,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,實驗二 流感病毒的收獲及血凝效價測定,第一部分 流感病毒的收獲,實驗?zāi)康?掌握從雞胚尿囊腔收獲流感病毒的方法，獲得大量的病毒抗原。,實驗原理,將流感病毒接,種于雞胚尿囊腔后，,病毒就在尿囊的內(nèi),胚層細胞繁殖，繁,殖,12,天后，病毒顆,粒釋放至尿囊液中，,從而使尿囊腔中含,有大量病毒，通過收獲尿囊液，,可以得到較大量的流感病毒。,實驗材料及器械,1.,已接種流感病毒的十日齡雞胚,2.,無菌鑷子、眼科剪刀、玻璃吸管、無菌,EP,管（,1.5,和,10mL,各一個）,3.75,酒精棉球,實驗方法與步驟,收獲時間根據(jù)不同的病毒而異，流感病毒一般培養(yǎng),36,48,小時即可進行收獲。收獲前一天晚上，將雞胚于,4,冰箱過夜（如果急于收獲亦可于,20,放置,1,小時左右），將雞胚凍死，使紅血球凝固，這樣可避免在收獲時流出的血細胞，同尿液或羊水里的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度的下降。,4,冷藏時間不宜過長，過長易造成散黃，影響收獲?？焖倮鋬鰰r間也不易過長，一旦雞胚凍成冰塊就無法收獲。,2.,經(jīng)過冰凍的雞胚用碘酒、,75,酒精消毒雞胚氣室部卵殼,3.,用無菌鑷子將消毒過的殼打碎，輕輕揭去氣室部位卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，并將雞胚輕輕推向一側(cè)，壓住。,4.,用無菌吸管通過絨毛尿囊膜進入尿囊腔吸出尿囊液（無大血管處輕輕吸取清亮的黃色液體）。收取的尿囊液可無菌小瓶,第二部分 血細胞凝集實驗測定流感病毒效價,實驗?zāi)康?掌握血凝試驗的方法和原理，了解流感病毒具有凝集雞紅細胞的能力，掌握病毒類型的測定的一種方法。,血凝原理,血凝抑制原理,實驗材料及器械,1.,收獲的尿囊液（即流感病毒）,2.1%,雞紅血球、,0.85,生理鹽水,3.,血凝板、吸管、三角瓶,實驗方法及步驟,1.,第,1,孔加入,0.4ml,尿囊液，第,2,孔加入,0.1ml,尿囊液。,2.,吸取,0.9ml,生理鹽水于血凝板第,2,孔，從第,3,孔至第,10,孔每孔各加生理鹽水,0.4ml,。,3.,反復(fù)吹打,3,4,次第,2,孔，從混勻的第,2,孔中丟棄,0.2ml,，吸取,0.4ml,至第,3,孔混勻，再吸,0.4ml,至第,4,孔，依次稀釋到第,9,孔，第,9,孔經(jīng)稀釋吹打后吸出,0.4ml,，,棄去，第,10,孔為血球?qū)φ?，即不加尿囊液?以上各孔（從第,1,孔到第,10,孔）的病毒的稀釋度分別為：,孔數(shù),1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,稀釋度,病毒原液,1,：,10,1,：,20,1,：,40,1,：,80,1,：,160,1,：,320,1,：,640,1,：,1280,空白對照,注意：各孔內(nèi)液體量應(yīng)為,0.4ml,4.,從第,10,孔開始，按,10-1,的方向，向每孔加,0.4ml 1,雞紅血球，輕輕振蕩均勻，置室溫,45,分鐘后觀察實驗結(jié)果并記錄，各孔的總體積應(yīng)為,0.8ml,。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,病毒原液 紅細胞對照,依次加入,0.4ml 1,雞紅血球,實驗結(jié)果判斷,血凝結(jié)果以,+,、,+,、,+,、,+,、,表示。,紅細胞均勻分布于孔底者為,+,；,紅細胞均勻分布于孔底，但有卷邊現(xiàn)象為,+,，即不完全凝集；,紅細胞在孔底形成一個中等大小環(huán)狀，四周和中心有凝集以兩個加號,+,表示。,紅細胞在孔底形成一個小團，邊緣光滑圓潤者為,，紅細胞完全未被凝集；,實驗中應(yīng)注意的一些問題,1.,實驗所使用的玻璃器材及有機玻璃板均應(yīng)干凈，血凝板使用完畢及時處理，避免殘留的酸、堿和沉著的紅細胞影響實驗結(jié)果,2.,流感病毒是對溫度比較敏感的病毒，標本置于,20,時在一兩個星期內(nèi)會出現(xiàn)病毒效價減少的現(xiàn)象，一般需要在,70,存放。,3.,一般采取公雞的紅細胞，而且存放時間超過一周就不可再用。紅細胞采來后用,PBS,洗,3,到,4,遍，直到上清很清亮，放置后如果上清變紅，說明有溶血，則不可再用。,4.,溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)體系對血凝試驗的結(jié)果影響都很大。溫度過高病毒毒力過強會出現(xiàn)溶血，不利于判定。反應(yīng)的時間不能太長，對照孔出現(xiàn)沉淀就可以判定。,思考問題,加病毒液和紅細胞懸液時為什么要反向加？,血凝試驗設(shè)置空白對照的意義？,病毒懸液為什么采取倍比稀釋而不是更高倍數(shù)如十倍比稀釋？,