單擊此處編輯母版標題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級,,第三級,,第四級,,第五級,,,,*,第三章 基因工程制藥,,概述,,一、基本概念,,DNA重組,（in vitro DNA recombination technology,）：,,,基因克隆,（gene cloning）,,,或分子克隆,（molecular,cloning）技術。,,基因工程,（gene engineering）,：,,,二、基因工程產(chǎn)生的基礎,,1 理論上三大發(fā)現(xiàn),,40,年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì),-DNA,,50,年代闡明了生物遺傳物質(zhì)的分子機制，,Watson and Crick,提出了,DNA,雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。,,60,年代確定了遺傳信息的傳遞方式,-,中心法則,,,,2 技術上三大發(fā)明,,限制性內(nèi)切酶和連接酶的發(fā)現(xiàn),,載體（Vector）的發(fā)現(xiàn)：載體相當于運送重組DNA分子到宿主細胞的車子,,逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能,,,一、重組DNA技術的基本過程,,基因工程要素,,目的基因的制備和分離,,DNA重組體的構(gòu)建,,DNA重組體擴增和表達,,重組體篩選和鑒定,,外源基因的表達,,表達產(chǎn)物的分離純化、鑒定,,,,,,載體,酶切,目的基因,重組體,導入受體細胞,擴增、抽提和鑒定,表達,表達產(chǎn)物的分離鑒定,大量生產(chǎn),基因工程的基本流程,,二、,基因工程的分類,,真核基因工程,,原核基因工程,,三、,重組DNA技術-基因工程與醫(yī)學的關系,,1.研究基因的結(jié)構(gòu)功能和活動的規(guī)律。,,2.為疾病的防治、診斷、預后及發(fā)病機理的研究開辟新途徑。,,3.研究細胞分化和胚胎發(fā)育的本質(zhì)問題。,,4.基因治療。,,5.促進基礎理論的研究。,,四、,基因工程技術制備藥物的優(yōu)勢,,制備很珍貴但利用傳統(tǒng)方法難以制備的藥,,可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進行深入研究，,,可以發(fā)現(xiàn)和挖掘更多的內(nèi)源生理活性物質(zhì)。,,內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白工程進行改造和克服。,,利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。,,,,第三節(jié) 基因工程的酶和載體,,第一部分：工具酶,,限制性內(nèi)切酶和甲基化酶,,DNA連接酶,,DNA多聚酶,,第二部分：基因工程的載體,,原核細胞（大腸桿菌）的常用載體：,,真核細胞載體,：,,,,,第一部分：工具酶,,一 限制性內(nèi)切酶和甲基化酶,,限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),,限制性內(nèi)切酶的生理功能,,限制性內(nèi)切酶的分類和命名,,識別和切割位點及切割片段的末端,,Ⅱ型酶的分類,,反應系統(tǒng),,限制性內(nèi)切酶的應用,,,1,限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease),,定義,,發(fā)現(xiàn),,Arber的假說 –限制修飾酶,,,,2,限制性內(nèi)切酶的生理功能,,構(gòu)成了細胞抵御外源入侵DNA的防御機制,,提供了細菌種屬間進行交叉繁殖的屏障，但又允許外源DNA有某些遺漏,,3,限制性內(nèi)切酶的分類和命名,,三種類型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型,,命名：EcoRⅠ,,E: Escherichia 屬,,Co:coli 種,,R: RY13株,,Ⅰ：該菌株第一個被發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切酶,,,4,Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶：,,識別與切割DNA鏈上同一個特異性核苷酸順序，產(chǎn)生特異性的DNA片斷。,,1）基本特性,,識別與切割DNA鏈上同一個特異性核苷酸順序,,切割片段的末端,,對dsDNA的兩條鏈同時切割，產(chǎn)生3種不同的切口：,,識別序列,：,,切割末端：,,,,5‘GTTAAG-3’,3‘CAATTG-5’,5‘GTT-3’,3‘CAA-5’,5‘AAG-3’,3‘-TTG-5’,平末端,5‘CTGCAG-3’,3‘GACGTC-5’,5‘CTGCA-3’,3‘-G,5‘G-3’,3‘ACGTC-5’,5‘-粘末端,Hpa,,I,Pst,,I,5‘GAATCC-3’,3‘CTTAAG-5,’,5‘-G-3’,3‘CTTAA-5’,5‘AATCC-3’,3‘G-5’,EcoR I,3‘粘末端,,5,Ⅱ型酶的分類,,A:Isochizomers(異源同工酶)，來源不同，識別順序相同的酶,。,,SmaⅠ,,,,XmaⅠ,,,它們識別順序相同，切割位點不同，產(chǎn)生平頭或粘性末端,。,,,C C C G G G,,G G G C C C,C C C G G G,,G G G C C C,,B:,,同尾酶,（,isocaudarner,）,,5’-GATC-3’,,3’-CTAG-5’,,5’-GGATCC-3’,,3’-CCTAGG-5’,,5’-AGATCT-3’,,3’-TCTAGA-5’,,,Mbo I,,,BamH I,,,Bgl II,,來源及識別序列不相同，切割后產(chǎn)生相同的粘性片段,,,,6,反應系統(tǒng),,組成：酶及活性緩沖液（buffer)：,,影響酶反應的因素：,,DNA的純度,,DNA甲基化程度,,DNA分子結(jié)構(gòu)：線性《環(huán)狀,,反應溫度,,反應系統(tǒng)組成,,,,,7,限制性內(nèi)切酶的應用,,DNA重組,,組建新質(zhì)粒,,組建DNA物理圖譜,,DNA的分子雜交,,制備DNA的放射性探針,,DNA的序列分析,,DNA甲基化堿基的識別與切割。,,二、,DNA連接酶,,功能:是指催化兩條分別具有5’-磷?；┒伺c3’-羥基末端的DNA單鏈連接形成磷酸二酯鍵的酶,,常用的連接酶：,,T4 DNA連接酶,,大腸桿菌DNA連接酶,,1 T4 DNA ligase,,來自T4感染的Ecoli，MR:68Kd，輔助因子：Mg2+ and ATP,,1）反應特性,,5’ACG-OH P-AATTCGT-3’,,TGCTTAA-P + OH-GCA-5’,,↓ATP Mg2+,,5’ACGAATTCGT3’,,3’TGCAAGTTCA5’,,,2）20,ul 反應體系:,,10*buffer 2ul(66 mM Tris-HCl, pH7.5,,,6.6 mM MgCl,2,, 10 mM MDTT,0.4,,mM ATP),,底物 10pM,,連接酶：,,3）反應溫度及時間：,,16℃，過夜,,4）用途：粘端DNA或切口間連接，也連接平末端,,,,2,大腸桿菌DNA連接酶,,來自Ecoli, Mr:7.4kDa, 輔助因子NAD+。,,作用：封閉雙螺旋DNA上具有5’磷酸?；?’羥基的缺口（nick）形成磷酸二酯鍵。無法封閉裂口（gap）。因此可連接粘性末端的DNA片斷，不能連接平末端的DNA片斷。,,用途：粘端DNA或切口間連接,,,三,DNA多聚酶,,聚合酶,,Taq DNA聚合酶,,逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase),,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidayl Transferase,）,,,,(一）,聚合酶,,功能：以DNA or RNA為模板，催化DNA and RNA的體外合成。,,以DNA為模板,,不耐熱聚合酶 耐熱聚合酶,,大腸桿菌DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶,,Klenow大片段酶 pfu聚合酶,,T4(T7)噬菌體DNA聚合酶,,以RNA為模板,,,反轉(zhuǎn)錄酶,,共 性：,,需要引物和模板,,不能起始新的DNA連，催化dNTP連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈3‘OH端；,,不發(fā)生從引物模板上解離,,,1 大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（,E.coli PolymeraseⅠ,）,,,來自E.coli細胞。Mr:109kD。 由單一多肽組成。沿DNA模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三種活性,：,,,5’-3’,,外切酶,N,,3’-5’,,外切酶,聚合,,酶,C,小片段,大片段（Klenow片段）,,1,）,5’→3’聚合酶活性,,在模版指導下，以4種dNTP為底物，催化單核苷酸接合到,DNA引物,的3’-OH末端。,,5’CCGOH 5’CCGATAGCCT,,GGCTATCGGA GGCTATCGGA,,催化合成的要求：模板，4種dNTP，引物，引物與模板形,,成正確的氫鍵配對,,三種活性：,,gap filling:在雙鏈DNA上的缺口部分的3‘OH末端上附加核苷酸，補平其鏈部分,,Nick translation:在雙鏈DNA的切口部分的3‘OH末端附加核苷酸，同時外切性除去5’末端的核苷酸。,,Strand displacement:通過在切口的3‘OH末端附加核苷酸達到置換據(jù)有5’-末端的鏈,,2）,雙鏈特異性的5’→3’外切酶活性,,無dNTP時，從5’末端降解,ds-DNA,成為5’單核苷酸。,,,5‘CGCATCG,,GCGTAATC,5‘CATTAG,,3’GCGTAAGC,PC 、PG,3）,單鏈特異性的3‘-5’外切酶活性,,無dNTP時從3‘-OH末端降解ss-DNA或游離3’_OH末端成為單核苷酸,。,5‘CGCATCG,GCG,5‘CGC,GCG,PA、PC、PT、PG,,,,,,5’-3’外切酶 3’-5’外切酶,,起始端 5’-P 3’-OH,,斷裂位置 末端磷酸二酯鍵 3’OH末端,,切除特點 配對的 不配對的,,脫氧核糖核苷酸,,核糖核苷酸,,,coli DNA PolⅠ在基因工程中的用途：,,制備高比活的DNA探針,,用于分子克隆,,DNA序列分析,,與DNaseI一起使用，進行切口平移,,通過Okayama_Berg合成cDNA的第二條鏈,,,,Klenow,,片段：,,,E.coli,DNA,聚合酶的一個大片斷。,MW:7.6KDa,。,,,具有聚合酶,I,的,5’→3’,聚合酶活性,,在模版和引物存在時，以,dNTP,做底物，沿,5’-3’,方向合成與模版互補的,DNA,。,,對單鏈,DNA,有,3’→ 5’,外切酶活性，較弱，不適于,3‘,突出端的平滑化,,無,5’→3’,外切酶活性。,,,,Klenow 片斷用途：,,填充用限制酶消化dsDNA的3’延伸末端,?平末端,。,,用,32,PdNTP進行補平反應，可對DNA 3’末端進行標記,,合成cDNA第二條鏈。,,寡核苷酸定向誘變中雙鏈DNA合成,,在Sanger ddNTP系統(tǒng)中進行順序分析。,,,,（二） Taq DNA聚合酶,,Taq DNA聚合酶是耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶。MW:6.5kDa.,,在模版及引物存在的條件下，催化與模版互補的脫氧核苷酸一次選擇性地連接在引物的3‘OH末端上的反應,,末端A, 即粘性末端,,5’→3’外切核酸酶活性,,有鏈置換的能力。,,無3’→ 5’ 外切核酸酶活性，無校對功能,,易突變,。,,Mg2+依賴酶,,,,用途：,,DNA序列分析；,,應用于聚合酶連反應（PCR）,對DNA分子的特定序列體外擴增(產(chǎn)物為粘末端）；,,,,pfu DNA Polymerase,,有DNA聚合酶活性,,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,,有3‘-5’方向的外切酶活性.,產(chǎn)物為平末端,,但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。,,常用于PCR反應,,高保真,,（三）、,逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase),,1 特性：,,依賴于RNA的DNA聚合酶，又稱RNA依賴的DNA聚合酶,,有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA,,產(chǎn)物DNA又稱cDNA,即互補DNA(Complementary DNA),,逆轉(zhuǎn)錄酶是一個多功能酶,,,,2,活性：,,將真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。,,單鏈DNA或RNA為模板時，使用反轉(zhuǎn)錄酶制備雜交探針。,,標記帶5‘突出端的DNA片斷。,,用于雙脫氧鏈法測序,,反轉(zhuǎn)錄PCR。,,（四）,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶,,（Terminal Deoxynucleotidayl Transferase）,,簡稱末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal Transferase）,,來自小牛胸腺，Mr:34kD,堿性蛋白質(zhì)。,,作用：,,在二價陽離子存在下，催化dNTP沿5‘-3’方向聚合作用逐個順序加于線性DNA分子的3‘OH末端。,,不需模版，4種dNTP任意一種可作前體物；只一種dNTP組成有一種核苷酸組成的3’尾巴，同聚物尾巴,,,用途：,,給載體或cDNA加上同聚尾。,,3‘末端用,32,P標記的dNTP標記。,,利用非放射性標記物生物素-11-dUTP滲入到DNA片段分子的3’末端。,,,第二部分：基因工程的載體,,,一、概述,,載體的概念（Vector）：凡來源于質(zhì)粒或噬菌體的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有傳遞運載外源DNA導入宿主細胞能力的DNA片段稱為載體,。,,,,,載體的功能及特征,,,運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞,,,為外源基因提供復制能力或整合能力,,,為外源基因的擴增或表達提供必要的條件,,,,載體應具備的條件,,,具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）,,具有合適的篩選標記,,具有較高的外源DNA的載裝能力,,具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點,,具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點,,,用于基因工程的載體,,質(zhì)粒（plasmid）,,噬菌體或病毒DNA,,考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒,,人造染色體載體,,,,質(zhì)粒(plasmid),質(zhì)粒的基本特征,,,質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子.,,質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中,,絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的,,絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA( covalenty, closed and circular double-stranded DNA),,質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 -- 300 kb,,,,質(zhì)粒DNA分子構(gòu)型：,,三種分子構(gòu)型：,,線性(sscDNA)：L-構(gòu)型,,環(huán)狀（OCDNA)：一條保持完整環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈有缺口，OCD構(gòu)型,,超螺旋：共價閉合環(huán)狀DNA(CCCDNA)，呈超螺旋構(gòu)型,,,,,線性,環(huán)狀,超螺旋,,OCDNA,,LDNA,,SCDNA,,質(zhì)粒的特性,,,質(zhì)粒的自主復制性,,質(zhì)粒具有不相容性,,質(zhì)粒具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力。,,攜帶特殊的遺傳標記,,,,,質(zhì)粒的自主復制性,質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制,,質(zhì)粒DNA上的復制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應關系,,根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲椭祁愋停?,嚴緊型復制控制的質(zhì)粒1 -- 3 拷貝,,松弛型復制控制的質(zhì)粒10 -- 60 拷貝,,質(zhì)粒的不相容性,任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。,,,以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：,,ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,,pSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,,p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,,,質(zhì)粒的不相容性：分子機制,,兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同。因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內(nèi)，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢,,兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定。,,,,,質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性,革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?,,接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等。,,,非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員,,,值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒,,的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由,bom,和,,mob,基因決定,,,攜帶特殊的遺傳標記,野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：,,物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物,,物質(zhì)合成：抗生素、細菌毒素、有機堿,,這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義,,,質(zhì)粒作為載體的優(yōu)缺點,,,優(yōu)點：分子量小，易操作。,,大多有抗性標記,,易導入宿主細胞,,,缺點：插入外源基因的片斷不能太大,,質(zhì)粒的分類,,人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：,,,高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000--3000 ，,擴增基因,,低拷貝質(zhì)粒來自pSC101 ，拷貝數(shù)小于10， 表達某些毒性基因,,溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì),,測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker,,整合質(zhì)粒裝有整合促進基因及位點，便于外源基因的整合,,穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因克隆,,表達質(zhì)粒,裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件,,探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選,,,（一）,質(zhì)粒-克隆載體,復制起始位點,多克隆位點,篩選標記,,克隆載體三個要素：,,,1）復制子：復制子又稱復制起始區(qū)，包含控制質(zhì)粒DNA復制起點和質(zhì)粒拷貝數(shù)等遺傳因素。,,2）選擇標記：,,由質(zhì)粒編碼的選擇標記賦予宿主細胞新的表型，用于鑒定和篩選轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細胞。,,最常見的選擇標記為抗生素抗性基因，包括氨芐青霉素（,amp,），四環(huán)素（,tet,），氯霉素（,cm,），卡那霉素（,kan,）和新霉素（,neo,）等。,,,,3）,多克隆位點：質(zhì)粒載體中由多個限制性內(nèi)切酶識別序列密集排列形成的序列稱之為,多克隆位點,（multiple cloning site, MCS）,。,,,,常用的質(zhì)粒克隆載體,,pBR322質(zhì)粒圖譜,4363bp;,,Ampr and tetr,,,拷貝數(shù)3000,,松弛型,,pUC18/19質(zhì)粒圖譜,,,（二）表達載體,,,表達載體具備的條件:,,,載體能夠獨立的復制 穩(wěn)定的遺傳復制、傳代能力，在無選擇壓力下能存 在于宿主細胞內(nèi)。,,強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。,,應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉(zhuǎn)錄。,,強的終止子。,,好的核糖體結(jié)合位點：SD序列、ATG,,目的基因插入位點,,篩選標記,,,,,2,表達載體分類：,,,①原核表達載體,,非融合蛋白表達載體：啟動子和核糖體結(jié)合位點,,啟動子包括λ噬菌體PL啟動子，T7噬菌體啟動子，,tac,啟動子，,trc,啟動子等,,融合蛋白表達載體。pET系列載體，硫氧還蛋白融合表達載體，Xpress表達系統(tǒng)，GST基因融合系統(tǒng)-pGEX系列載體等。,,,② 真核表達載體,,不帶病毒復制子,,帶病毒復制子,,真核表達載體含有原核基因序列和真核轉(zhuǎn)錄單位，能在大腸桿菌中自我復制，也能在真核細胞中進行表達。,,質(zhì)粒DNA的分離純化,,實驗室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：,,氯化銫密度梯度離心法,,質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染,,堿溶法,,質(zhì)粒DNA純度低、快速、操作簡便,,沸水浴法,,質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間,,,,,,,,,,二λ噬菌體載體,,,1 特點：,,噬菌體λ容量大,,噬菌體轉(zhuǎn)染宿主細胞的效率比大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率高2-3個數(shù)量級,,,2 常用的λ噬菌體載體：,,噬菌-體衍生物,,Cosmid,,,1)噬菌體衍生物,,噬菌體λ是雙鏈DNA病毒,,基因組長度為48502bp,,分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當感染宿主細胞后線性DNA分子會迅速籍助粘性末端互補連接成環(huán)，連接區(qū)域稱為COS（cohesive site）位點。,,,,,,λ-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度,,野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長度，可以提高裝載量。,,,其實野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將λ-DNA載體分成兩大類載體：,,插入型載體,,取代型載體,,,,,,,λ-DNA作為載體的優(yōu)點：,,,λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量。,,,重組λ-DNA分子的篩選較為方便,,,λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因,,,2) Cosmid （考斯質(zhì)粒，粘性質(zhì)粒）,,Cosmid質(zhì)粒是將質(zhì)粒和COS粘性末端構(gòu)建的克隆載體。,,長度約4-6kb，克隆的真核基因DNA大約在31-45kb。,,,特點：,,具有λ噬菌體粘性末端特性,,具有質(zhì)粒載體抗藥性標記特性,,具有一個或多個限制性酶切位點,,具有高容量的克隆能力,,接上真核細胞的表達元件，能在真核細胞中表達和生存。,,,,應用：,,人造染色體載體,人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb 的DNA片段， 此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。,,,目前常用的人造染色體載體包括：,,細菌人造染色體（BAC）,,酵母人造染色體（YAC）,,,細菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子FF質(zhì)粒的基礎上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 -- 300 kb之間，各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。,,,pBACs主要適用于：,,克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu),,構(gòu)建動植物基因文庫,,,酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,,基因工程的宿主細胞,條件：,,限制性缺陷型,,外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（,recB,-,，,recC,-,，,hsdR,-,）,,重組整合缺陷型,,用于基因擴增或高效表達的受體細胞（,recA,-,）,,具有較高的轉(zhuǎn)化效率,,具有與載體選擇標記互補的表型,,感染寄生缺陷型,,防止重組細菌擴散污染，生物武器除外,,,原核：細菌：大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌等,,真核：酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等,,大腸桿菌,,,遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定,,,產(chǎn)結(jié)構(gòu)復雜、種類繁多的內(nèi)毒素,,,適用于外源DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達、基因文庫的構(gòu)建，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌,,,,枯草桿菌,,,遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素,,適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌,,遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備,,,,酵母菌,具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定,,,內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高,,,適用于外源DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達調(diào)控的研究，是DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌,,,,昆蟲細胞（家蠶）,,,具有真核生物的特征，外源基因表達量高，繁殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定,,,適用于真核生物基因的高效表達,,,DNA重組操作系統(tǒng)欠完善,,,,哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO）,,與人的親緣關系近，分子重組表達系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng),,,細胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢,,,適用于哺乳類動物和人的基因表達調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體,,,,實驗室常用的基因工程受體,,,大腸桿菌：,,,用于接受質(zhì)粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（,Ap,s,、,Tc,s,、,Cm,s,）,,用于接受λ-DNA：LE392、ED8654,,,酵母菌：,,畢赤酵母,,啤酒酵母,,,哺乳動物細胞CHO,,,,第四節(jié),目的基因的制備,,生物合成基因未知,,基因文庫組構(gòu)建,,cDNA 文庫,,生物合成基因已知(GeneBank可查),,聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）,,逆轉(zhuǎn)錄PCR（retrotranscription PCR， RT－PCR）,,化學合成,,,基因工程或DNA重組技術三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調(diào)控機制和生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。,,一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：,,一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克?。?,另一類是利用PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。,,一、,尋找目的基因,,1 基因組文庫（genomic DNA library）：,,是指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片斷隨即的同相應的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列，包括外顯子和內(nèi)含子序列 。,,,,,基因組文庫應用：,,1）原核生物目的基因的分離（目的基因在質(zhì)粒上）,,提取,質(zhì)粒DNA,→限制性酶切→從DNA凝膠電泳回收不同大小的片段→與載體連接構(gòu)建物理圖譜→探針雜交→分離目的基因。,,2 ）鳥槍法分離基因（目的基因在染色體DNA上）：,,用限制性內(nèi)切酶將,染色體DNA,酶切，得到很多同一般基因大小相當?shù)腄NA片斷，然后將這些片斷混合物隨即重組入適當?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌種擴增，再用適當?shù)姆椒êY選出需要的基因：,,,,鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略,染色體DNA的切斷,,超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端,,全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控,,部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整,,,與載體連接,,如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體,,,受體細胞；,,如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受體細胞,,如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞,,,篩選含有目的基因的目的重組子,,菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）,,,鳥槍法克隆目的基因的局限性,,,工作量較大，需要了解目的基因的背景知識,,,不能獲得的最小長度的目的基因,,,不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu),,,,2 真核生物基因組文庫-（cDNA文庫含內(nèi)含子,）,,cDNA文庫（cDNA library）建立：,,從真核細胞分離總RNA,純化出mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA,再在聚合酶作用下合成cDNA第二條鏈,然后將雙鏈cDNA插入到載體內(nèi),構(gòu)建重組體,轉(zhuǎn)入宿主菌,得到的克隆總和成為該類細胞的cDNA文庫.,,,cDNA,文庫特征：,,包含成熟,mRNA,的全部信息,,,即包含該細胞內(nèi)表達的全,,部蛋白的編碼信息,.,,,它只包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被 轉(zhuǎn)錄成,,mRNA,的那些基因序列。其復雜性比基因組文庫低。,,由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達的所決定的，因此各自的,mRNA,的種類就不同，由此而產(chǎn)生獨特的,cDNA,文庫。,,,,cDNA法克隆目的基因的局限性,,,并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu),,細菌或原核生物的mRNA半衰期很短,,mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，,,分離純化困難,,僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因,,,,二.制備目的基因,,,（一）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）,,1 基本原理 :根據(jù)堿基配對原則利用DNA聚合酶催化和dNTP的參與下，引物依賴于DNA模板特性引導DNA的合成。,,,使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或,,DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙引物,,,變性（denaturation）：94℃ 3-5min.,,退火（annealing）：55-60℃，1min左右。,,延伸（extension）：72℃，1min.,,從引物的3’-OH進行延伸，合成方向為5’-3’,從而合成2分子與原來基因相互補的片段，每循環(huán)一次，DNA分子按指數(shù)倍增。一般可得到100bp-5000bp的目的基因。,,,,,,PCR反應要點,,1）模板,,DNA模板：0.05-1ug，含單拷貝基因數(shù)3*10,5,，,,RNA模板：RNA→cDNA,,2）DNA聚合酶,,Taq DNA聚合酶：耐高熱，粘末端產(chǎn)物,,Pfu DNA聚合酶：高保真酶。平末端產(chǎn)物,,3）緩沖系統(tǒng)：,,4）dNTP濃度：,,5）引物設計原則：,,PCR各要素及其作用,（1） 模板,,PCR模板可以是DNA或RNA。,,以線性DNA模板為佳，量適中，一般為10,2,?,10,5,個拷貝；,,RNA作為模板時，需要：,,RNA cDNA PCR, 稱此為RT-PCR.,,（2）耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶),,是從耐熱細菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→ 55℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。,,在PCR中，Taq DNA聚合酶應用最廣泛。,,逆轉(zhuǎn)錄,,引物,,引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為15,?30個堿基。,,引物是,保證PCR擴增產(chǎn)物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。,,引物設計原則如下：,,,引物設計應符合以下基本原則,長度適宜，一般為15,?30個堿基；,,,引物的有效長度不能大于 38 mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（72℃），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性,,,G+C含量，一般為40％,?60％；,,G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,,,4種堿基應隨機性分布；,,ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,,,,,引物自身不應存在互補序列；,,,兩個引物之間不應有多于4個堿基的互補；,,避免兩條引物間互補， 特別是 3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶,,,引物3ˊ端不應有任何修飾；,,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗,,,引物5ˊ可以修飾。,,,,,引物的特異性：,,引物必須經(jīng)GenBank查詢后，證實沒有與其他非目的DNA有高度互補，才能使用。,,引物量：,,每條引物的濃度0.1-1umol或10-100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會,,,（4）緩沖溶液與Mg,2+,,,PCR技術常用10,?50mmol/L Tris-HCl、Ph8.3?8.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的,Mg,2+,濃度；,,（5）dNTP濃度,,,PCR一般用50,?200,μmol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；,濃度過高可引起會造成雜帶、特異產(chǎn)物帶不清晰等不好的結(jié)果，濃度過低則得不到所需的產(chǎn)物。最可靠的做法是先做濃度對照,再根據(jù)結(jié)果決定最佳條件,,,參數(shù),變性溫度與時間,,,一般選擇： 94,0,C， 30秒,,退火溫度與時間,,,取決于引物長度、濃度和G+C含量，,,一般選擇： Tm - 5℃,,延伸溫度與時間,,,一般選擇： 70℃,?,75℃,,循環(huán)次數(shù),,,取決于模板濃度， 一般循環(huán)：30次,,,PCR操作,,各種PCR反應的操作基本相同，只是根據(jù)引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環(huán)參數(shù)。將PCR反應管置于DNA自動化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使DNA擴增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。,,,PCR技術優(yōu)點,,特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。,,,PCR缺點,,由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。,,PCR產(chǎn)物分析,（1）凝膠電泳分析法,,,可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。,,同時應以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照。,,（在待檢靶序列拷貝數(shù)多、且僅擴增出一條帶時，用此法即可滿足檢測要求。）,,,點雜交分析法,該法有2種：,,①將擴增產(chǎn)物直接固定在膜上，每一個探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進行雜交；,,②將不同的探針固定在膜上，再用有標記的PCR產(chǎn)物與之雜交。,,本法有助于檢測突變DNA類型，用于人類遺傳病診斷合某些基因的分析。,,(當擴增產(chǎn)物時多條帶時，用此法更合適。),,,PCR應用,,,基因結(jié)構(gòu)的研究：基因組制圖預測序；分子雜交探針；DNA定型；PCR直接測序；利用免疫PCR檢測抗原和抗體。,,基因表達與調(diào)控研究：mRNA檢測；調(diào)控元件分析；蛋白質(zhì)和DNA相互作用的研究。,,基因工程上構(gòu)建5‘端內(nèi)切酶接頭，構(gòu)建cDNA文庫。,,醫(yī)學上用于遺傳及傳染性疾病的基因診斷。,,制藥中篩選抗腫瘤抗生素。,,鑒別菌株,,,（二）,逆轉(zhuǎn)錄PCR（retro-transcription PCR， RT－PCR）,,mRNA的純化,,cDNA第一鏈的合成,,cDNA第二鏈的合成,,,,mRNA的特征及純化,,,含量低，占總RNA的1-3%,大小不均。,,3’端含50-250個A（多聚腺嘌呤核苷酸）,,純化利用Oligo（dt)固定相（生物素化寡脫氧胸腺核苷酸）。,,總RNA流經(jīng)固定相，mRNA吸附于固定相上，tRNA和rRNA流出。,,洗脫，收集mRNA。,,,,,,（三）DNA化學合成,,一般DNA合成都采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶聯(lián)等優(yōu)點，已在DNA化學合成中廣泛使用。,,DNA化學合成不同于酶促的DNA合成過程從5‘→3’方向延伸，而是由3‘端開始。,,具體的反應步驟如下：,,,,,全基因合成,化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種策略。,,,,,,,,化學合成法的基本策略,,全基因合成,,上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%,,則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%,,,,,重組DNA技術的操作過程,A ：DNA的體外重組（切、接）,,,B ：重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增）,,,C ：轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,,,,,,,,,第五節(jié),DNA的體外連接,,載體DNA與目的基因DNA片段通過連接酶催化連接，形成,重組子（recombinant）,，稱為DNA分子體外重組。,,,,一 連接反應機制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,重組率,重組率的定義,,重組率= 含有外源DNA的重組分子數(shù)/ 載體分子總數(shù),,在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25 - 75%,,重組率是衡量連接反應效率的重要指標，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。,,,,,,,,,,第六節(jié)重組DNA分子的轉(zhuǎn)入和擴增（轉(zhuǎn)與增）,,,重組DNA分子導入受體細胞的原理與技術,,轉(zhuǎn)化率,,轉(zhuǎn)入細胞的擴增,,,受體細胞（宿主細胞）,,原核細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌,,真核細胞：酵母、哺乳動物細胞、昆蟲及植,,物細胞等。,,,受體細胞選擇：,,,,限制酶缺陷型菌株（R,-,，Restriction Negtive）-,,重組缺陷型菌株(Rec,-,,Recombination Negtive)-,,互補功能 ：,,感受態(tài)（competent）細胞：,,,,常用的導入方法,,轉(zhuǎn)化（transformation）：以質(zhì)粒DNA或重組DNA導入受體細胞，從而使受體細胞遺傳性狀發(fā)生改變的過程，最常用的有效的基因克隆方法之一。,,轉(zhuǎn)染（transfection）：將溫和的噬菌體、病毒或以其為載體構(gòu)建的重組體，體外包裝成具有感染性的病毒顆粒，然后直接感染大腸桿菌，使其進入宿主細胞。這種由寄主細胞捕獲裸露噬菌體的過程稱為轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化的特殊形式,,CaCl,2,轉(zhuǎn)化法,,,Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化：,,Ca,2+,誘導的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術，其原理是Ca,2+,與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)。,,,大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備,,100 ml 菌體培養(yǎng)至OD,600,,= 0.5，離心收集菌體,,用10 ml 冰冷的10 mM CaCl,2,溶液懸浮菌體，離心收集菌體,,用1 ml 冰冷的75 mM CaCl,2,溶液懸浮菌體,,冰浴放置12 - 24小時，備用,,,,大腸桿菌感受態(tài)細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,,取100 μl 感受態(tài)細胞，加入相當于50 ng 載體的重組DNA連接液，混勻,,冰浴放置半小時,,在42℃保溫2 分鐘（熱脈沖）,,快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘,,加入1 ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1 小時（擴增）,,涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選,,,細菌原生質(zhì)體,（Sepheroplast）,的轉(zhuǎn)化,,革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質(zhì)體（細胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子,,酵母菌、霉菌、植物細胞也可用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化,,,細菌原生質(zhì)體的制備,不同細菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：,,細菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所,,有器皿應保持無水無去污劑。,,,,細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,,取0.2 - 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（10,8,-10,9,個原生質(zhì)體），加入10 - 20 μl DNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca,2+,的等滲溶液，混勻,,,細菌原生質(zhì)體的再生,,原生質(zhì)體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素,,,λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染,(transfection),,,λ,重組體體外包裝，將以λDNA或Cosmid為載體構(gòu)建的重組DNA倒入大腸桿菌，在宿主細胞內(nèi)繁殖的過程,。,,,感受態(tài)細胞的培養(yǎng)：,,將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl,2,的培養(yǎng)基,,中培養(yǎng)至OD,600,= 0.5,,,吸附：,,加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘,,,轉(zhuǎn)染裂解：,,加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時，直至培養(yǎng)液,,中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選,,,電穿孔轉(zhuǎn)化,電擊法，又叫電穿孔法(electroporation),,將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)。,,,電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)的受體細胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。,,,同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實驗,,,重組DNA分子導入酵母菌,電感受態(tài)細胞制備：從新鮮平板挑取單菌落,?,接入2 mL YDP試管,?,28℃，220rpm,培養(yǎng)24h,?,吸取100ul轉(zhuǎn)接入50 mL YDP,?,28℃，220rpm,,?,OD600=1.3-1.5,?,離心,?,菌體用50mL冰浴無菌水洗滌（兩次）,?,用25mL預冰的1M山梨醇洗滌,?,離心,?,菌體懸浮于2ml冷山梨醇,?,電感受態(tài)細胞,,電轉(zhuǎn)化,,重組DNA線性化與上述感受態(tài)細胞混合,?,冰浴放置5min,?,電轉(zhuǎn)化（1.5kv,25uF，5-6ms）,?,立即加入200µl 1M冷山梨醇,?,混勻后轉(zhuǎn)入EP管，于30℃震蕩培養(yǎng)30min,?,將轉(zhuǎn)化子涂于含抗性的MD平板,?,30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出,,影響電穿孔導入DNA的因素：,,外加電場的強度,,哺乳動物：250-750V/cm,,酵母一般在1500V/cm,,電脈沖時間20-100ms；,,工作溫度0-25℃；,,DNA構(gòu)象和濃度，線狀比環(huán)狀好，濃度1-40u/ml；,,阻抗：200-400Ω,,,,重組DNA導入鏈霉菌中,,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,,接合轉(zhuǎn)移,,電脈穿孔,,噬菌體轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)導,,,,（一）,原生質(zhì)體法,,1：制備:,,2ml新鮮種子液接入50ml培養(yǎng)基,?28℃培養(yǎng)?離心收集菌體（3000rpm 10min）?菌絲體用10.3%蔗糖洗滌兩次?懸浮于溶菌酶溶液中?,,30 ℃培養(yǎng)?相差顯微鏡觀察原生質(zhì)體形成?溫和離心?除去菌體? 上層溶液離心?收集原生質(zhì)體?懸浮于P溶液中,,2：,轉(zhuǎn)化：,,20ul重組DNA,?,0.05ml原生質(zhì)體（顯微計數(shù)>10,6,),?混勻，立即加0.5ml T緩?加入0.5ml P緩?離心?沉淀懸浮于1ml P緩?200ul 涂平板?30 ℃培養(yǎng)想培養(yǎng)至菌落長出,,（二）,接合轉(zhuǎn)移,,,DNA以單鏈的形式進入宿主菌。從大腸桿菌到鏈霉菌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移需要順式轉(zhuǎn)移起始點(oriT)和反式轉(zhuǎn)移功能（tra）。供體一般用大腸桿菌S17-1菌株，它含有具接合功能的整合型RP4，可以介導質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，在鏈霉菌受體中DNA可以以質(zhì)粒的形式或整合形式存在,,（三）,電穿孔,,在電脈沖條件下，質(zhì)粒DNA可以從細胞中釋放或被吸收。Devies J等利用S.paroulus and S.vinaceus NCIB 8852 整個菌體進行電穿孔，比原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率提高10-100倍。將含質(zhì)粒的鏈霉菌菌絲懸液與大腸桿菌感受態(tài)細胞用電脈沖刺激，可以將質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)移至大腸桿菌。,,（四）噬菌體轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)導,,對于某些限制修飾較強的鏈霉菌，該法比較有效。應用帶正電荷無DNA脂質(zhì)體可增加轉(zhuǎn)染的效率。,,,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標，其定義為：,,,每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,載體遺傳標記檢測,,,克隆DNA序列檢測,,,外源基因產(chǎn)物檢測,,,,,,載體遺傳標記檢測,抗藥性篩選法,,基本原理：,,利用載體上的遺傳學標記如抗生素抗性基因,,,外源基因插入載體并轉(zhuǎn)入受體細胞后，使受體細胞獲得或缺失這些標記表型 。,,插入失活法,,插入表達法,,抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子,,,插入滅活法(insertion inactivation),適用于具有兩個或兩個以上選擇標記的質(zhì)粒,,如:pBR322的雙抗生素抗性標記,,可鑒別出重組體和非重組體,,,,,,,,,插入表達法,,,二.營養(yǎng)缺陷型篩選法（遺傳互補法）,,,其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子。,,,營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。,,,,三.顯色篩選法,,,顯色篩選法的基本原理：,,載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的,lacZ’,基因（藍色反應）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的,melC,基因（黑色反應）等,,,顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。,,藍白篩選,,pUC載體及其衍生質(zhì)粒含有,lac,Z基因,,該基因編碼大腸桿菌β-半乳糖甘酶α氨基端的α互補肽段，,,宿主細胞的β-半乳糖甘酶α缺陷型。,,在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，含有該類載體的宿主細胞的兩個互補肽段產(chǎn)生活性，可分解培養(yǎng)基上的底物—5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal），形成藍色菌落。,,當外源基因插入,lac,Z基因內(nèi)部的多克隆位點，X-gal的培養(yǎng)基的重組子由于,lac,Z基因的插入失活而呈白色，而含有空載體的宿主細胞顯藍色，從而達到被鑒定篩選的目的。,,,,,,四.,噬菌斑形成篩選法,噬菌斑形成篩選：,,噬菌體包裝外源DNA分子后重組分子的長度為其野生型的75％～105％時，能形成有活性的噬菌體顆粒 ，并在平板上出現(xiàn)清晰的噬菌斑。,,克隆DNA序列檢測,限制性酶切圖譜法,,所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Southern blot,鑒別DNA的雜交稱為Southern blot。雜交的受體是DNA片斷，探針可用DNA也可用RNA.,,,步驟：,提取重組DNA或基因組DNA→限制性酶切→ DNA凝膠電泳分離→ 轉(zhuǎn)膜→雜交（用各種標記的DNA或RNA探針）→顯色或曝光→確定與探針互補的電泳條帶的位置,,Northern blot,鑒別RNA的雜交稱為Northern blot。雜交的受體是RNA片斷，探針可用DNA也可用RNA,受體從DNA凝膠轉(zhuǎn)移到NC上，與探針片段進行雜交,。,,,提取細胞RNA → 電泳分離 → 轉(zhuǎn)膜 雜交→ 檢測,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Western blot,SDS－PAGE →轉(zhuǎn)膜→第一抗體→酶標第二抗體→ 顯色反應,,ELISA,（enzyme linked immunosorbent assay）,,可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體,,可檢測ng水平的蛋白質(zhì),,酶標儀,,,,,4 固相反射免疫測定：,,原理同ELISA,,,5 免疫沉淀反應：,,可檢測mg/ml水平的蛋白質(zhì),,,6 放射免疫沉淀反應 可溶性抗原與特異性抗體的結(jié)合； 細胞中提取的蛋白質(zhì)混合物中靶抗原的定性與定量； 選擇性好，特異性高；100pg；,,,步驟：1）標記可表達靶蛋白的細胞；,,,35,S-甲硫氨酸/半胱氨酸；,125,I；,,2）裂解細胞；,,3）形成特異性免疫復合物；,,4）收集并純化免疫復合物；,,5）分析免疫沉淀物中的放射性標記蛋白。,,,基因表達,基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。,,大腸桿菌表達系統(tǒng),,鏈霉菌表達系統(tǒng),,酵母表達系統(tǒng),,,一,、大腸桿菌表達系統(tǒng),,,大腸桿菌作為外源基因的表達宿主優(yōu)勢：,,遺傳背景清楚,,技術操作簡便，培養(yǎng)條件簡單，培養(yǎng)周期短,,目標基因表達水平高,,可大規(guī)模發(fā)酵且較經(jīng)濟,,是目前應用最廣泛、最成功的表達體系。,,,（一）目的基因,基因編碼序列的5’端使用偏倚密碼子更能提高表達效率,,目的基因處于正確的閱讀框架,,大腸桿菌表達真核基因應注意,,,使用大腸桿菌啟動子：真核基因必須