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1、1.2 基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非 編 碼 區(qū) 非 編 碼 區(qū)編 碼 區(qū)編 碼 區(qū) 上 游 編 碼 區(qū) 下 游 與 RNA聚 合 酶 結(jié) 合 位 點(diǎn)啟 動(dòng) 子 終 止 子編 碼 區(qū) ： 能 轉(zhuǎn) 錄 ， 編 碼 蛋 白 質(zhì)非 編 碼 區(qū) ： 不 編 碼 蛋 白 質(zhì) ,能 調(diào) 控 遺 傳 信 息 表 達(dá) 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編 碼 區(qū)非 編 碼 區(qū) 非 編 碼 區(qū)啟 動(dòng) 子 終 止 子編 碼 區(qū) 上 游 編 碼 區(qū) 下 游 內(nèi) 含 子 外 顯 子 與 RNA聚 合 酶結(jié) 合 位 點(diǎn)編 碼 區(qū) ：非 編 碼 區(qū) ： 外 顯 子 ： 內(nèi) 含 子 ： 能 編 碼 蛋

2、白 質(zhì) 的 序 列不 能 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 序 列 非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子啟動(dòng)子原核真核基因的結(jié)構(gòu) 原 核 細(xì) 胞 真 核 細(xì) 胞不 同 點(diǎn) 編 碼 區(qū) 是_的 編 碼 區(qū) 是 間 隔 的 、_的相 同 點(diǎn) 都 由 能 夠 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 _和 具有 調(diào) 控 作 用 的 _區(qū) 組 成 的 基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 目 的 基 因 主 要 是 指 _編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 基 因供 體 生 物 細(xì) 胞取 出 DNA用 限 制 酶 剪去 多 余 部 分目 的 基 因即 ： 將 需 要 的 基 因 從 供 體 生 物 細(xì) 胞 內(nèi)

3、提 取 出 來 目 前 被 廣 泛 提 取 使用 的 目 的 基 因 有 ： 蘇云 金 桿 菌 抗 蟲 基 因 、植 物 抗 病 基 因 人 胰 島素 基 因 等 。 也 可 以 是一 些 具 有 調(diào) 控 作 用 的因 子 l 從 基 因 文 庫 中 獲 取 目 的 基 因1.什 么 是 基 因 文 庫 ？2.怎 樣 從 基 因 文 庫 中 得 到 我 們 所 需 的 目 的 基 因 ？種 類 ： 基 因 組 文 庫 ：部 分 基 因 文 庫 ：(如 cDNA文 庫 ) 基 因 的 核 苷 酸 序 列 等l 利 用 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 目 的 基 因l 人 工 合 成 含 有 一 種 生 物

4、 的 全 部 基 因含 有 一 種 生 物 的 部 分 基 因根 據(jù) 基 因 的 有 關(guān) 信 息 ： 如 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 mRNA 1.用 一 定 的 _切 割 質(zhì) 粒 ， 使 其 出 現(xiàn) 一 個(gè) 切 口 ， 露 出 _。2.用 _切 斷 目 的 基 因 ， 使 其 產(chǎn) 生 _ _。 核 心3.將 切 下 的 目 的 基 因 片 段 插 入 質(zhì) 粒 的 _處 ， 再 加 入 適 量 _， 形 成 了 一 個(gè) 重 組 DNA分 子 （ 重 組 質(zhì) 粒 ）限 制 酶黏 性 末 端同 一 種 限 制 酶的 黏 性 末 端 切 口DNA連 接 酶相 同(二 )基 因 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu)

5、 建 質(zhì) 粒 DNA分 子限 制 酶 處 理一 個(gè) 切 口兩 個(gè) 黏 性 末 端 兩 個(gè) 切 口獲 得 目 的 基 因DNA連 接 酶重 組 DNA分 子 （ 重 組 質(zhì) 粒 ） 核 心同 一 種(二 )基 因 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建4.過 程 : 科 學(xué) 家 在 培 育 抗 蟲 棉 時(shí) ， 經(jīng) 過 了 許 多 復(fù) 雜 的過 程 和 不 懈 的 努 力 ， 才 獲 得 成 功 。 起 初 把 蘇 云 金 芽 孢 桿 菌 的 抗 蟲 基 因 插 入 載 體質(zhì) 粒 中 ， 然 后 導(dǎo) 入 棉 花 的 受 精 卵 中 ， 結(jié) 果 抗 蟲 基因 在 棉 花 體 內(nèi) 沒 有 表 達(dá) 。 然 后 在

6、插 入 抗 蟲 基 因 的 質(zhì) 粒 中 插 入 啟 動(dòng) 子 (抗蟲 基 因 首 端 )， 導(dǎo) 入 棉 花 受 精 卵 ， 長(zhǎng) 成 的 棉 花 植 株還 是 沒 有 抗 蟲 能 力 。 科 學(xué) 家 又 在 有 啟 動(dòng) 子 、 抗 蟲基 因 的 質(zhì) 粒 中 插 入 終 止 子 (抗 蟲 基 因 末 端 )， 導(dǎo) 入棉 花 受 精 卵 ， 結(jié) 果 成 長(zhǎng) 的 植 株 ， 有 了 抗 蟲 能 力 。 目 的 ： 使 目 的 基 因 在 受 體 細(xì) 胞 中 穩(wěn) 定 存在 ， 并 且 可 以 遺 傳 給 下 一 代 ， 同 時(shí) 使 目的 基 因 能 夠 表 達(dá) 和 發(fā) 揮 作 用 。a、 目 的 基 因b

7、、 啟 動(dòng) 子c、 終 止 子d、 標(biāo) 記 基 因 (三 )將 目 的 基 因 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞轉(zhuǎn) 化 目 的 基 因 進(jìn) 入 _內(nèi) ， 并 且 在 受 體 細(xì) 胞 內(nèi) 維 持 _和 _的 過 程受 體 細(xì) 胞穩(wěn) 定 表 達(dá) 方 法 導(dǎo) 入 植 物 細(xì) 胞導(dǎo) 入 動(dòng) 物 細(xì) 胞導(dǎo) 入 微 生 物 細(xì) 胞 農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn) 化 法基 因 槍 法花 粉 管 通 道 法顯 微 注 射 法 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 吸 收DNA分 子(三 )將 目 的 基 因 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 (四 )目 的 基 因 的 檢 測(cè) 與 鑒 定 檢 查 是 否 成 功檢 測(cè) 鑒 定 檢 測(cè) 轉(zhuǎn) 基 因 生 物 染 色

8、 體 的 DNA 上 是 否 插 入 了 目 的 基 因 檢 測(cè) 目 的 基 因 是 否 轉(zhuǎn) 錄 出 了 mRNA 檢 測(cè) 目 的 基 因 是 否 翻 譯 成 蛋 白 質(zhì)抗 蟲 鑒 定 、 抗 病 鑒 定 、 活 性 鑒 定 等方 法 方 法 方 法 DNA分 子 雜 交分 子 雜 交抗 原 -抗 體 雜 交 直 接 分 離 法 :2. 構(gòu) 建 基 因 文 庫 直 接 分 離 法 ：供 體 細(xì) 胞 中 的 DNA許 多 DNA片 段運(yùn) 載 體限 制 酶分 別 與 載 體 連 接受 體 細(xì) 胞分 別 導(dǎo) 入2. 構(gòu) 建 基 因 文 庫 mRNA 反 轉(zhuǎn) 錄cDNA(互 補(bǔ) DNA） DNA聚 合

9、 酶雙 鏈 DNA 反 轉(zhuǎn) 錄 法 ：2. 構(gòu) 建 基 因 文 庫 cDNA合 成 過 程 第 一 步 ， 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 以 RNA為 模 板 合 成 一 條 與 RNA互 補(bǔ)的 DNA單 鏈 ， 形 成 RNA-DNA雜 交 分 子 。 第 二 步 ， 核 酸 酶 H使 RNA-DNA雜 交 分 子 中 的 RNA鏈降 解 ， 使 之 變 成 單 鏈 的 DNA。 第 三 步 ， 以 單 鏈 DNA為 模 板 ， 在 DNA聚 合 酶 的 作 用 下合 成 另 一 條 互 補(bǔ) 的 DNA鏈 ， 形 成 雙 鏈 DNA分 子 。 文 庫 類 型 cDNA文 庫 基 因 組 文 庫文 庫 大

10、小 小 大基 因 中 啟 動(dòng) 子 無 有基 因 中 內(nèi) 含 子 無 有基 因 多 少 某 種 生 物 的 部 分 基 因 某 種 生 物 的 全 部 基 因物 種 之 間 的 基因 交 流 可 以 部 分 基 因 可 以說 明 基 因 文 庫 的 組 建 過 程 就 包 含 基 因 工 程 的 基 本 操作 步 驟 。 從 基 因 文 庫 中 獲 取 目 的 基 因 的 優(yōu) 點(diǎn) 是操 作 簡(jiǎn) 便 ， 缺 點(diǎn) 是 工 作 量 大 ， 具 有 一 定 的 盲 目性 . 依 據(jù) ： 目 的 基 因 的 有 關(guān) 信 息 。如 ： 根 據(jù)基 因 的 核 苷 酸 序 列基 因 的 功 能 、 基 因 在

11、染 色 體 上 的 位 置基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 mRNA基 因 的 表 達(dá) 產(chǎn) 物 蛋 白 質(zhì) 等 特 性 。3 如 何 從 基 因 文 庫 中 得 到 所 需 要 的 基 因 ？ 利 用 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 目 的 基 因原 理 :DNA雙 鏈 復(fù) 制前 提 :要 有 一 段 已 知目 的 基 因 的 脫氧 核 苷 酸 序 列 ，以 便 合 成 引 物 。 概 念 ： PCR全 稱 為 _， 是 一 項(xiàng) 在 生 物 _復(fù) 制 _的 核 酸 合 成 技 術(shù) 條 件 ： _、 _、 _ 、 _.前 提 條 件 ： 原 理 ： _ 方 式 ： 以 _方 式 擴(kuò) 增 ， 即 _（ n為 擴(kuò)

12、增循 環(huán) 的 次 數(shù) ） 結(jié) 果 ： 選 修 1 P60聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)體 外 特 定 DNA片 段DNA雙 鏈 復(fù) 制已 知 基 因 的 核 苷 酸 序 列四 種 脫 氧 核 苷 酸 一 對(duì) 引 物DNA聚 合 酶 指 數(shù) 2n使 目 的 基 因 的 片 段 在 短 時(shí) 間 內(nèi) 成 百 萬 倍 地 擴(kuò) 增利 用 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 目 的 基 因 過 程 ：a、 DNA變 性 （ 90 -95 ） ： 雙 鏈 DNA模 板 在 熱 作 用 下 ， _斷 裂 ， 形 成 _b、 退 火 （ 復(fù) 性 55 -65 ） ： 系 統(tǒng) 溫 度 降 低 ， 引 物 與 DNA模 板 結(jié) 合

13、， 形 成 局 部 _。 c、 延 伸 （ 70 -75 ） ： 在 Taq酶 的 作 用 下 ， 從 引 物 的 5 端 3 端 延 伸 ， 合 成 與 模 板 互 補(bǔ) 的 _。 氫 鍵 單 鏈 DNA雙 鏈DNA鏈 利 用 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 目 的 基 因 PCR技 術(shù) 擴(kuò) 增 過 程a、 DNA變 性 （ 90 -95 ） ： 雙 鏈 DNA模 板 在 熱 作 用 下 ， 斷 裂 ， 形 成 _ b、 復(fù) 性 （ 55 -60 ） ： 系 統(tǒng) 溫 度 降 低 ， 引 物 與 DNA模 板 結(jié) 合 ， 形 成 局 部 _。 c、 延 伸 （ 70 -75 ） ： 在 Taq酶 的 作

14、用下 ， 從 引 物 的 5 端 3 端 延 伸 ， 合 成 與模 板 互 補(bǔ) 的 _。 氫 鍵 單 鏈 DNA雙 鏈DNA鏈 PCR技 術(shù) DNA復(fù) 制過 程 DNA變 性 （ 90 95 ） 退 火（ 復(fù) 性 5560 ） 子 鏈 延 伸（ 7075 ） 重 復(fù) 循 環(huán) DNA復(fù) 制 起 始 ， RNA引 物 形 成 DNA片 段 生 成 RNA引 物 水 解 完 整 的 DNA分 子 形 成相 同點(diǎn) 原 則 堿 基 互 補(bǔ) 配 對(duì)條 件 模 板 、 原 料 （ dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP） 、 能 量 、 酶 、 引 物 等不 同點(diǎn) 解 旋 方式 氫 鍵 在 高 溫 下

15、 斷裂 ， 雙 鏈 全 部 解開 解 旋 酶 催 化 氫 鍵 逐 步 斷 裂場(chǎng) 所 體 外 主 要 在 細(xì) 胞 核 中引 物 DNA RNA酶 熱 穩(wěn) 定 DNA聚 合 酶（ Taq酶 ） 解 旋 酶 、 DNA聚 合 酶 、 DNA連 接 酶 等 結(jié) 果 在 短 時(shí) 間 內(nèi) 形 成大 量 的 DNA片 段 形 成 完 整 的 DNA分 子 2.微 生 物 作 受 體 細(xì) 胞 原 因 ：將 目 的 基 因 導(dǎo) 入 微 生 物 細(xì) 胞3.轉(zhuǎn) 化 方 法 ：大 腸 桿 菌繁 殖 快 、 多 為 單 細(xì) 胞 、 遺 傳 物 質(zhì) 相 對(duì) 少處 理 細(xì) 胞 細(xì) 胞 表 達(dá) 載 體 與 感 受 態(tài) 細(xì) 胞

16、 混 合 _細(xì)胞 吸 收 DNA分 子 。Ca2+ 感 受 態(tài)感 受 態(tài)1.常 用 菌 ： 目 的 基 因 插 入 Ti質(zhì) 粒 的 T-DNA上 農(nóng) 桿 菌 導(dǎo) 入 植 物 細(xì) 胞 整 合 到 受 體 細(xì) 胞 的 染 色 體 上 目 的 基 因 的 遺 傳 特 性 得 以 維 持 穩(wěn) 定 和 表 達(dá) 1.農(nóng) 桿 菌 特 點(diǎn) ： 易 感 染 雙 子 葉 植 物 和 裸 子 植 物 。Ti質(zhì) 粒 的 T-DNA可 轉(zhuǎn) 移 至 受 體 細(xì) 胞 的 染 色 體 上2.轉(zhuǎn)化 細(xì) 胞類 型 常 用 方 法 受 體 細(xì)胞 轉(zhuǎn) 化 過 程植 物細(xì) 胞 農(nóng) 桿 菌 轉(zhuǎn)化 法 體 細(xì) 胞 將 目 的 基 因 插

17、入 Ti質(zhì) 粒 的 T-DNA上 轉(zhuǎn) 入 農(nóng) 桿 菌 導(dǎo) 入 植 物 細(xì) 胞 整合 到 受 體 細(xì) 胞 的 DNA動(dòng) 物細(xì) 胞 顯 微 注 射技 術(shù) 受 精 卵 將 含 有 目 的 基 因 的 表 達(dá) 載 體 提 純 取 卵 受 精 卵 顯 微 注 射 早 期 胚胎 培 養(yǎng) 胚 胎 移 植 發(fā) 育 成 為 具 有新 性 狀 的 動(dòng) 物微 生物 細(xì)胞 Ca2+處 理法 原 核 細(xì)胞 用 Ca2+處 理 細(xì) 胞 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 重組 表 達(dá) 載 體 DNA分 子 與 感 受 態(tài) 細(xì) 胞混 合 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 吸 收 DNA分 子 檢 測(cè)步 驟 目 的 方 法 原 理 工 具 現(xiàn) 象1 DN

18、A分 子雜 交 技 術(shù) 堿 基 互補(bǔ) 配 對(duì) 放 射 性 同 位 素 作標(biāo) 記 的 含 目 的 基因 的 DNA片 段 雜 交 帶2 檢 測(cè) 目 的 基 因 是否 轉(zhuǎn) 錄 出 了 mRNA DNA分 子雜 交 技 術(shù) 堿 基 互補(bǔ) 配 對(duì) 放 射 性 同 位 素 作標(biāo) 記 的 含 目 的 基因 的 DNA片 段 雜 交 帶3 檢 測(cè) 目 的 基 因 是否 翻 譯 成 蛋 白 質(zhì) 抗 原 -抗體 雜 交 抗 體 的專 一 性 特 定 抗 體 雜 交 帶 (陽性 反 應(yīng) ) 2、 下 列 屬 于 獲 取 目 的 基 因 的 方 法 的 是 ( ) 利 用 mRNA反 轉(zhuǎn) 錄 形 成 從 基 因 組

19、 文 庫 中 提 取 從 受 體 細(xì) 胞 中 提 取 利 用 PCR技 術(shù) 利 用 DNA轉(zhuǎn) 錄 人 工 合 成A. B. C. D. 1、 在 基 因 工 程 中 ， 把 選 出 的 目 的 基因 （ 共 1000個(gè) 脫 氧 核 苷 酸 對(duì) ， 其 中 腺 嘌 嶺脫 氧 核 苷 酸 是 460個(gè) ） 放 入 DNA擴(kuò) 增 儀 中 擴(kuò)增 4代 ， 那 么 ， 在 擴(kuò) 增 儀 中 應(yīng) 放 入 胞 嘧 啶脫 氧 核 苷 酸 的 個(gè) 數(shù) 是 （ ） 個(gè)A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560 3.細(xì) 菌 的 質(zhì) 粒 分 子 帶 有 一 個(gè) 抗 菌 素 抗 性 基 因 ， 該 抗

20、性 基 因 在 基 因 工 程 中 的 主 要 作 用 是 A 提 高 受 體 細(xì) 胞 在 自 然 環(huán) 境 中 的 耐 藥 性 B 有 利 于 對(duì) 目 的 基 因 是 否 導(dǎo) 入 進(jìn) 行 檢 測(cè)C 增 加 質(zhì) 粒 分 子 的 分 子 量D 便 于 與 外 源 基 因 連 接4. 有 關(guān) 基 因 工 程 的 敘 述 正 確 的 是A 限 制 酶 只 在 獲 得 目 的 基 因 時(shí) 才 用B 重 組 質(zhì) 粒 的 形 成 是 在 細(xì) 胞 內(nèi) 完 成 的C 質(zhì) 粒 都 可 作 為 運(yùn) 載 體 D 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 可 為 合 成 目 的 基 因 提 供 資 料 5.哪 項(xiàng) 不 是 基 因 表 達(dá)

21、 載 體 的 組 成 部 分 ( ) A.啟 動(dòng) 子 B.終 止 密 碼 C.標(biāo) 記 基 因 D.目 的 基 因6. (2008,全 國(guó) 高 考 )已 知 某 種 限 制 酶 在 一 線 性 DNA分 子 上 有 3個(gè) 酶 切 位 點(diǎn) 。 如 果 該 線 性 DNA分 子 在 3個(gè)酶 切 位 點(diǎn) 上 都 被 該 酶 切 斷 ， 則 會(huì) 產(chǎn) 生 a、 b、 c、 d四 種 不 同 長(zhǎng) 度 的 DNA片 段 。 現(xiàn) 有 多 個(gè) 上 述 線 性 DNA分 子 ， 若 在 每 個(gè) DNA分 子 上 至 少 有 1個(gè) 酶 切 位 點(diǎn) 被該 酶 切 斷 ， 則 從 理 論 上 講 ， 經(jīng) 該 酶 酶 切 后 ， 這 些線 性 DNA分 子 最 多 能 產(chǎn) 生 長(zhǎng) 度 不 同 的 DNA片 段 種 數(shù)是