單擊此處編輯母版標題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級,,第三級,,第四級,,第五級,,*,,*,,動物病毒學試驗技術(shù),,楊潤德,,,,通過病毒學的學習,我們了解到病毒沒,,有完整的酶系統(tǒng),體內(nèi)無核糖體等細胞器,,,因此不能在任何無生命的培養(yǎng)液中生長。,,所以要想增殖病毒必須在有生命的組織細,,胞內(nèi)接種讓其增殖,如:動物、雞胚、細,,胞、器官。,,,,實驗一、雞胚接種,,發(fā)育中的雞胚是病毒生長良好的環(huán)境,,,被廣泛用于病毒(特別是禽病毒)的分離,,培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)等。,,病毒在雞胚中的生長可以通過幾種方法,,加以測定,如:采集尿囊液、羊水、絨尿,,膜、雞胚作定量檢定;采集以上樣品作血,,凝滴定、血清學試驗等;檢査各部的病理,,學變化,如:雞胚死亡、矮小、出血、羽,,毛發(fā)育不良、內(nèi)臟壞死灶、絨尿膜水腫或,,增厚、壞死性痘斑、出血。,,,,除雞胚外,根據(jù)病毒特點可以選用其他,,禽胚,如小鵝瘟病毒宜接種鵝胚,鴨瘟宜,,接種鴨胚等。,,影響病毒在雞胚中生長的因素,包括雞胚,,的日齡、接種途徑、接種劑量、接種濃度,,培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)溫度一般為,,35.5-37℃,有些病毒所需的溫度更低。但,,很多哺乳動物病毒不適合在雞胚中生長。,,,,、受精卵的質(zhì)量和孵化,,1選取SPF雞群所產(chǎn)的蛋;,,2受精卵在10℃左右保存不超過10d,,3最好選擇白色卵殼的受精卵;,,4.卵殼無污染,孵化前在0.1%的新潔爾滅中,,浸泡約15mn,最后用冷水沖洗,放卵架,或,,將卵放卵架用甲醛(1m2用13m甲醛、,,6.5 gKMnO4熏蒸,而且在熏蒸時維持箱內(nèi)溫,,度為37℃20min后驅(qū)散甲醛蒸汽,,5孵化溫度保持39-40℃,相對濕度60-65%,,,有風扇維持空氣流通,每天翻蛋3-4次,,,,接種途徑,,根據(jù)不同病毒的嗜性,選擇適宜的接種,,途徑。最常用的途徑有卵黃囊、尿囊腔,,尿囊膜3種途徑,偶爾接種于羊膜腔、靜脈、,,胚體等。,,在分離一種未知病毒時,最好3種途經(jīng)均,,用,如果沒有足夠的受精卵,首選絨尿膜,,接種途徑,因為大多數(shù)病毒都能適應(yīng)。,,接種材料的處理:將組織置研缽磨碎,,加5-10倍鹽水并加入雙抗混均,2000,,3000r/min離心20-30min。取上清待用。,,,,()卵黃囊,,卵黃是胚胎的營養(yǎng)物質(zhì),卵黃囊膜是由,,內(nèi)胚層發(fā)育而來的,內(nèi)層覆有一層絨毛,,病毒可在絨毛細胞內(nèi)生長,并且可以由此,,擴散到胚胎的其他部位,,,,,○尿囊腔接種,,尿囊是雞胚的排泄器官。腔內(nèi)充滿排泄,,物尿囊液。液體的容量因卵的大小而異,,,一般6日齡雞胚時約1m,11日齡時約6m,,,13日齡可高達10ml,以后逐漸減少直到消,,失。13日齡時的尿囊液是無色透明的,14,,日齡后逐漸變渾濁,呈乳白色,有時淡黃,,色。,,,,接種方法,,1.取9-10日齡雞胚,照卵,畫出氣室,離,,氣室邊緣0.3-05cm用鉛筆作一記號;,,2.在氣室做記號處用碘酊消毒,打孔;,,3用注射器取毒液自接種孔斜刺入約1cm,,,注入毒液0.1-0.2ml;,,4.封孔繼續(xù)孵化,定時照蛋。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,