Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,研究背景,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkins lymphoma,，,HL,，,Hodgkins disease,，）是,惡性淋巴瘤,的一個(gè)獨(dú)特類型。,研究背景,其特點(diǎn)為：臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。原發(fā)于結(jié)外淋巴組織的少見。,研究背景,瘤組織成分多樣，但,HL,特異性的病理改變?yōu)?大量反應(yīng)性增生的背景淋巴細(xì)胞中可見少于,1%Reed-Sternberg,細(xì)胞（,R-S,細(xì)胞）。,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來源于,B,淋巴細(xì)胞,(,鏡影細(xì)胞,),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突變,EB,病毒感染,但證據(jù)均不足，,HL,的發(fā)病機(jī)制,尚未明確,腫瘤細(xì)胞,研究背景,有研究發(fā)現(xiàn),NF-B(RelA/P50),的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。,1,IB,作為重要的,NF-B,通路,抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。,研究背景,將對(duì),IB,激酶（,IB kinase,IKK,）無反應(yīng)的,IB,突變體導(dǎo)入,HRS,細(xì)胞中可阻斷,NF-B,的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說明,IB,在,HL,發(fā)病機(jī)制中有重要作用。,2,研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,細(xì)胞中,IB mRNA,高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與,HL,中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由,IB,蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。,3,用已知IB外顯子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。,但證據(jù)均不足，HL的發(fā)病機(jī)制,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物03 l，補(bǔ)所需ddH2O使反應(yīng)體系達(dá)到50 I。,巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nested polymearse chain reaction,nPCR)也稱套式PCR。,為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增時(shí)采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第1輪擴(kuò)增共用，。,（藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G）,EnVision兩步法,電泳條帶在同一水平線上。,Thank you！,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來源于B淋巴細(xì)胞(鏡影細(xì)胞),CD30單抗（Dako公司，克隆號(hào)BerH2，效價(jià)1：20）,加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。,2 Dejardin E,et al.,如果片段在800以內(nèi)，那么隨便進(jìn)行一個(gè)方向就能測(cè)出你全部的序列了,DAKO EnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即EnVision）直接放大信號(hào)40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。,霍奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類型。,擴(kuò)增IB第三到第六外顯子反應(yīng)體系：,Blood,1999,94(9):3129-34.,PCR引物（北京賽百勝公司）,研究目的,本實(shí)驗(yàn)意在：,了解,IB,基因在,HL,中突變的情況；,分析經(jīng)典型,HL HRS,中,IB,突變的特點(diǎn)、可能造成的蛋白結(jié)構(gòu)異常；,以及這些異常的病理意義，即其與,HL,發(fā)病的相關(guān)性。,實(shí)驗(yàn)材料與試劑,霍奇金淋巴瘤組織樣本,CD30,單抗,（,Dako,公司，克隆號(hào),Ber,H2,，效價(jià),1,：,20,）,Leica ASLMD,激光顯微,系統(tǒng),PCR,引物,（,北京賽百勝公司,）,PCR,儀（包括反應(yīng)體系）,DNA,測(cè)序儀,實(shí)驗(yàn)流程,CD30,免疫組化,激光顯微切割和,DNA,提取,IB,基因擴(kuò)增,PCR,產(chǎn)物檢測(cè),待測(cè)基因外含子,測(cè)序,CD30,免疫組化,采用,EnVision,兩步法,。,將冰凍組織切成,6,m,厚連續(xù)切片，貼于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,05,NP40,的丙酮,(v,v),固定,10 min,，室溫下自然干燥；,CD30,免疫組化,6,H2O2-,甲醇，,37,10 min,，消除內(nèi)源性過氧化物酶；,加,1,：,20,稀釋的一抗；,加相應(yīng)的二抗，,DAB,顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。,激光顯微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的,CD30,陽(yáng)性細(xì)胞,（,切割參數(shù)：激光強(qiáng)度,37,，波長(zhǎng),377,，速度,5,，光束直徑,8,）,。,將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本,3,6,組，每組約,25,70,個(gè)細(xì)胞。,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例,2,管，,每管約,50,個(gè)細(xì)胞。,擴(kuò)增目的基因，上游引物：,5,-CACACTGTGCCCATCTACG-3,，下游引物：,5,一,GGTc1-ITI,GCGGATGTCCAC,一,3,。,（緩沖體系：,10X,反應(yīng)緩沖液,2,5,l,，,MgCL,2,(25 mmol,L)1,5,l,，,dNTP(10 mmoL,L)1,0,l,，上游引物,(10,moL,L)0,5,l,，下游引物,(10,mol,L)0,5,l,，,Taq,酶,(5 U,L)0,3,l,，,模板,2,0,l,，總體積,25,l,。反應(yīng)條件：,94,預(yù)變性,5 min,，,94,變性,1 min,，,55,退火,1 min,，,72oC,延伸,1 min,，共,40,個(gè)循環(huán)，,72,延伸,7min,，至,4,結(jié)束。,以雙蒸水代替,DNA,模板作為陰性對(duì)照。）,IB,基因擴(kuò)增,對(duì),HRS,細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的,IB,6,個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式,PCR,擴(kuò)增。,用已知,IB,外顯子,PCR,擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。,PCR,擴(kuò)增反應(yīng)體系,擴(kuò)增,IB,第一和第二外顯子反應(yīng)體系：,10 X PCR,緩沖液,5,0,1,，,MgC1,：,(25mmoi,L)5,0,Ixl,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0,l,，,DMSO2,0,l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,pJ)1,0,l,，,DNA,模板,(0,5 g,IL1)2,0,l,，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物,1,Ixl,；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物,0,3,l,，補(bǔ)所需,ddH2O,使反應(yīng)體系達(dá)到,50,I,。反應(yīng)條件：預(yù)變性,95,，,5min,，繼而,95,變性,50 s,，,65,退火,30 s,，,72,延伸,90 S,，共,35,個(gè)循環(huán)，最后,72,延伸,10 min,。第二輪，反應(yīng)體系,50,l,，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物,1,25,l,。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加,2,l DMSO(,擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加,DMSO),。反應(yīng)條件同第一輪。,擴(kuò)增,IB,第三到第六外顯子反應(yīng)體系,：,第一輪，,l0,PCR,緩沖液,5,0,Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,L)4,0 l,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,L)1,0,l,，,DNA,模板,(0,5,g,L)2,0,l,，引物,1,l,。反應(yīng)條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，但退火溫度為,63,。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為,1,25,L,。反應(yīng)條件為預(yù)變性,95,，,5 min,，繼而,95,變性,50 S,，,65,退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,個(gè)循環(huán)，最后,72,延伸,10 min,。）,PCR,產(chǎn)物檢測(cè),取,5,l PCR,產(chǎn)物，用,2,瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流,120 mA,，,20 min,。,紫外燈下觀察。,IB,的,6,個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon5(381bp),和,exon6(441bp),。,預(yù)期結(jié)果,電泳,電泳條帶不在同一水平線上,基因明顯突變。,預(yù)期結(jié)果,電泳,電泳條帶在同一水平線上。,沒有突變,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,待測(cè)基因外含子,測(cè)序,每管,DNA,樣品都要擴(kuò)增,2,次，使用上海博亞公司,ABI377DNA,測(cè)序儀對(duì),PCR,陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2 l DMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。,第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為125 L。,IB基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,其特點(diǎn)為：臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nested polymearse chain reaction,nPCR)也稱套式PCR。,6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；,Leica ASLMD激光顯微系統(tǒng),電泳條帶在同一水平線上。,第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為125 L。,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,2 Dejardin E,et al.,EnVision兩步法,Thank you！,擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加2 l DMSO(擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加DMSO)。,每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，使用上海博亞公司ABI377DNA測(cè)序儀對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,Blood,1999,94(9):3129-34.,C、D分別為沒有突變的正、反向測(cè)序,Emmerich等人的研究表明HRS細(xì)胞中IB mRNA高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與HL中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由IB蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。,電泳條帶不在同一水平線上基因明顯突變。,一個(gè)是正向引物（上游引物），用它來測(cè)序就是正向測(cè)序(從上游往下測(cè)序)，也就是5到3,預(yù)期結(jié)果,測(cè)序,堿基序列出現(xiàn)改變,圖,A-,箭頭處為,T-A,突變（,TGA,為終止密碼）,圖,B-,反向測(cè)序證實(shí),（藍(lán)色,-C,紅色,-T,，綠色,-A,，黑色,-G,）,預(yù)期結(jié)果,堿基序列沒有突變,C,、,D,分別為沒有突變的正、反向測(cè)序,預(yù)期結(jié)果,腫瘤細(xì)胞,I,B,基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞,I,B,基因沒有突變。,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的,I,B,基因都沒有突變。,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的,I,B,的突變率都增加,IB,基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關(guān),IB,基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,估計(jì)不會(huì)發(fā)生這種情況，如若發(fā)生則需要進(jìn)一步研究,參考文獻(xiàn),1 Bargou R.C,et al,.Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.,2 Dejardin E,et al,.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,Oncogene,1999,18(16):2567-77.,3 Emmerich F,et al,.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB a