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,單克隆抗體與基因工程抗體的制備,第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 一、雜交瘤技術(shù) 二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存,第二節(jié) 單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性,第三節(jié) 基因工程抗體制備 一、人源化抗體　 二、小分子抗體 三、抗體融合蛋白 四、雙特異性抗體 五、噬菌體抗體庫技術(shù),第四節(jié) 單克隆抗體的應(yīng)用 一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑 二、蛋白質(zhì)的提純 三、小分子抗體的應(yīng)用 四、抗體融合蛋白的應(yīng)用 五、雙特異抗體的應(yīng)用 六、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景,思考題 小結(jié),第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理,雜交瘤技術(shù)原理： 聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)?胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤?細(xì)胞系 單克隆抗體生成：接種雜交瘤?細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體,抗體種類： 第一代抗體 多克隆抗體（polyclonal antibody) 第二代抗體 單克隆抗體（monoclonal antibody) 第三代抗體 基因工程抗體（genetic engineering antibody),B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體 骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng) 雜交瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)，單克隆抗體,流 程,一、雜交瘤技術(shù),不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK- 與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同,（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞,動(dòng) 物： BALB/c小鼠 7～12周齡 20g～25g體重,（二）免疫脾細(xì)胞,細(xì)胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫,免疫小鼠,。,淋巴細(xì)胞,。,淋巴細(xì)胞發(fā)育,。,漿細(xì)胞,。,抗原接種,培養(yǎng)液： RPM1640培養(yǎng)液 DMEM培養(yǎng)液,（三）細(xì)胞融合,細(xì)胞融合劑： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑 作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合 作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同,培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞： 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng) 細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊 避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞 注意事項(xiàng)：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中,免疫脾細(xì)胞的制備： 1×108的淋巴細(xì)胞 無菌手術(shù),飼養(yǎng)細(xì)胞： 細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖 常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞 其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用 飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化,。,飼養(yǎng)細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3) 50% PEG 1min內(nèi)加完; 2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液,融合方法,,,,,,SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～5 1ml 50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個(gè)。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液,細(xì)胞融合,10～20天出現(xiàn)克隆 HAT篩選 挑克隆,融合細(xì)胞的早期培養(yǎng),HGPRT酶與TK酶： 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶 胸腺嘧啶核苷激酶,（四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng),應(yīng)用液： 8-雜氮鳥嘌呤 聚乙二醇,HAT培養(yǎng)基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA,HAT選擇作用： 淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷 骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻,SP2/O: HGPRT- ，TK-;　長(zhǎng)命 脾細(xì)胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+ ，TK+; 長(zhǎng)命,骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞,雜交瘤細(xì)胞： 長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖 利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA 從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力,有限稀釋法(limiting dilution) 顯微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 軟瓊脂平板法(soft agar method),二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存,特點(diǎn)： 不需任何特殊設(shè)備 克隆出現(xiàn)效率高 實(shí)驗(yàn)室常用方法 方法： 細(xì)胞懸液通過系列稀釋 每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞,有限稀釋法,效率最高 價(jià)格昂貴,FACS,配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml) + 細(xì)胞凍存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO ) “慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮? “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇,雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,防止污染 避免染色體丟失 防止非分泌細(xì)胞的過度生長(zhǎng) 防止細(xì)胞密度過高而死亡,細(xì)胞冷凍的意義,第二節(jié) 單克隆抗體的制備,經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。,一、單克隆抗體的產(chǎn)生,動(dòng)物體內(nèi)誘生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只 體外培養(yǎng)法： 中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)? 單抗含量不高，牛血清Ab難以去除,腹腔注射法,前5天進(jìn)行,預(yù)先腹腔注射pristane （1～5）×106細(xì)胞 1～3w形成腹水,高滴度腹水,可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法 細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細(xì)胞）,二、 單克隆抗體的純化,ELISA,ELISA,多頭加樣槍,。,免疫熒光法,鹽析沉淀 親和層析 離子交換層析,McAb的純化,Ig類型、亞類測(cè)定：雙擴(kuò)法或ELISA法 特異性測(cè)定：抗原類似物的交叉反應(yīng) 效價(jià)測(cè)定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示? 表位測(cè)定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競(jìng)?爭(zhēng)抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析 親和性測(cè)定：測(cè)定親和常數(shù)K 雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條 McAb靶抗原分子量：常用western blot,三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定,四、單克隆抗體的特性,高度特異性 高度的均一性和可重復(fù)性 弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng) 對(duì)環(huán)境敏感性,（一）單克隆抗體的特性,優(yōu)點(diǎn) ： 在體外“永久”地存活并傳代 用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法 可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療,（二）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性,局限性 ： 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體 制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高,McAb PcAb 抗原要求 可以不純 純度高 得量 高 低 特異性 高 低 　　 穩(wěn)定 　　低 高 沉淀反應(yīng) 無 有 成本 高 低,McAb與PcAb的比較,McAb and PcAb,第三節(jié) 基因工程抗體制備,基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。,將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體,一、人源化抗體,方法： 從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體 特點(diǎn)： 減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力,（一）嵌合抗體,嵌合抗體,定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體 意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療,（二）改型抗體,Fab：抗原結(jié)合片斷 Fv：可變區(qū)片段 ScFv：?jiǎn)捂溈勺儏^(qū)片段 SdAb：?jiǎn)螀^(qū)抗體,二、小分子抗體,小分子抗體,其它生物活性蛋白融合,三、抗體融合蛋白,許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。,四、雙特異性抗體,分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。,化學(xué)交聯(lián)BsAb,將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng) (HAMA)，因此不適用于臨床。,細(xì)胞工程BsAb,多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性,五、噬菌體抗體庫技術(shù),用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因 克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面 用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。 使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段。 抗體庫： 組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機(jī)組合 人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人,（一）基本原理和程序,,,,噬菌體抗體庫,從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； 應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的Ig基因片段； 構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫(surface display antibody library)常用載體； 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。,構(gòu)建噬菌體抗體庫,模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容,能包含B細(xì)胞全部克隆 建庫的外源基因來自人體多克隆細(xì)胞的總mRNA 通用引物具有人的種屬普遍性 抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性,（二）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn),避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 抗體庫的大容量 抗體庫極高的篩選效率 可獲得高親和力的人源化抗體 VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程 所用的抗體基因又來自人體,第四節(jié) 單克隆抗體的應(yīng)用,檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑 蛋白質(zhì)的提純 小分子抗體的應(yīng)用 抗體融合蛋白的應(yīng)用 雙特異抗體的應(yīng)用 抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景,病原微生物抗原、抗體的檢測(cè) 腫瘤抗原的檢測(cè) 免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測(cè) 激素測(cè)定 細(xì)胞因子的測(cè)定,一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑,病原體測(cè)定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形蟲,風(fēng)疹病毒,巨細(xì)胞病毒 ，單純皰疹病毒,細(xì)胞表面CD測(cè)定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型,激素的測(cè)定： 內(nèi)分泌疾病的診斷,藥物測(cè)定(TDM)： 抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛,研究工作中的探針： 越來越多未知功能cDNA的克隆 對(duì)復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加,免疫沉淀,二、蛋白質(zhì)的提純,單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。,MACS,定義： 分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段 優(yōu)點(diǎn)： 分子量小,穿透性強(qiáng),抗原性低 不含F(xiàn)c段，不會(huì)與帶有Fc段受體的細(xì)胞結(jié)合，不良反應(yīng)少 可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及時(shí)中和及清除毒素,三、小分子抗體的應(yīng)用,應(yīng)用： 用于腫瘤的導(dǎo)向治療 腫瘤的影像分布 基因治療 細(xì)胞內(nèi)抗體： 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 特異性識(shí)別某一基因產(chǎn)物 可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性 研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,腫瘤的體內(nèi)顯像診斷 單鏈抗體排除速度快，穿透力強(qiáng)，在腫瘤組織中的分布指數(shù)較完整抗體分子高 放射顯像時(shí)，放射性核素排除較快，對(duì)身體危害程度小，顯像的本底較低 理想的顯像定位診斷載體 病毒的診斷和抗病毒感染 血液性疾病的診斷 白血病的免疫診斷及分型,四、抗體融合蛋白的應(yīng)用,在體外免疫檢測(cè)中的應(yīng)用 自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 快速檢測(cè)HBV和HIV病原體等 避免化學(xué)交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測(cè)的敏感度 用雙特異抗體作為二抗，檢測(cè)限達(dá)1ng/ml,五、雙特異抗體的應(yīng)用,在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷中的應(yīng)用 方法： 雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶抗原，一只臂結(jié)合半抗原螯合劑，后者可選擇性地與放射性核素結(jié)合，利用二次導(dǎo)向系統(tǒng)顯示 特點(diǎn)： 更高的的靈敏度和清晰度,在體內(nèi)免疫治療中的應(yīng)用 抗體分子可與放射性核素、細(xì)胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，這些分子在抗體結(jié)合靶分子后可提供重要輔助功能 雙功能抗體可有效針對(duì)低水平的腫瘤相關(guān)抗原，并將細(xì)胞毒物質(zhì)輸送到腫瘤細(xì)胞 抗體還可與攜帶藥物的脂質(zhì)體、各種PEG偶聯(lián)，從而增強(qiáng)體內(nèi)運(yùn)輸和藥代動(dòng)力學(xué),六、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景,在腫瘤體外診斷中的應(yīng)用 在腫瘤診斷中的應(yīng)用 在腫瘤治療中的應(yīng)用,1．雜交瘤技術(shù)是如何問世的？其基本原理是什么？ 2．什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗 體有何異同？ 3．雜交瘤細(xì)胞的克隆方法有哪些？ 4．細(xì)胞株凍融的原則是什么？ 5．大量制備單克隆抗體的方法有哪些，各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？ 6．單克隆抗體的性質(zhì)鑒定的方法有哪些？ 7．?dāng)⑹鰡慰寺】贵w的制備流程和應(yīng)用。 8．?dāng)⑹龌蚬こ炭贵w的概念和優(yōu)點(diǎn)。 9．基因工程抗體的種類和應(yīng)用。 10．抗體庫技術(shù)的原理和特性有哪些？,思考題,小結(jié),雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的原理是利用聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)?胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一?體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)過反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤?細(xì)胞系，將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體。,20世紀(jì)80年代誕生了應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體基因按不同需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體，稱為基因工程抗體，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：①通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)；②基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；③根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；④可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)形式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低了生產(chǎn)成本。,