS洗 2次 ， 1000rpm10min。 （ 3）

49、加 入 PBS-T溶 液 ， 37 C孵 育 15min， PBS洗 2次 ，n （ 4） 加 入 200ml胎 牛 血 清 ， 室 溫 反 應 30min。 （ 5） 加 入 FITC標 記 的 TFAR19單 抗 ， 4 C反 應 30min （ 6） 熒 光 細 胞 洗 液 洗 2次 ， 熒 光 顯 微 鏡 及 共 聚 焦 激 光 顯 微 鏡 下 觀 察TFAR19在 細 胞 中 的 定 位 。 同 時 用 流 式 細 胞 計 定 量 檢 測 TFAR19蛋 白 的 平 均 熒光 強 度 。 2： 貼 壁 細 胞 的 原 位 染 色 （ 1） 貼 壁 生 長 的 對 數 期 細 胞 鋪

50、在 24孔 或 6孔 板 中 （ 內 有 潔 凈 蓋 玻 片 ） ，讓 其 爬 片 生 長 ， 待 長 到 50%80%滿 時 ， 凋 亡 誘 導 劑 處 理 細 胞 。 （ 2） 將 不 同 時 間 點 處 理 的 細 胞 進 行 免 疫 熒 光 染 色 ， 染 色 步 驟 同 上 。 （ 3） 將 染 色 的 爬 片 細 胞 放 于 一 張 滴 有 少 量 甘 油 （ 5ul） 的 載 玻 片 上 ，熒 光 顯 微 鏡 或 共 聚 焦 激 光 掃 描 顯 微 鏡 觀 察 TFAR19在 細 胞 中 的 定 位 。 n原理：n是指酶標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的成

51、色反應，對相應的抗原進行定性、定位和定量測定的一項技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙的結合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在原位顯示相應的基因和基因表達產物。四 免 疫 組 織 化 學 技 術 免 疫 組 化 染 色 技 術 的 分 類n 免 疫 熒 光 法 （ Immunofluorescence technique）n 免 疫 酶 法 （ Immunoperoxidase technique）n 免 疫 金 銀 法 （ （ Immunogold techni

52、que）n ABC法 （ Avidin-Biotin Complex） 五 蛋 白 質 與 蛋 白 質 相 互 作 用 的 研 究 技 術 1 GST融 合 蛋 白 進 行 Pulldow實 驗 （ 1） 原 理 細 菌 表 達 的 谷 胱 甘 肽 s 轉 移 酶 （ GST） 融 合 蛋 白 主 要 用于 蛋 白 的 親 和 純 化 ， 也 可 以 將 GST融 合 蛋 白 作 為 探 針 ， 與溶 液 中 的 特 異 性 搭 檔 蛋 白 結 合 ， 然 后 根 據 谷 胱 甘 肽 瓊 脂糖 球 珠 能 夠 沉 淀 GST融 合 蛋 白 的 能 力 來 確 定 相 互 作 用 的 蛋白 。

53、一 般 在 得 到 目 標 蛋 白 的 抗 體 前 ， 或 發(fā) 現(xiàn) 抗 體 干 擾 蛋白 質 蛋 白 質 之 間 的 相 互 作 用 時 ， 可 以 啟 用 GST沉 降 技 術 。該 方 法 只 是 用 于 確 定 體 外 的 相 互 作 用 。 兩 種 應 用 ： 1） 確 定 融 合 （ 或 探 針 ） 蛋 白 與 未 知 （ 或 靶 ） 蛋 白 間 的 新 的 相 互 作 用 2） 證 實 探 針 蛋 白 與 已 知 蛋 白 質 間 可 疑 的 相 互 作 用 （ 2） 方 法 ： 1） GST融 合 蛋 白 先 與 下 列 蛋 白 溶 液 之 一 孵 育 （ a, 單 一 明 確 的

54、 重 組蛋 白 ； b， 細 胞 裂 解 蛋 白 混 合 液 ； c, 體 外 翻 譯 cDNA表 達 得 到 的 未知 蛋 白 ） 2） 混 合 液 與 谷 胱 甘 肽 瓊 脂 糖 球 珠 反 應 4C 2h 3） 離 心 棄 上 清 4） 沉 淀 加 入 2 蛋 白 Loading Buffer煮 沸 ， 離 心 5） 取 上 清 進 行 SDS-PAGE電 泳 ， 6） 考 馬 氏 亮 蘭 染 色 觀 察 特 異 沉 降 的 蛋 白 帶 ， 進 一 步 做 質 譜 分 析 確 定 沉 降 的 蛋 白 ； 電 泳 后 的 膠 也 可 以 做 Western Blot來 確 定 沉 降 的蛋

55、 白 中 是 否 有 目 的 蛋 白 該 實 驗 設 立 GST對 照 ， 反 應 均 在 4C進 行 GST-Pulldown Assay 2 免 疫 共 沉 淀n （ 1） 原 理n 當 細 胞 在 非 變 性 條 件 下 被 裂 解 時 ， 完 整 細 胞 內 存 在 的許 多 蛋 白 質 蛋 白 質 間 的 相 互 作 用 被 保 留 了 下 來 。 如果 用 蛋 白 質 X的 抗 體 免 疫 沉 淀 X， 那 么 與 X在 體 內 結 合 的蛋 白 質 Y也 能 沉 淀 下 來 。 這 種 方 法 常 用 于 測 定 兩 種 目 標蛋 白 質 是 否 在 體 內 結 合 ， 也 可

56、用 于 確 定 一 種 特 定 蛋 白質 的 新 的 作 用 搭 檔 n 缺 點 ： 可 能 檢 測 不 到 低 親 和 力 和 瞬 間 的 蛋 白 質 蛋 白 質 相 互 作 用 免 疫 共 沉 淀 檢 測 蛋 白 質 的 原 理 和 常 見 問 題 （ 2） 方 法n 1) 收 獲 培 養(yǎng) 的 細 胞 （ 1 107 1 108） 冷 PBS洗 滌 2次n 2） 細 胞 裂 解 液 裂 解 細 胞 ， 冰 浴 30minn 3) 12000rpm 離 心 30minn 4） 收 集 上 清 并 加 入 適 量 抗 體 ， 4C搖 動 1hn 5） 加 入 ProteinG-Sepharos

57、e懸 液 ， 4C搖 動 1hn 6） 細 胞 裂 解 液 洗 滌 ProteinG-Sepharose混 合 液n 7） 離 心 棄 上 清 n 8） 沉 淀 加 2 蛋 白 Loading Buffer煮 沸 5 10minn 9） 離 心 ， 上 清 液 跑 SDS-PAGE 膠n 10） 考 馬 氏 亮 蘭 染 色 、 銀 染n Western Blot 質 譜 分 析 （ 3） 注 意 的 問 題n 1） 細 胞 裂 解n 采 用 溫 和 的 裂 解 條 件 ， 不 能 破 壞 細 胞 內 存 在 的 所 有 蛋 白 質 蛋 白 質 相 互 作 用 ， 多 采 用 非 離 子 變 性

58、 劑 （ NP40或 Triton X-100)。 每 種 細 胞 的裂 解 條 件 是 不 一 樣 的 ， 通 過 經 驗 確 定 。 不 能 用 高 濃 度 的 變 性 劑 （ 0.2 SDS)， 細 胞 裂 解 液 中 要 加 各 種 酶 抑 制劑 ， 如 商 品 化 的 cocktailer。 n 2） 使 用 明 確 的 抗 體 ， 可 以 將 幾 種 抗 體 共 同 使 用n 3） 使 用 對 照 抗 體 ： 單 克 隆 抗 體 ： 正 常 小 鼠 的 IgG或 另 一 類 單 抗 兔 多 克 隆 抗 體 ： 正 常 兔 IgGn n（1）原理：n將編碼某一蛋白X的DNA序列與DN

59、A結合域BD的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個雜交體，當兩個雜交體共轉化酵母細胞（此酵母細胞上游有DNA結合位點的報告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨不能激活報告基因的轉錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個有效的轉錄激活子，激活報告基因的轉錄。因此可通過檢測報告基因的轉錄來研究蛋白質X和Y的相互作用。 3 酵母雙雜交系統(tǒng) 雙雙雙雜雜雜交交交系系系統(tǒng)統(tǒng)統(tǒng)的的的原原原理理理 LacZGal4激 活 域Gal4結 合 域Gal4結 合 域 LacZLacZGal4激 活 域 LacZGal4激 活 域Gal4結 合

60、域XYXY 1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質基因與BD基因構建成“誘餌”表達質粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構建成“獵物”基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cDNA序列，并推測其蛋白質序列。 用 途 4 蛋 白 質 芯 片n 其 制 作 原 理 類 似 于 基 因 芯 片 ， 所 不 同 的 是 ， 蛋 白 、 多肽 芯 片 所 用 的 樣 品 是 提 純 的 蛋 白 、 多 肽 。 其

61、檢 測 的 原理 類 似 于 抗 原 、 抗 體 檢 測 的 ELISA法 。 如 采 用 雙 抗 夾 心的 形 式 ， 可 通 過 機 械 點 涂 的 方 法 ， 將 多 種 不 同 的 單 克隆 抗 體 點 樣 固 定 在 固 相 介 質 表 面 ， 如 PVDF膜 上 ， 制 備成 抗 體 蛋 白 芯 片 ， 與 制 備 的 多 種 抗 原 樣 本 雜 交 、 結 合 ，芯 片 上 的 抗 體 捕 獲 相 應 的 抗 原 ， 然 后 再 與 標 記 的 多 種不 同 的 抗 體 雜 交 ， 由 于 抗 原 具 有 多 價 結 合 表 位 而 結 合標 記 抗 體 ， 根 據 雜 交 信 號 的 有 無 、 多 少 而 進 行 定 性 、定 量 的 分 析 。