Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,LOGO,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,,雞蛋清中卵清蛋白的提取(tq)及其活性測定,生命科學(xué)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)操作(cozu)大賽,第一頁，共15頁。,雞蛋清中卵清蛋白的提取(tq)及其活性測定生命科學(xué)學(xué)院生,Contents,實(shí)驗(yàn)(shyn)目的,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理,實(shí)驗(yàn)(shyn)方法,實(shí)驗(yàn)材料及用品,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),實(shí)驗(yàn)步驟,第二頁，共15頁。,Contents實(shí)驗(yàn)(shyn)目的實(shí)驗(yàn)(shyn),實(shí)驗(yàn)(shyn)目的,1.掌握提取雞蛋清中卵清蛋白的基本原理和方法。,2.掌握紫外分光光度計(jì)的使用方法及注意事項(xiàng)。,3.掌握用紫外吸收(xshu)法測定蛋白質(zhì)活性，了解其他測定蛋白質(zhì)活性的方法。,第三頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)目的1.掌握提取雞蛋清中卵清蛋白的基本原,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理,一、沉淀法粗分離蛋白質(zhì),沉淀法是分離純化生物大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典方法，可分鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法等。,蛋白質(zhì)分子表面含有帶電荷基團(tuán)，這些基團(tuán)與水分子有較大的親和力，故蛋白質(zhì)在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白質(zhì)水溶液的穩(wěn)定性。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷被中和，水化膜被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出，這就是鹽析作用。,由于各種蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)所帶電荷數(shù)目不同，它們(t men)在蛋白質(zhì)表面上的分布情況也不一樣，因此，將不同蛋白質(zhì)鹽析出來所需要的鹽濃度也各異，鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合液中的各個成分分步鹽析出來，達(dá)到粗分離蛋白質(zhì)的目的。,第四頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理一、沉淀法粗分離蛋白質(zhì)第四頁，共15,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理,雞蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液(rngy)中析出，而卵清蛋白則在飽和硫酸銨溶液(rngy)中才能析出。,蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程，由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時，又能再溶解，因而可初步純化蛋白質(zhì)。,等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時溶解度最小來分離具有不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量因PH不同而變化，蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀，因此，在其他條件相同時，它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。,卵清蛋白的等電點(diǎn)為4.6-4.8，而球蛋白的等電點(diǎn)是5.1。,第五頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理雞蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵,蛋清中各種(zhn)蛋白的理化性質(zhì),名稱,比例,分子量,KDa,等電點(diǎn),卵清蛋白,52%,45,4.5,伴清蛋白,13%,78,6.6,溶菌酶,11%,28,4.0-4.3,卵類粘蛋白,3.5%,14,10.7,卵粘蛋白,1.5%,18(),400(),4.7,免疫球蛋白,1.0%,不同,不同,第六頁，共15頁。,蛋清中各種(zhn)蛋白的理化性質(zhì)名稱比例分子量K,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理,二、蛋白質(zhì)的活性測定,根據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，測定蛋白質(zhì)的方法有凱氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法等。,由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。,由于核酸在280波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)的測定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm處，如同時測定260nm的光吸收，通過計(jì)算可能消除(xioch)其對蛋白質(zhì)測定的影響，因此溶液中存在核酸時必須同時測定280nm及260nm的光密度，方可通過計(jì)算測得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。,第七頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)原理二、蛋白質(zhì)的活性測定第七頁，共15頁,實(shí)驗(yàn)(shyn)方法,一.蛋白質(zhì)提取,鹽析+等電點(diǎn)沉淀法,可用作鹽析的中性鹽有過硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、硫酸銨等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，硫酸銨在水中溶解度大，25可達(dá)4.1mol/L的濃度，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶解度的溫度系數(shù)變化較小，價廉易得；分段效果較其他(qt)鹽好，性質(zhì)溫和，即使?jié)舛群芨邥r也不會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時溶解度最小來分離具有不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的方法。,其他(qt)方法,（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法：低溫有機(jī)溶劑沉淀法,（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法：透析與超濾、凝膠過 濾法,（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離：電泳法、離子交換層析法,第八頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)方法一.蛋白質(zhì)提取第八頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)方法,二.蛋白質(zhì)活性測定,紫外吸收法,紫外線吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。,其他(qt)方法,凱氏定氮法，雙縮尿法、Folin酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)法,第九頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)方法二.蛋白質(zhì)活性測定第九頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)材料(cilio)及用品,1、材料：新鮮雞蛋,2、試劑(shj)：飽和硫酸銨、硫酸銨結(jié)晶、生理鹽水、1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白液,3、器具：紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、冰箱、電子天平,第十頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)材料(cilio)及用品1、材料：新鮮雞蛋第十頁，,實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟,一.卵清蛋白(dnbi)的提取,第十一頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟一.卵清蛋白(dnbi)的提取第,實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟,二.卵清蛋白(dnbi)活性測定：,（一）紫外吸收法測定卵清蛋白的含量,1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法,（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(huzh),按下表分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制(huzh)標(biāo)準(zhǔn)曲線。,試管號,試劑,1,2,3,4,5,6,7,8,9,提取液,標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,/mL,0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,1.0,蒸餾水,/mL,4.0,3.5,3.0,2.5,2.0,1.5,1.0,0,3.0,蛋白質(zhì)濃度,/mg/mL,0,0.125,0.25,0.375,0.50,0.625,0.75,1.0,A,280,第十二頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟二.卵清蛋白(dnbi)活性測定,實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟,（二）蛋白提取液中蛋白質(zhì)含量測定,1、提取液分別稀釋1倍、10倍、20倍后，取待測蛋白質(zhì)溶液1ml，加入蒸餾水3ml，搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線上查出經(jīng)稀釋的待測蛋白質(zhì)的濃度。,排除干擾：將待測蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋，在波長260nm和280nm處分別測出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白質(zhì)濃度。,2.計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260,（式中A280和A260分別是該溶液在280nm和260nm波長下測得的光吸收值）,第十三頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟（二）蛋白提取液中蛋白質(zhì)含量測定第十,實(shí)驗(yàn)(shyn)注意事項(xiàng),1,2,3,蛋白質(zhì)提取過程中須注意溫度(wnd)的控制，一般在20,以下進(jìn)行,調(diào)節(jié)等電點(diǎn)一定要準(zhǔn)確(zhnqu)，在本實(shí)驗(yàn)中，球蛋白和卵,清蛋白的等電點(diǎn)相差較小，若不準(zhǔn)確(zhnqu)，會導(dǎo)致蛋白,質(zhì)不純。,蛋白質(zhì)濃度過大，鹽析時發(fā)生共沉，分離效果不好。,蛋白質(zhì)濃度太稀，耗鹽量過大，蛋白質(zhì)回收率較低。一般蛋白質(zhì)濃度在,2.5%,3.0%,較適中,。,第十四頁，共15頁。,實(shí)驗(yàn)(shyn)注意事項(xiàng)1 23 蛋白質(zhì)提取過,Thank You!,第十五頁，共15頁。,Thank You!第十五頁，共15頁。,