《Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白AQP1調(diào)控作用的研究【大學(xué)畢業(yè)論文】》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白AQP1調(diào)控作用的研究【大學(xué)畢業(yè)論文】（42頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子 Gli1在人神經(jīng)膠 質(zhì)瘤中對水通道蛋白 AQP1調(diào)控作用的研究 第二軍醫(yī)大學(xué) 博士學(xué)位論文 Hedgehog號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對 水通道蛋白AQP倜控作用的研究 姓名楊朝旭 申請學(xué)位級別博士 專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué) 指導(dǎo)教師王紅陽 20090501 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 第一部分 摘要 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對水通 道蛋白調(diào)控作用的研究 研究背景和目的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在脊椎動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起至關(guān) 重要作用的一條信號通路其在胚胎早期可以通過通路各

2、組分不同時間空間 特異性表達對多種細胞的命運決定產(chǎn)生影響并且可以與等 信號通路產(chǎn)生相互作用來實現(xiàn)不同細胞定向分化的精細調(diào)節(jié)信號的 調(diào)節(jié)紊亂在胚胎期會造成神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙和畸形在已經(jīng)成熟的個體則 會導(dǎo) 致月中瘤的發(fā)生最初是在研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤時發(fā)現(xiàn)并命名的一個基因其編碼的 蛋白是信號途徑最重 要的下游轉(zhuǎn)錄因子之一也是信號最終的響應(yīng)者和功能的執(zhí)行者 信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中處于一種調(diào)節(jié)紊亂的異常激活狀態(tài)在膠質(zhì)瘤的發(fā) 生發(fā) 展中起著重要作用其上游配體信號的存在對于膠質(zhì)瘤的生長及月中瘤干細胞 的自我更新能力的維持有著重要作用其下游轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié) 的表達水平參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖

3、和凋亡同時也與膠質(zhì)瘤的惡 性程度和惡性生物學(xué)行為的維持密切相關(guān) 水通道蛋白是類分布在細胞膜表面能夠特異的對 水分子進行快速高效跨膜轉(zhuǎn)運的小分子通道蛋白家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主 要分 布的水通道蛋白是近年來的研究發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)的一些疾病尤其 是月中瘤性疾病的進展有著密切的關(guān)系在膠質(zhì)瘤細胞向周圍組織的侵襲生 長及瘤周組織的腦水月中形成方面都發(fā)揮了重要的作用雖然已經(jīng)有大量的研 究闡 明了是如何通過自身的通道結(jié)構(gòu)對水分子進行跨膜轉(zhuǎn)運的但是對其本身 表達水平的高低受何種機制的調(diào)控尤其是它與主要信號通路之間的關(guān)系仍 然知 之甚少第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 本研究擬從一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)最

4、常見的月中瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤入手研究 通路的異常激活與水通道蛋白之間的關(guān)系旨在證明 通路下游轉(zhuǎn)錄因子對的表達具有調(diào)控作用闡明這種調(diào)控是在何種 水平以何種方式進行并對這種調(diào)控作用對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學(xué)行為 產(chǎn) 生的影響進行了初步探討 實驗方法 用免疫組織化學(xué)免疫熒光共定位實驗和 等方法研究神經(jīng) 膠質(zhì)瘤標本中通路的激活情況以及的表達情況并對 兩者之間的相關(guān)程度進行分析 構(gòu)建包含啟動子區(qū)全長的報告基因質(zhì)粒一 將與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細胞熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測對 激活程度的影響 將過表達質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細胞收獲不同時間點及不同轉(zhuǎn)入劑量的樣品 觀察轉(zhuǎn)錄水平 觀察蛋白水平的表達變化 設(shè)計合

5、成基因特異的干擾片段構(gòu)建干擾載體體外驗證有效后 研究干擾掉后對報告基因活性及膠質(zhì)瘤細胞系中表達 的影響 建立分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體過表達及穩(wěn)定干擾的三種神經(jīng)膠 質(zhì)瘤細胞系一方法檢 測三種細胞系中表達水平的變化 將報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入三種不同的穩(wěn)定細胞系中檢測轉(zhuǎn)錄活性的變化 分析啟動子區(qū)根據(jù)的核心結(jié)合序列設(shè)計引物運用染色質(zhì) 免疫共沉淀技術(shù)研究與啟動子區(qū)的結(jié)合情況 根據(jù)實驗結(jié)果利用重疊延伸技術(shù)構(gòu)建啟動子區(qū)突變 報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的穩(wěn)定細胞系中利用報告基因檢測確定在 對調(diào)控中起關(guān)鍵作用的啟動子區(qū)段位置闡明調(diào)控作用的機 帶 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 利用和 實驗比較不

6、同細胞系侵襲能力的 差異評價在膠質(zhì)瘤細胞系中調(diào)控表達所引起的生物學(xué)功能 變化 實驗結(jié)果 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中和的表達與對照正常組織相比都呈現(xiàn) 出異常高表達的狀態(tài)并且兩者之間的高表達具有特異的相關(guān)性 外源瞬時轉(zhuǎn)入及穩(wěn)定表達都可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)的表 達并能顯著增強含有啟動子區(qū)全長的報告基因的活性 特異性干擾的表達則可以降低的表達并抑制的報告基 因活性 可以和啟動子區(qū)中的保守調(diào)節(jié)序列相結(jié)合其中啟動 子區(qū)位的保守結(jié)合序列對維持的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要 表達水平不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系表現(xiàn)出不同的侵襲轉(zhuǎn)移能力在 侵襲能力較低的細胞系中外源性轉(zhuǎn)入可以使其侵襲能力得到恢復(fù) 提高提示

7、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可能通過上調(diào)的表達來增強月中瘤細 胞的惡性生物學(xué)特性 結(jié)論 本研究首次發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤中通路異常活化與異常高表 達兩種現(xiàn)象之間的關(guān)系并且證實通路下游轉(zhuǎn)錄因子可以通過與 啟動子區(qū)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對其表達進行調(diào)控其中啟動子區(qū) 段的序列在這一調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用在膠質(zhì)瘤細胞中 這一調(diào)控作用的生物學(xué)意義是可以通過上調(diào)來增強膠質(zhì)瘤細胞的惡 性侵襲能力 關(guān)鍵詞信號通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 第二部分 摘要 基于結(jié)構(gòu)修飾的靶向通路小分子抑制劑的 篩選研究 研究背景和目的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通路是一條高度保守的在生物的胚胎發(fā)育

8、 及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用的信號通路近年來的研究表明在 種人類惡性月中瘤性疾病中如腦膠質(zhì)細胞瘤基底細胞癌胰腺癌非小細胞肺 癌前列腺癌等該通路都呈現(xiàn)出異常的活化狀念并且對月中瘤的發(fā)生及發(fā)生后 月中瘤組織的生長和惡性生物學(xué)特性的維持起著重要作用人們在研究通路與 月中瘤之間關(guān)系時發(fā)現(xiàn)特異性抑制通路可以抑制多種腫瘤細胞的增殖以及向 其他器管侵襲轉(zhuǎn)移的能力因此信號通路被認為是一條比較理想的 可以作為月中瘤靶向治療的信號途徑針對通路的小分子抑制劑的開發(fā)及研究 工作方興未艾逐漸成為國際研究的熱點 介芬胺是從藜產(chǎn)屬植物中提取的一種小分子天然產(chǎn)物在化學(xué)結(jié) 構(gòu)上屬于一種箔體類生物堿可以與通

9、路上游激活因子特異性 結(jié)合而抑制該通路信號的傳遞進而發(fā)揮抑制月中瘤細胞的增殖的效應(yīng)是一種 有潛在臨床應(yīng)用價值的小分子抑制劑但是作為一種天然產(chǎn)物其抑制 通路活性的作用并不是很強且具有較大的化學(xué)毒性這一缺陷限制和延緩了 其作為一種新型抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用 本研究擬以為先導(dǎo)化合物通過結(jié)構(gòu)修飾和改造的方法制備系列目 標衍生物然后對制備的衍生物進行抑制通路的特異性篩選及抗月中瘤活性篩 選并與已有的通路抑制劑的活性進行比較最終期望獲得兩個 高效低毒高特異性的通路抑制劑并對結(jié)構(gòu)修飾規(guī)律作出總結(jié) 為新型抗月中瘤藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 實驗方法 結(jié)構(gòu)修飾衍生物的獲得以為底

10、物分別經(jīng)醴化燒化?；? 甲基化氯代等特異性化學(xué)修飾得到一系列衍生化合物 衍生物高通量篩選平臺的構(gòu)建在通路組成性激活的細胞系中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以反應(yīng)通路激活程度的報告基因?qū)⒃摷毎得? 名為并對該細胞系反映通路激活程度的敏感性進行鑒定 初次篩選以步驟中構(gòu)建的穩(wěn)定細胞系為篩選工具將步驟中得到的衍 生物以濃度作用于體外培養(yǎng)的后測定報告基因數(shù)值 觀察各化合物對通路的抑制效應(yīng)得到可以相對特異性抑制通路活性 的化合物 二次篩選細胞活性檢測再次篩選步驟中得到的化合物對體外培養(yǎng)的 的細胞毒性排除初篩過程中報告基因數(shù)值的降低是由于化合物 本身的毒性導(dǎo)致細胞死亡所致得到對細胞增殖抑制不明顯但可以顯著

11、抑 制報告基因活性的毒性低特異性好的衍生物 及檢測步驟中得到的化合物對細胞中通 路下游轉(zhuǎn)錄因子表達的抑制作用進一步驗證化合物的特異性 法檢測經(jīng)二次篩選得到的衍生物在體外對月中瘤細胞的增殖抑制作用 裸鼠荷瘤實驗將得到的化合物以不同劑量灌胃給藥觀察其對體內(nèi)月中瘤的 生長抑制作用最終得到具有較高的抗月中瘤活性低毒高效的通路抑制 劑 實驗結(jié)果 以為先導(dǎo)化合物進行化學(xué)修飾和改造分離純化后共得到個衍生 物 報告基因法初篩檢測修飾后的化合物對通路的相對抑制作用與陽性對 照藥物環(huán)杷明相比較共有個化合物顯示出與其類似或更 佳的抑制作用 用法再次檢測初篩得到的化合物對體外培養(yǎng)細胞的增殖

12、活性的影響 剔除細胞毒性較大的衍生物再次篩選后得到個毒性較低特異性較好的 化合物分別為號化合物號化合物 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 號化合物號化合物 及 結(jié)果顯示經(jīng)兩次篩選后得到的個化合物可以有效降 低通路下游轉(zhuǎn)錄因子的及蛋白表達水平提示其具有良好的 特異性抑制通路活性的作用 在體外月中瘤細胞增殖抑制實驗中篩選到的化合物顯示出選擇性抑制通 路依賴的月中瘤細胞的特性裸鼠荷瘤實驗中四種化合物均表現(xiàn)出較好的抑制 月中瘤生長的作用其對體內(nèi)月中瘤生長的抑制效率如下號化合物為 號化合物為號化合物為號化合物為其 中統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明號化合物對月中瘤生長的抑制作用要優(yōu)于陽

13、性對照 化合物環(huán)杷明 結(jié)論 本研究以為先導(dǎo)化合物首先經(jīng)特異性結(jié)構(gòu)修飾改造得到一系列衍 生物然后對衍生物在抑制通路的特異性體內(nèi)外毒性抗腫瘤活性等方面 的特性進行連續(xù)篩選最終得到四個特異性較好毒性較低抗月中瘤活性較強的 陽性化合物其中有三個化合物在上述特性上與陽性對環(huán)杷明類 似一個化合物要優(yōu)于壞杷明對所得陽性化合物的結(jié)構(gòu)改造位點與先導(dǎo)化合 的結(jié)構(gòu)進行比較分析可以得出以下規(guī)律氧化能夠增強化合物的特 異性及抗月中瘤活性但不明顯對化合物毒性影響亦不顯著化合物的毒性針 對通路的特異性以及抗月中瘤活性主要與與結(jié)構(gòu)中哌噬環(huán)的密切相關(guān)對 哌噬環(huán)的進行結(jié)構(gòu)修飾是發(fā)現(xiàn)高效低毒衍生物的重要方向

14、 結(jié)構(gòu)修飾 關(guān)鍵詞介芬胺通路小分子抑制劑第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 一英文縮略詞表 英文全稱中文全稱 縮寫牛血清白蛋白染色質(zhì)免疫沉淀 環(huán)杷明焦碳酸二乙酯改培 養(yǎng)基 二甲基亞碉 乙二胺四乙酸 胎牛血清多形性膠質(zhì)母細胞瘤 綠色熒光蛋白 免疫組化聚合酶鏈反應(yīng)干擾 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究 工作除了文中特別加以標注和致謝的地方外論文中不包含其他人 已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果與我一同工作的同志對本研究所做的 任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意本人承擔本聲明 的法律責任 吼

15、學(xué)位論文作者簽名才詢她 鈣月白 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)聲明 本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定第 二軍醫(yī)大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和 電子版允許論文被查閱和借閱本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位 論文全文或部分內(nèi)容編入《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》 《中國優(yōu)秀博 碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》等數(shù)據(jù)庫進行檢索可以采用影印縮印 或掃描等復(fù)制手段保存匯編學(xué)位論文保密的學(xué)位論文在解密后 適用本授權(quán)書 導(dǎo)師簽名 學(xué)位論文作者虢鋤拙 喀碧， 日期年曩《月 >> 日 魄叼年鄉(xiāng)月日 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 第一部分通路下游轉(zhuǎn)錄因子在人神經(jīng)膠質(zhì)

16、瘤中對水 通道蛋白調(diào)控作用的研究 神經(jīng)系統(tǒng)是人體最精細結(jié)構(gòu)和功能最復(fù)雜的系統(tǒng)由數(shù)以億萬計的高度相 互聯(lián)系的神經(jīng)細胞組成由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良及后天的病變導(dǎo)致的各種神 經(jīng)性 疾病尤其是月中瘤性病變已經(jīng)成為危害人類的主要疾病之一膠質(zhì)細胞瘤 也稱神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤起源于神經(jīng)外胚葉組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原 性月中瘤在人類對抗和干預(yù)膠質(zhì)細胞瘤的歷史中雖然已形成了一整套以手術(shù) 中心輔以放療和化療等多種措施的綜合治療方案但是由于膠質(zhì)細胞瘤生長 迅速無邊界浸潤易于復(fù)發(fā)等特性其治療預(yù)后仍不盡理想據(jù)統(tǒng)計膠質(zhì)細 胞瘤在神經(jīng)上皮組織月中瘤中約占約占顱內(nèi)月中瘤的而神經(jīng)膠質(zhì) 細胞瘤患者的平均生存期仍少于年因此加強

17、膠質(zhì)細胞瘤致病機理及發(fā)生 發(fā)展的基礎(chǔ)科學(xué)研究為臨床治療提供新的思路和治療途徑對于從根本上提 本病的治療效果有著重要意義信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在脊椎動物胚胎期神 經(jīng)發(fā)育和分化中起著至關(guān)重要的作用的一條信號通路參與脊椎動物神經(jīng)發(fā) 中細胞命運和胚胎范型的決定在早期途徑可以通過不同時空的特異表 達決定神經(jīng)管中來自腹部區(qū)域的細胞發(fā)育為運動神經(jīng)元而來自背區(qū)的細胞 則發(fā) 育為感覺神經(jīng)元在后期該通路可以通過與其他一些信號因子的協(xié)同作用如 等對神經(jīng)系統(tǒng)細胞的精細分化進行調(diào)節(jié)在與神經(jīng)系統(tǒng)的疾 病聯(lián)系方面在未成熟的個體途徑配體的突變將會導(dǎo)致一種叫做前腦 無裂畸形的發(fā)育缺陷性疾病對面部和神經(jīng)系統(tǒng)的中線產(chǎn)生影響在

18、成熟的個 體途徑的過度激活是多種神經(jīng)系統(tǒng)月中瘤發(fā)生及惡性生物學(xué)行為維持的重要 原因其中包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白家族是通路下游具有鋅指結(jié)構(gòu) 域的轉(zhuǎn)錄因子也是途徑在受到外界信號刺激后做出對一系列靶基因進行 調(diào)節(jié)這一反應(yīng)功能的最終執(zhí)行者該蛋白家族中既有激活因子也包括抑制因 子而是通路下游末端重要的轉(zhuǎn)錄激活因子其表達水平的高低 是通路激活程度的標志基因由在年發(fā)現(xiàn)由于其在腦膠第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué) 位論文 質(zhì)瘤中較正常對照組織擴增高出大約倍而得名通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞的生長膠質(zhì)瘤月中瘤干細胞的 自 我更新的維持并與其成瘤能力關(guān)系密切 水通道蛋白是分布在生物膜表面

19、能夠?qū)λ肿舆M行 高效特異的跨膜轉(zhuǎn)運的一類通道蛋白家族最初在年由等人 對紅細胞膜分離純化多肽時發(fā)現(xiàn)隨后的研究證明了其特異轉(zhuǎn)運水分子的 功能并將其命名為的發(fā)現(xiàn)更新了人們長期以來的水跨生物 膜的移動儀靠單純擴散的觀念使人們一些生理病理的過程及機制有了更加 合 理和深刻的認識迄今為止已經(jīng)在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了種水通道蛋白 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布的是在下常生理條件下 在人主要表達于腦脈絡(luò)膜上皮微絨毛的頂膜與酶共同定位于該組 織在腦脊液產(chǎn)生過程中具有重要作用并參與調(diào)節(jié)水和離子平衡在發(fā)育過程 中從妊娠個月胎兒的腦組織中兀始檢測出隨后其表達部位和量隨月 齡增大而相應(yīng)變化可能與胎兒腦內(nèi)水平衡

20、的調(diào)節(jié)有關(guān)在腦的發(fā)育中起重要 作 用在正常腦組織中的表達水平很低在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中主要表 達于微血管內(nèi)皮細胞和瘤性星形細胞在轉(zhuǎn)移瘤的微血管內(nèi)皮細胞和反應(yīng)性 星形 細胞中表達 主要在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進展過程中發(fā)揮作用由于膠質(zhì)瘤細 胞的生長環(huán)境是在結(jié)構(gòu)致密空問局限的中樞神經(jīng)系統(tǒng)所以其向周圍組織的 浸潤 性生長主要依靠其通過變形運動插入到神經(jīng)元周圍的空隙中來實現(xiàn)引表達 水平高的膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)外實驗中表現(xiàn)出更強的侵襲轉(zhuǎn)移特性因為此 類細胞具有更強的變形運動能力更有利于向周圍組織擴散性增殖此外 還與腦膠質(zhì)瘤旁的月中瘤周圍組織水月中的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系盡管 在腦脊液分泌大腦內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié)以及膠

21、質(zhì)瘤的發(fā)展中起著重要作用并且 人們對于其自身的通道結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了清楚的了解但是對于其表達的調(diào)節(jié)機 制仍 不清楚尤其是其與主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系目自訂仍然研究的很少在 人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 信號通路與在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常功能的維持中都 起著重要的作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中兩者也都各自體 現(xiàn)出 重要的影響但是對兩者之間關(guān)系的研究目前尚未見報道本課題從神經(jīng)膠質(zhì) 瘤 組織標本入手首先分析了兩者之問的表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)了與在 膠質(zhì)細胞瘤中伴隨性高表達這一現(xiàn)象然后通過分子生物學(xué)實驗對通路通過 其下游轉(zhuǎn)錄因子對進行調(diào)控的可能性及機制進行研究最后對這種 調(diào)

22、控作用對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)功能的影響進行了初步探討第二軍醫(yī)大學(xué)博 士學(xué)位論文 材料和方法 一材料 主要化學(xué)和生物試劑 普通試劑瓊脂糖瓊旨公司十二烷基肌酸鈉 公司蛋白陳及酵母提取物公司冰乙酸上海試劑一廠 甲醇上海試劑一廠無水乙醇上海試劑一廠堿 公司各種限制性內(nèi)切酶酶 連接酶公司 公司濾紙公司公司硝酸 纖維素膜膜公司等特殊試劑及試劑盒 公司 檢測系統(tǒng)公司產(chǎn)物純化試劑盒膠回收試劑盒為上 海賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品各種寡核甘酸鏈引物使用相關(guān)軟件 自行設(shè)計均由上海生工生物工程有限公司合成測序工作送交 英駿生物技術(shù)有限公司完成熒光素酶定量檢測試劑盒為 公司產(chǎn)品細胞核染色試劑購自

23、公司澳化乙錠為 轉(zhuǎn)染 公司產(chǎn)品質(zhì)粒純化試劑盒公司 試劑公司蛋白定量試劑盒公司細胞活力分 析試劑一購自日本同仁化學(xué)研究所細胞侵襲實驗板購自 公司細胞外基質(zhì)試劑購自公司 載體菌株和抗體 購自 載體真核表達載體 質(zhì)粒為本 為公司產(chǎn)品 實驗室所有 宿主菌和均由合作單位德國馬普生化所提供 公司單抗購自 抗體抗抗體抗抗體購自 康成生物有限公司羊抗兔及羊抗小鼠二抗購自華舜公司熒光二抗購自 公司 質(zhì)粒 真核表達質(zhì)粒由謝經(jīng)武教授惠贈 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 一表達質(zhì)粒干擾質(zhì)粒報告基因質(zhì)粒 質(zhì)粒均由本室構(gòu) 建 細胞及培養(yǎng)用主要試劑及制備方法 人胚腎

24、上皮細胞人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞購自中科院細胞庫 液體培養(yǎng)基取培養(yǎng)基于粉公司包加入碳 酸氫鈉 完全培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基添加胎牛血清三抗 三抗青霉素鏈霉素慶大霉素配成 后的除菌濾膜過濾保存?zhèn)溆? 胎牛血清購自公司 胰蛋白酶購自公司 細胞凍存液 液體培養(yǎng)基 二甲基亞碉 主要緩沖液 裂解液 臨用前加入 X凝膠加樣緩沖液 澳酚藍甘油 嘶在去離子水中溶解堿和甘氨酸然后加入 的電泳級儲存液用離子水補至則成 儲存液室溫密閉保存 蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸堿 甲醇 麗春紅三氯 醋酸磺基水楊酸 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 封閉液脫脂奶粉溶解 緩沖液的配制 稱取堿加入去離子水磁力攪拌

25、下完全溶解 用約 濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至 室溫保存?zhèn)溆? 堿加入去離子水磁力攪拌下完全溶解 稱取 用約室 濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至 溫保存?zhèn)溆? 稱取加入去離子水磁力攪拌下完全溶 解用約 濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至 室溫保存?zhèn)溆? 加入去離子水磁力攪拌下完全溶 稱取 解用約 濃鹽酸調(diào)節(jié)值至去離子水定容至 室溫保存?zhèn)溆? 處 用 理的去離子水充分溶解加數(shù)滴濃調(diào)節(jié)值至并將體積調(diào)節(jié)至 保存 在的條件下溶解于去離了 十二烷基磺酸鈉 水中加數(shù)滴濃鹽酸調(diào)節(jié)值至冷卻后去離子水定容至室溫 保存 主要儀器和設(shè)備 儀型 紫外分光光度計 型 一超低溫冰

26、箱型 機型 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 各種離心機型型 型 轉(zhuǎn)膜儀 恒溫水浴振蕩器型哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 恒溫水浴箱一型上海天平儀器廠 超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備公司 凝膠成像系統(tǒng)上海四星生物技術(shù)公司 免疫組化石蠟包埋機公司 免疫組化制片儀公司 免疫組化冰凍切片儀公司 熒光實時定量儀公司 熒光素酶檢測儀器 紫外透射反射分析儀型上海長明光學(xué)電子儀器廠 顯微鏡熒光顯微鏡 電泳儀型 型制冰機公司 三二 研究方法針咒萬法 標本來源及處理 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織標本來例源于年月至年月在 長海醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的患者經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診其

27、中分級 IV級例其余均為IV級下常對照兩例于正常腦組織內(nèi)減壓術(shù)中獲得 冰凍組織標本例其中分級級例II級例IV級例IV 級例正常對照組織例 免疫組織化學(xué) 石蠟切片烤箱過夜 切片脫臘至水 二甲苯①一二甲苯②一二甲苯③一乙醇第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 乙醇一乙醇一乙醇一雙蒸水 甲醇液室溫放置 X 雙蒸水洗 抗原修復(fù) 切片放入檸檬酸鹽緩沖液中煮沸停火再煮沸 自然冷卻至室溫雙蒸水沈 封閉c 甩去封閉液不洗直接加一抗置入濕盒中 然后冰箱過 夜時 C取出室溫復(fù)溫 x 然后洗 滴抗C 沈x顯色鏡下觀察 雙蒸水終止顯色蘇木素復(fù)染秒 分化后自來水返藍蒸儲水浸泡 脫水透

28、明蓋玻片覆蓋 顯微鏡下觀察陽性染色在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 免疫印記 取等量神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織液氮中磨碎 加入裂解緩沖液冰浴超聲破碎細胞 置恒溫離心機內(nèi)離取上清 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量取出所需量蛋白加入加樣緩沖液 變性 變性樣品進行蛋白電泳 通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 公司 脫脂奶粉封閉洗三次每次 稀釋一抗孵育洗三次每次 脫脂奶粉稀釋二抗孵育洗三次每次 化學(xué)發(fā)光法顯影 細胞培養(yǎng) 胚腎上皮細胞入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞細胞用培養(yǎng) 置孵箱中培養(yǎng)保持飽和濕度 消化取待傳代細胞培養(yǎng)瓶皿輕棄培養(yǎng)基預(yù)溫少許輕洗一遍 棄去加少許胰酶室溫放置數(shù)分鐘至瓶壁出現(xiàn)針孔

29、樣 棄去胰酶加少量新鮮培養(yǎng)基終止消化輕輕吹打待成單個細胞后傳代 凍存生長對數(shù)期細胞約X胰酶消化數(shù)分鐘用完全培養(yǎng)基中 止吹打成單個細胞離心分鐘將細胞沉淀懸浮于凍存 液胎牛血清中轉(zhuǎn)移到凍存管中小 時一 C小時液氮管而后放進液氮中 復(fù)蘇準備溫水視復(fù)蘇細胞管數(shù)多少將從液氮罐中 取出的細胞迅速在水中融化不斷攪動轉(zhuǎn)移細胞于加有新鮮完全培養(yǎng) 液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)次日更換培養(yǎng)液 質(zhì)粒的構(gòu)建 啟動子區(qū)報告基因質(zhì)粒及突變體質(zhì)粒的構(gòu)建方法 啟動子區(qū)全長及各突變體質(zhì)粒物見下表其中各突變體質(zhì)粒采用第二軍醫(yī)大 學(xué)博士學(xué)位論文 重疊延伸法進行構(gòu)建條件如下變性℃退火C 延伸C個循環(huán)電泳鑒定 構(gòu)建方法

30、上游引物均引入酶切位點下游引物均引入酶切 位點得到的產(chǎn)物進行膠回收再用酶切與用同樣雙酶 切酶切回收后的質(zhì)粒進行連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌氨葦抗生素 篩選陽性克隆用酶切初步鑒定正確后再送測序鑒定確認突變 位點正確后再用于后續(xù)實驗 質(zhì)粒名稱引物 干擾質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建 人工合成針對人 中部堿基處的反向互補序列端加 端加入粘性木端序列如下合成后上下游寡 入粘性術(shù)端 核甘酸鏈在 溶液中于沸水浴中后自然冷卻即得到雙鏈的帶 粘性末端的 有矛片段質(zhì)粒用 酶切回收然后進行連接轉(zhuǎn)化 感受態(tài)菌卡那抗生素篩選陽性 克隆 片段是否接入用測序鑒定鑒定正確后在體外驗證其干 擾效果 一表達載體的構(gòu)建在

31、人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 網(wǎng)站檢索得到序列根據(jù)JT放讀碼框設(shè)計引物序列如下 上游引物引入 酶切位點下游引物引入酶切位點以抽提的大鼠 腎臟組織為模板擴增膠回收后用 酶切 質(zhì)粒同樣進行雙酶切后回收片段載體進行連接然后進行連接轉(zhuǎn)化 感受態(tài)菌氨葦抗生素篩選陽性克隆酶切鑒定 細胞轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體法公司在培養(yǎng)皿中接種適量 細胞使之培養(yǎng)后匯合率達到在不同離心管中分別加入 無血清分別加入肛質(zhì)粒和脂質(zhì)體分別混勻后室 溫放置 將溶液和脂質(zhì)體溶液混合輕柔混勻室溫放置 轉(zhuǎn)染前細胞用預(yù)溫的無血清洗滌一遍加入 無血 清隨后將質(zhì)粒一脂質(zhì)體復(fù)合物滴加至細胞表面置 孵箱內(nèi)培養(yǎng)后吸去一脂質(zhì)體

32、復(fù)合物加入含的 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)裂解細胞提取總蛋白 法公司在孔培養(yǎng)皿中接種適量使之培 養(yǎng)后匯合率達到在不同離心管中分別加入生理鹽水 并混勻隨即將溶液加入溶液振 分別加入質(zhì)粒和 蕩混勻室溫放置 將質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物滴加至細胞表面置 孵箱內(nèi)培養(yǎng)裂解 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染后胰酶消化按傳代細胞貼壁后加入 培養(yǎng)以維持其性狀 兩周左右挑取單克隆細胞 抽提 待六孔板中細胞生長至匯合度 室溫孵育 加入 加入氯仿劇烈振蕩室溫孵育 C離心 吸取上層含有的水相入新管加入異丙醇沉淀室溫孵育 離心第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 棄上清加入 的乙醇洗滌磯沉淀C離一 水溶解 干燥用 用紫外

33、分光光度計測定的含量保存準備做 操作步驟 合成第一鏈 總 隨機引物 立星丞 魚叢 C 冰浴至少 x 肛 C C C 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 反應(yīng) 取上述合成的 為模板按列反應(yīng)體系進行擴增 槿拯墜加水至總體積為 輕輕混合預(yù)變性變性退火延伸 至個循環(huán)C終木延伸 產(chǎn)物用瓊脂糖膠電泳分析 熒光素酶報告基因檢測在孔或孔板中接種細胞使小時后匯合率為瞬時轉(zhuǎn) 染熒光素酶報告基因和的基因 小時后裂解細胞采用公司 雙熒光報告基因檢測試劑盒進行檢測 細胞增殖速率比較 取對數(shù)生長期細胞傳代消化以每孔個的密度接種入孔板并設(shè) 個復(fù)孔在后加入十分之一體

34、積的工作液孵育小時后放 入酶標儀以波長檢測取平均值比較差異 體外侵襲實驗 基質(zhì)膠準備將凍存于度冰箱的 度過夜變成液態(tài) 取無血清培養(yǎng)基加入或每室混勻 操作最好在冰浴上加入上室各個室放入培養(yǎng)箱中 孵育此間經(jīng)常觀察當出現(xiàn)白色層時說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài) 注釋無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按稀釋每孔加在c培養(yǎng)箱中 消化細胞無血清培養(yǎng)基洗次計數(shù)配成細胞懸液 用無血清培養(yǎng)基洗洗次每孔加入細胞懸液第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 下腔室中加入含有條件培養(yǎng)基 C培養(yǎng)箱中孵育 取出用洗遍戊二醛固定 加入結(jié)晶紫染色或染色室溫洗 遍用棉球擦去上表面細胞顯微鏡下觀察取隨機個視野細胞計數(shù) 染色質(zhì)免疫共沉淀 部分

35、剪切X細胞 于培養(yǎng)瓶中準備x細胞培養(yǎng)基為 甲醛C置 直接加入 于冰上終止反應(yīng)盡量吸盡培養(yǎng)基用含冰冷洗滌次 管 反復(fù)吹打細胞吸取懸液移入 C離心融化裂解液并加入和 裂解液再懸細胞冰上 x次間隔 冰上超聲剪切至大小 加入C以解除交聯(lián) 苯氯仿法提取瓊脂糖凝膠電泳觀察剪切效果 注 卜注意冰上操作 通過改變超聲功率間隔次數(shù)優(yōu)化條件通過電泳判斷片段大 小經(jīng)驗表明尖端最大功率間隔次可使之優(yōu)化 一旦優(yōu)化則固定細胞數(shù)量 部分免疫共沉淀 接離心轉(zhuǎn)移上消至離心管 稀釋緩沖液稀釋上消至體積并加入蛋白酶抑制劑 從中取出進入用于定量 加入蛋白鞋精瓊脂于稀釋上清以純化搖動選 中

36、速下同 離心以沉淀瓊脂轉(zhuǎn)移上泊于新管乂 加入抗體搖動過夜 背景對照則不加抗體直接使用蛋白鞋精瓊脂搖動 直接 進入 加入蛋白鞋精瓊脂搖動以收集抗體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 離心以沉淀瓊脂尤其小心移除上清內(nèi)含未結(jié)合及非 特異可提取并按以下順序洗滌蛋白鞋精復(fù)合 體每種緩沖液加室溫搖動 離心 ①低鹽免疫復(fù)合體洗液次 ②高鹽免疫復(fù)合體洗液次 ⑨免疫復(fù)合體洗液次 緩沖液次 注步取出上清用于不同樣本定量此作為 C置以解除蛋白交聯(lián)見 初始樣本而且需要通過加入 經(jīng)過后樣本為蛋白抗體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體 部分沈脫結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子的 按體積配制 配制新

37、鮮洗脫緩沖液和 接加入沈脫液以使轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與蛋白抗體解離 簡單振蕩混勻室溫搖動 離心以沉淀瓊脂小心 轉(zhuǎn)移上泊于新管并重復(fù)沈脫次混合次洗脫上清 以解除轉(zhuǎn)錄因子交聯(lián)置 加入 此后樣本可放入一于明同進行后續(xù)實驗應(yīng)同時包括的初 始樣本陰性對照和背景對照組樣本用于巢式 若結(jié)果不理想可進行下面步驟以純化注意小心操作某些 可能在純化過程中丟失 部分苯氯仿法提取 依次加入 蛋白酶 C水浴 對于優(yōu)化條件加入和振蕩混勻 加入苯氯仿抽提液劇烈振蕩靜止使分層室溫第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 離心小心吸取上清 加入糖原 醋酸鈉 乙醇 混勻放置一c c 離心 棄上清醇洗滌次離

38、心棄去上清并倒 扣揮發(fā)乙醇 加入續(xù)則使用緩沖液沖洗吸附在管壁上的一 冰箱保存 部分擴增反應(yīng)驗證結(jié)合作用 按體系依次加入 上游引物 下游引物 滅菌水循環(huán) 使用 然后 C C C 共個循環(huán) 瓊脂糖凝膠電泳上樣觀察結(jié)果 染色 細胞多聚甲醛固定洗 處理洗三次每次 在人胺貢瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 染色洗三次每次 甘油覆蓋熒光顯微鏡下觀察 主要引物列表 醫(yī)太學(xué)博士學(xué)位論文 實驗結(jié)果 一膠質(zhì)細胞瘤月中瘤組織標本中及表達水平的檢測 為了明確在膠質(zhì)瘤組織樣本中通路下游轉(zhuǎn)錄因子與的表達情 況我們首先進行了免疫組織化學(xué)實驗免疫組化結(jié)果提示 分級mIV級

39、和IV級神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織與正常對照組織相比 通路呈現(xiàn)出異?；罨癄顟B(tài)通路下游轉(zhuǎn)錄因子異常高表達陽 性著色主要分布于變異肥大的星形膠質(zhì)細胞的胞核與胞漿內(nèi)圖 瀑眷? > 潦 蕤在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研先 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文■七 圖神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中免疫組織化學(xué)染色 分級為IV級的神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤及中免疫組化染色結(jié)果正常對 照組織腫病組織中呈現(xiàn)出異常的高表達陽性染色主要分布于肥大變形的星 形膠質(zhì) 細胞的胞膜表面圖片放大倍數(shù)為中間插入的局部放大圖為 在同一膠質(zhì)細胞瘤組織標本中與的高表達的區(qū)域呈現(xiàn)出比較特 異的相關(guān)性圖在人肢質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 一灌夥

40、瓣 繁蒸 麓輔第二軍醫(yī)太擘博士學(xué)位論文 糕麓 ■一 圖神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞及神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中與的免疫熒光 共定位表達情況 使用一抗來源不同的與抗體抗二抗使用標記早現(xiàn)紅色熒光抗 二抗使用標記呈現(xiàn)綠色熒光神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中與的 特異性共定位情況神經(jīng)膠質(zhì)病組織中特異性共定位圖中可見主要分布在胞 漿和胞膜表面作為轉(zhuǎn)錄因子主要定位于胞棱高表達的細胞或組織區(qū)域 也呈現(xiàn)出特異性高表達在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 初步明確與在膠質(zhì)細胞瘤中的伴隨高表達現(xiàn)象之后為了進一 步驗證免疫學(xué)結(jié)果選取例分級不同的膠質(zhì)瘤冰凍組織標本使用液氮研磨 裂解法提取總蛋白 分別檢測月中瘤組織標本巾與

41、的表達 水分析其相關(guān)性我們發(fā)現(xiàn)與免疫組化的結(jié)果一致與之間的 伴隨表達現(xiàn)象在分級不同的標本中更為明顯總的趨勢是與的表達 水平都隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加逐漸升高圖 刮神經(jīng)歧廈籀組簪小車川 』收選水… 不同分級的膠質(zhì)瘤其中分級級例m級例m iv級例iv級例中 與表達町見與的表逃在小同分級的月中瘤組織中表現(xiàn)出照好的一致性 總的趨勢是兩者的表達部隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增強為正常腦組盆 二轉(zhuǎn)錄因子對的調(diào)控作用及其機制 可咀顯著上調(diào)含有啟動子區(qū)的報告基因活性 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中與表達之間的伴隨關(guān)系提示下游 轉(zhuǎn)錄因子可能對的表達具有調(diào)控作用為了驗證這個初步的設(shè)想 我們在和神經(jīng)膠

42、質(zhì)瘤細胞系中分別共轉(zhuǎn)與含有啟動 子區(qū)的報告基因質(zhì)粒結(jié)果發(fā)現(xiàn) 的表達可以在兩種細胞系中激活的報告基因活性并且隨著 轉(zhuǎn)入量的增加的報告基因活性也逐漸升高表現(xiàn)出較好的劑量 依賴性圖第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 怎墨叮價慧一 8一—OO碰 OOOO 陽 OOOOOO 的扣 OO 一沁 OO 卯 篁冒毋價母垃 OO OO ---8 —■ 圖對含有啟動子區(qū)的報告基因激活作用 在及中共轉(zhuǎn)與之后報告基岡的激活情況與對照組相比 可以顯著增強報告基岡的活性并且這種激活作用隨著轉(zhuǎn)入量的增加而增強 表現(xiàn)出 劑量依賴的特點 可以上調(diào)的和蛋白表達水平 在膠質(zhì)瘤組織標本和報告基因的結(jié)果

43、都提示通路下游轉(zhuǎn)錄 激活因子很有可能對水通道蛋白的表達具用調(diào)控作用我們隨之 在人胚腎上皮細胞中進行了預(yù)實驗來驗證該假設(shè)外源性在中轉(zhuǎn) 及蛋 入收獲不同時間點細胞及檢測在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 白表達水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的細胞與對照組相比的表達增強 這種增強作用隨著時問的延長更加明顯與表達的增強情況相一致表 現(xiàn)出較好的時間依賴性在中外轉(zhuǎn)劑量梯度增加的后檢測 的表達水平發(fā)現(xiàn)的表達隨著轉(zhuǎn)入劑量的增加而升高表現(xiàn)出較 好的劑量依賴性圖 瓢月中 硼匿三三三孫第二軍醫(yī)走學(xué)博士學(xué)位論文 墨 塑 哆 圖中外轉(zhuǎn)對在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)作用 在中與轉(zhuǎn)入的對照質(zhì)粒相比較的過表逃可以使

44、的 表逃隨著時問的延躍行增加表現(xiàn)山時間依賴的特點在中以梯度劑量轉(zhuǎn)入 厲可以使的表達水平梯度升高表現(xiàn)出劑量依賴的特點 恤 曲撲 在人膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白調(diào)控作用的研究 ? ?一妒 口拿 山 H已 洲■■■■ ■■■■■■ 圖 中外轉(zhuǎn)對在蛋白表達水平的上調(diào)作用 在中與轉(zhuǎn)入的對照質(zhì)粒相比較的過表達可以使的蛋白表 選隨著時間的延長而增加表現(xiàn)出時間依賴的特點在中以梯度劑量轉(zhuǎn)入斤 町以使的蚩白表達水平梯度升高表現(xiàn)出劑量依賴的特點 在細胞中驗證了對的上調(diào)作用之后為了了解這種可能的 調(diào)控機制是否具有普遍性我們又在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中重復(fù)了上述實驗 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中轉(zhuǎn)入過表達質(zhì)粒后與對照組相比較的 及蛋白表達水平都有了顯著升高并且這種升高也表現(xiàn)出時間和劑量依賴性 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)住論文 引 墨■五三亙蔓亟亙圄 廄皿盂磴出器地埔瞄顯懂蟆8出 ■ ■業(yè)口瑚VI皿山8刈鞠OO一觸