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1、定 量 PCR技 術(shù) 李 文 亭 簡 單 介 紹v什 么 是 PCRvPCR的 工 作 原 理vPCR的 基 本 反 應(yīng) 步 驟vPCR的 用 處v解 鏈 溫 度 定 量 PCR 理 論 部 分 相 對 RT-PCR 定 量 RT-PCR定 量 PCR 競 爭 性 RT-PCR 實 時 定 量 PCR 定 量 PCR實 驗 部 分 實 驗 準 備 ： 實 驗 器 具 與 材 料 實 驗 器 具 的 處 理 與 準 備 試 劑 的 配 制 定 量 PCR實 驗 部 分實 驗 操 作 設(shè) 計 PCR反 應(yīng) 引 物 細 胞 的 培 養(yǎng) 與 收 集 總 RNA的 提 取 RNA完 整 性 檢 測 -N

2、orthern印 跡 技 術(shù) RNA純 度 檢 測 合 成 cDNA的 引 物 的 選 擇 反 轉(zhuǎn) 錄 為 cDNA PCR反 應(yīng) The End 設(shè) 計 PCR反 應(yīng) 引 物三 條 基 本 原 則引 物 設(shè) 計 軟 件引 物 濃 度 要 求 總 RNA的 提 取v異 硫 氰 酸 胍 /氯 化 銫 超 速 離 心 法 制 備 RNA v使 用 Trizol純 化 RNA v熱 酚 法 v氯 化 鋰 -尿 素 法 v利 用 Marligen總 RNA快 速 純 化 系 統(tǒng) 純 化 總 RNAv利 用 Ambion的 Mitropoly(a)Pure試 劑 盒 分 離mRNA RNA完 整 性 檢

3、 測Northern印 跡 原 理 Northern印 跡 技 術(shù) 是 分 析 RNA的 一 種 方 法 ，該 技 術(shù) 可 定 量 分 析 某 一 特 異 基 因 轉(zhuǎn) 錄 的 強 度 ，根 據(jù) 其 遷 移 的 位 置 也 可 判 斷 基 因 轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn) 物 的大 小 。 該 技 術(shù) 常 用 于 基 因 表 達 的 調(diào) 控 、 基 因結(jié) 構(gòu) 與 功 能 、 遺 傳 變 異 及 病 理 研 究 。Northern印 跡 步 驟 瓊 脂 凝 膠 電 泳 、 轉(zhuǎn) 移 、 預(yù) 雜 交 、 雜 交 、 漂 洗 、放 射 自 顯 影 RNA純 度 檢 測v待 測 核 酸 以 水 為 溶 劑 并 作 適 當(dāng)

4、稀 釋 （ 這 里 稀釋 400 倍 ： 5 l RNA 樣 品 +1995 l蒸 餾 水 ） ，使 用 1cm 光 程 的 石 英 比 色 杯 ， 以 水 調(diào) 好 儀 器的 零 點 ， 然 后 測 定 并 記 錄 樣 品 液 在 280，260nm 處 的 吸 光 度 。 以 估 算 RNA 的 純 度 和 濃度 。vOD260/OD280在 1.8-2.0時 ， 認 為 RNA 中 蛋 白或 者 時 其 他 有 機 物 的 污 染 可 以 容 忍 。 合 成 cDNA的 引 物 的 選 擇v 1） 隨 機 六 聚 體 引 物 ： 當(dāng) 特 定 mRNA 由 于 含 有 使 反 轉(zhuǎn)錄 酶 終

5、止 的 序 列 而 難 于 拷 貝 其 全 長 序 列 時 ， 可 采 用隨 機 六 聚 體 引 物 這 一 不 特 異 的 引 物 來 拷 貝 全 長mRNA。 。v 2） Oligo(dT)： 是 一 種 對 mRNA 特 異 的 方 法 。 因 絕 大多 數(shù) 真 核 細 胞 mRNA具 有 3 端 Poly(A+)尾 ， 此 引 物 與其 配 對 ， 僅 mRNA 可 被 轉(zhuǎn) 錄 。v 3） 特 異 性 引 物 ： 最 特 異 的 引 發(fā) 方 法 是 用 含 目 標 RNA 的 互 補 序 列 的 寡 核 苷 酸 作 為 引 物 。 PCR反 應(yīng)v相 對 RT-PCR的 PCR擴 增 v

6、競 爭 性 RT-PCR的 PCR擴 增 v實 時 定 量 PCR擴 增 操 作 相 對 RT-PCR的 PCR擴 增 相 對 RT-PCR的 實 驗 過 程 有 三 個 關(guān) 鍵 步 驟 ： 1） 選 擇 一 種 定 量 方 法 ： 溴 化 乙 錠 染 色 ， 或者 放 射 自 顯 影 -閃 爍 計 數(shù) 儀 ， 或 者 用 磷 光 攝 像儀 定 量 。 2） 相 對 RT-PCR要 確 定 其 擴 增 的 線 性 范 圍 ：復(fù) 制 的 PCR產(chǎn) 物 每 隔 一 個 循 環(huán) 從 熱 循 環(huán) 儀 中 取出 并 收 集 ， 通 過 用 產(chǎn) 物 的 量 （ 取 對 數(shù) ） 對 循環(huán) 數(shù) 作 圖 ， 其

7、 線 性 范 圍 是 一 條 直 線 。下 一 頁 3） 相 對 RT-PCR的 內(nèi) 對 照 一 般 用 看 家 基 因 ，這 樣 可 使 對 樣 品 進 行 處 理 和 變 換 細 胞 類 型 時 ，內(nèi) 對 照 的 表 達 不 受 影 響 。 其 次 要 求 內(nèi) 對 照 的表 達 水 平 要 與 目 的 轉(zhuǎn) 錄 本 的 表 達 水 平 相 似 ，這 可 以 在 擴 增 體 系 中 添 加 競 爭 子 來 削 弱 看 家基 因 的 信 號 。 競 爭 子 是 一 些 經(jīng) 過 修 飾 無 法 延伸 的 引 物 。 通 過 實 驗 確 定 引 物 ： 競 爭 子 的 比例 來 模 擬 目 的 轉(zhuǎn)

8、錄 本 的 量 ， 一 旦 這 一 比 例 被確 定 ， 他 就 可 以 和 線 性 范 圍 的 循 環(huán) 參 數(shù) 一 起對 RNA樣 品 中 的 轉(zhuǎn) 錄 本 的 量 進 行 定 量 。下 一 頁 樣 品 和 內(nèi) 對 照 同 時 進 行 單 鏈 cDNA合 成 反 應(yīng) ，之 后 加 入 到 反 應(yīng) 管 中 同 時 進 行 PCR的 擴 增 ， 然后 用 變 形 凝 膠 來 分 析 實 驗 結(jié) 果 。 定 量 樣 品 PCR產(chǎn) 物 的 相 對 含 量 ， 可 以 用 基 因 特 異 性 產(chǎn) 物 的信 號 除 以 內(nèi) 對 照 的 信 號 ， 從 而 可 以 得 到 每 個樣 品 中 基 因 特 異

9、產(chǎn) 物 的 準 確 相 對 值 。 這 些 值可 以 用 來 比 較 樣 品 間 模 板 RNA的 相 對 表 達 量 。返 回 競 爭 性 RT-PCR的 PCR擴 增 競 爭 性 RT-PCR的 關(guān) 鍵 步 驟 是 人 工 競 爭 子 的 合 成和 純 化 。 競 爭 子 與 目 的 的 內(nèi) 源 轉(zhuǎn) 錄 本 幾 乎 一 樣 ， 只是 為 了 辨 別 在 設(shè) 計 時 刪 除 了 一 小 部 分 。 競 爭 子 是 設(shè)計 用 于 反 轉(zhuǎn) 錄 和 PCR擴 增 的 RNA分 子 ， 與 目 的 內(nèi) 源 轉(zhuǎn)錄 本 具 有 相 同 的 效 率 。 接 下 來 是 競 爭 子 RNA的 合 成 、 純

10、 化 和 定 量 。 之 后是 對 樣 品 進 行 拷 貝 數(shù) 的 評 估 。 要 先 進 行 預(yù) 實 驗 。 即模 板 與 梯 度 稀 釋 （ 102） 的 競 爭 性 RNA轉(zhuǎn) 錄 本 同 時 進行 PCR擴 增 反 應(yīng) 。 由 于 設(shè) 計 時 競 爭 子 具 有 與 目 的 基 因同 樣 的 反 應(yīng) 動 力 學(xué) ， 可 以 與 目 的 基 因 共 同 擴 增 ， 而且 在 每 個 反 應(yīng) 中 樣 品 和 競 爭 子 PCR產(chǎn) 物 的 量 可 以 直 接比 較 。 競 爭 子 獲 得 的 PCR產(chǎn) 物 的 強 度 與 來 自 于 內(nèi) 源RNA轉(zhuǎn) 錄 本 的 擴 增 相 抑 制 ， 同 等

11、強 度 代 表 RNA樣 品 中存 在 的 內(nèi) 源 信 息 。 下 一 頁 之 后 ， 將 選 擇 出 的 拷 貝 數(shù) 2倍 梯 度 稀 釋 重 復(fù) 上述 過 程 ， 以 便 在 數(shù) 據(jù) 上 得 到 更 高 的 分 辨 率 。 為 了 對 影 響 競 爭 子 和 外 源 轉(zhuǎn) 錄 本 的 反 轉(zhuǎn) 錄 效 率的 變 量 進 行 控 制 ， 要 做 一 個 最 終 的 RT-PCR實 驗 ， 在這 個 實 驗 中 樣 品 RNA和 競 爭 子 RNA在 同 一 個 管 中 被 反轉(zhuǎn) 錄 。 使 用 競 爭 子 RNA的 量 要 接 近 于 在 初 始 RT-PCR實驗 中 所 提 出 的 量 ， 之

12、 后 進 行 反 轉(zhuǎn) 錄 、 擴 增 。 如 前 所述 ， 與 內(nèi) 源 信 息 產(chǎn) 生 同 樣 信 號 強 度 的 競 爭 子 RNA的 量代 表 了 樣 品 中 內(nèi) 源 信 息 的 量 。 返 回 實 時 定 量 PCR擴 增 操 作v A： 流 程 ：v 1 標 準 曲 線v 2 待 測 cDNA 的 PCR 擴 增v B： 軟 件 使 用v 1 打 開 電 腦v 2 開 啟 5700， 9600 的 電 源 v 3 打 開 SDS 軟 件 ， v 4 選 擇 樣 品 （ 反 應(yīng) ） 類 型 和 取 名 下 一 頁 v 5 設(shè) 置 引 物 /探 針v 6 給 標 準 樣 品 設(shè) 值v 7

13、編 輯 熱 學(xué) 過 程v 8 保 存 文 檔 （ Plate Setup） v 9 點 擊 “ Run” ,real time PCR 整 套 設(shè) 備 開 始 自 動 運 行 。 v 10 查 看 結(jié) 果 ， 簡 單 分 析v C： 數(shù) 據(jù) 處 理v 1 根 據(jù) 標 準 曲 線 得 到 待 測 cDNA 中 各 種 基 因 （ 模 板 ）的 原 始 數(shù) 量v 2 用 Ct 比 較 法 來 測 算 轉(zhuǎn) 錄 水 平 差 異 。 返 回 異 硫 氰 酸 胍 /氯 化 銫 超 速 離 心 法 制 備 RNA 原 理 ： 異 硫 氰 酸 胍 是 一 類 有 效 解 偶 劑 ， 當(dāng) 細 胞 被 它溶 解

14、后 ， 蛋 白 質(zhì) 二 級 結(jié) 構(gòu) 消 失 ， 細 胞 結(jié) 構(gòu) 降解 ， 核 蛋 白 迅 速 與 核 酸 解 離 。 在 4mol/L異 硫氰 酸 胍 和 -巰 基 乙 醇 存 在 下 ， RNA酶 失 活 ，可 提 取 完 整 的 總 RNA. 使 用 Trizol純 化 RNA 原 理 ： Trizol是 一 種 新 型 總 RNA抽 提 試 劑 ， 內(nèi) 含異 硫 氰 酸 胍 等 物 質(zhì) ， 能 迅 速 破 碎 細 胞 ， 抑 制細 胞 釋 放 出 的 核 酸 酶 。 Trizol適 用 于 從 各 種組 織 或 細 胞 中 快 速 分 離 總 RNA。 熱 酚 法 原 理 ： 交 替 使

15、 用 酚 、 氯 仿 兩 種 不 同 的 蛋 白 變 性劑 以 增 大 去 除 蛋 白 質(zhì) 的 效 果 。 酚 雖 然 為 有 效的 蛋 白 質(zhì) 變 性 劑 ， 但 不 能 完 全 抑 制 RNase活 性 ，而 且 酚 能 溶 解 10-15%的 水 ， 從 而 溶 解 部 分poly(A) RNA。 為 此 ， 混 合 使 用 酚 和 氯 仿 ， 對于 RNA提 取 更 加 重 要 。 三 條 基 本 原 則v引 物 與 模 板 的 序 列 要 緊 密 互 補v引 物 與 引 物 之 間 避 免 形 成 穩(wěn) 定 的 二 聚 體 或 發(fā)夾 結(jié) 構(gòu)v引 物 不 能 在 模 板 的 非 目 的

16、位 點 引 發(fā) DNA 聚 合反 應(yīng) (即 錯 配 )。 引 物 濃 度 要 求 一 般 PCR反 應(yīng) 中 的 引 物 終 濃 度 為 0.2-1.0 mol/L。 引物 過 多 會 產(chǎn) 生 錯 誤 引 導(dǎo) 或 產(chǎn) 生 引 物 二 聚 體 , 過 低 則降 低 產(chǎn) 量 。 利 用 紫 外 分 光 光 度 計 , 可 精 確 計 算 引 物濃 度 , 在 1cm光 程 比 色 杯 中 ,260nm下 ,引 物 濃 度 可 按下 式 計 算 ： OD260 X mol/L A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引 物 摩 爾 濃 度 A、 C、 G、 T: 引

17、 物 中 4種 不 同 堿 基 個 數(shù) 。 定 量 PCR的 原 理 定 量 PCR是 指 以 一 種 標 準 作 對 照 ， 通 過 對PCR終 產(chǎn) 物 的 分 析 或 PCR過 程 的 監(jiān) 測 ， 對 PCR起始 模 板 量 進 行 定 量 的 技 術(shù) 。 定 量 PCR旨 在 評 估樣 本 中 靶 基 因 的 分 子 數(shù) 。 用 PCR對 靶 基 因 定 量 ，是 根 據(jù) 一 定 循 環(huán) 次 數(shù) 后 ， PCR產(chǎn) 物 的 量 來 推 斷樣 品 中 原 始 模 板 的 量 。 這 種 定 量 可 以 是 絕 對的 ， 也 可 以 是 相 對 的 。 RT- PCR 原 理 與 聚 合 酶

18、鏈 反 應(yīng) 偶 聯(lián) 的 反 轉(zhuǎn) 錄 （ RT-PCR）可 以 擴 增 細 胞 內(nèi) RNA用 于 分 析 基 因 表 達 。 該 程序 是 以 RNA轉(zhuǎn) 錄 本 為 模 板 ， 使 用 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 的逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 擴 增 其 互 補 的 DNA(cDNA)， 然 后 通 過熱 穩(wěn) 定 的 DNA聚 合 酶 擴 增 cDNA 。 利 用 這 種 方法 ， 使 用 少 量 的 起 始 模 板 （ 如 少 至 10-100個拷 貝 的 RNA轉(zhuǎn) 錄 本 ） ， 就 可 以 檢 測 到 基 因 的 表達 。 相 對 RT-PCR原 理 為 了 對 RT-PCR進 行 定 量 ， 在 相 對 R

19、T-PCR中 目 的 轉(zhuǎn) 錄 本 產(chǎn) 物 的 量 要 與 內(nèi) 對 照 相 比 較 。相 對 RT-PCR的 結(jié) 果 被 表 示 成 是 對 照 品 的 幾 倍或 百 分 之 幾 ， 因 此 是 半 定 量 結(jié) 果 。 為 了 使 相對 定 量 RT-PCR有 意 義 ， 必 須 在 指 數(shù) 擴 增 階 段對 PCR產(chǎn) 物 進 行 測 量 。 為 了 使 樣 品 間 的 相 對 變化 規(guī) 范 化 ， 使 用 了 內(nèi) 標 （ 如 -肌 動 蛋 白 、 三磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶 即 GADPH、 18SrRNA） 。 競 爭 性 RT-PCR 原 理 競 爭 RT-PCR的 結(jié) 果 以 轉(zhuǎn)

20、錄 本 的 拷 貝 數(shù) 或量 來 表 示 ， 因 此 是 絕 對 量 。 競 爭 性 RT-PCR要求 使 用 人 工 合 成 的 轉(zhuǎn) 錄 本 或 競 爭 子 作 為 外 源對 照 。 設(shè) 計 競 爭 子 時 要 與 內(nèi) 源 轉(zhuǎn) 錄 本 具 有 同樣 的 反 應(yīng) 動 力 學(xué) ， 并 且 逐 漸 增 加 量 的 滴 加 進重 復(fù) 的 RNA樣 品 中 從 而 產(chǎn) 生 標 準 的 動 力 學(xué) 曲 線 。應(yīng) 用 這 種 方 法 ， 來 自 樣 品 和 競 爭 子 的 PCR產(chǎn) 物量 可 以 直 接 對 比 。 實 時 定 量 PCR 實 時 檢 測 法 在 PCR反 應(yīng) 體 系 中 加 入 熒 光

21、基 團 ，利 用 其 就 是 在 PCR擴 增 的 每 一 個 循 環(huán) 后 分 別 檢 測 其PCR產(chǎn) 量 ， 借 助 計 算 機 數(shù) 據(jù) 處 理 ， 可 以 描 繪 出 PCR擴增 循 環(huán) 過 程 中 PCR產(chǎn) 物 變 化 曲 線 。 根 據(jù) PCR 變 化 曲 線計 算 出 未 標 靶 基 因 分 子 數(shù) 。 為 了 實 現(xiàn) 單 管 內(nèi) 進 行 實時 檢 測 的 目 的 ， 就 必 須 使 探 針 上 標 記 物 （ 指 示 物 ）在 雜 交 或 游 離 狀 態(tài) 存 在 發(fā) 光 強 度 差 異 ， 從 而 達 到 實時 定 量 檢 測 的 目 的 。 PCR的 工 作 原 理 PCR的 基

22、 本 工 作 原 理 是 以 擬 擴 增 的 DNA分 子為 模 板 ， 以 一 對 分 別 與 模 板 5 末 端 和 3 末端 相 互 補 的 寡 核 苷 酸 片 段 為 引 物 ， 在 DNA聚 合酶 的 作 用 下 ， 按 照 半 保 留 復(fù) 制 的 機 制 沿 著 模板 鏈 延 伸 至 完 成 新 的 DNA合 成 ， 重 復(fù) 這 一 過 程 ，即 可 使 目 的 DNA片 段 得 到 擴 增 。 組 成 PCR反 應(yīng)體 系 的 基 本 成 分 包 括 ： 模 板 DNA、 特 異 性 引 物 、DNA聚 合 酶 、 dNTP以 及 含 有 Mg2+的 緩 沖 液 。 PCR的 基

23、本 反 應(yīng) 步 驟 1） 變 性 ， 將 反 應(yīng) 系 統(tǒng) 加 熱 至 95 ， 使 模 板 DNA完 全 變 性 成 為 單 鏈 ， 同 時 引 物 自 身 和 引 物之 間 存 在 的 局 部 雙 鏈 也 得 以 消 除 ； 2） 退 火 ， 將 溫 度 下 降 至 適 宜 溫 度 （ 一 般 較 Tm低 5 ） 使 引 物 與 模 板 DNA退 火 結(jié) 合 ； 3） 延 伸 ， 將 溫 度 升 至 72 ， DNA聚 合 酶 以dNTP為 底 物 催 化 DNA的 合 成 反 應(yīng) 。 上 述 三 個 步驟 稱 為 一 個 循 環(huán) ， 新 合 成 的 DNA分 子 繼 續(xù) 作 為下 一 輪

24、合 成 的 模 板 ， 經(jīng) 過 多 次 循 環(huán) （ 25-30次 ）即 可 達 到 擴 增 DNA片 段 的 目 的 PCR的 用 處 目 的 基 因 的 克 隆 基 因 的 體 外 突 變 DNA的 微 量 分 析 解 鏈 溫 度vTm:解 鏈 溫 度 ， 又 稱 為 融 解 溫 度 。 DNA的 變 性從 開 始 解 鏈 到 完 全 解 鏈 ， 是 在 一 個 相 當(dāng) 窄 的溫 度 內(nèi) 完 成 的 ， 在 這 一 范 圍 內(nèi) ， 紫 外 光 吸 收值 達 到 最 大 值 的 50%時 的 溫 度 稱 為 DNA的 解 鏈溫 度 。vTm值 可 以 根 據(jù) G+C的 含 量 計 算 ， 計 算 公 式 為 ：Tm=69.3+0.41%（ G+C） ,小 于 20bp的 寡 核 苷 酸的 Tm值 的 計 算 公 式 為 :Tm=4(G+C)+2(A+T)