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分子生物學在獸醫(yī)中的應用,目錄,,一：分子生物學技術在中獸醫(yī)藥學中的應用進展,中獸醫(yī)學起源于中國古代，經過數(shù)千年的發(fā)展而形成了獨特的理論體系和豐富的診療手段，是中國歷代勞動人民同疾病進行斗爭的經驗總結，其主要內容包括基礎理論、診法、中藥、方劑、針灸和病證防治等部分。然而，要使中獸醫(yī)學走向世界，僅憑傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論是不夠的，必須使之與現(xiàn)代醫(yī)學結合，從現(xiàn)代醫(yī)學的角度闡明中獸醫(yī)辨證原理及中獸藥的作用機理，實現(xiàn)傳統(tǒng)中獸醫(yī)藥學現(xiàn)代化。而分子生物學使人類對生命現(xiàn)象、生物結構和功能的認識已產生了一系列的突破，中獸醫(yī)藥理論與分子生物學雖然屬于兩種不同的體系，但兩種科學研究生命活動的物質基礎是一致的，因此，從分子水平研究中獸醫(yī)藥，對推動中西獸醫(yī)結合、促進中獸醫(yī)藥學的發(fā)展和防病治病很有意義。,1分子生物學技術在中獸醫(yī)基礎理論中的應用,1．1 陰陽學說與分子生物學技術 陰陽學說貫穿于中獸醫(yī)學理論體系的各個方面，用以說明動物體的組織結構、生理功能和病理變化，并指導臨床診斷和治療，是中獸醫(yī)理論的高度概括。 近幾年來，我國對cAMP、cGMP與中獸醫(yī)陰陽學說進行了研究。李芳生…報道，陽虛者cAMP水平升高，cAMP／cGMP比值下降；陰虛者cGMP水平升高，cAMP／cGMP比值升高。進一步分析cAMP、cGMP與陰虛和陽虛的關系可知，陽虛者表現(xiàn)副交感神經系統(tǒng)活動加強；陰虛者主要表現(xiàn)交感神經系統(tǒng)活動加強。這些研究都為推動中醫(yī)理論向現(xiàn)代化邁進有重要意義。 《素問·至真要大論》中說“謹察陰陽所在而調之，以平為期”，是中醫(yī)臨床診斷和治療的基本原則。與此理論相一致，分子生物學技術研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞染色體上存在非活化狀態(tài)的原癌基因，同時還存在抑癌基因。如前者激活，基因異常表達；或后者缺失而不能發(fā)揮正常細胞生長調節(jié)和終止分化作用，就可導致腫瘤發(fā)生，這說明原癌基因與抑癌基因兩者平衡失調對腫瘤發(fā)生起著重要作用。,1．2臟腑學說與分子生物學技術,臟腑學說是研究動物機體各臟腑器官的生理活動、病理變化及其相互關系的學說。 腎藏精，主命門之火，是機體的先天之本，對機體的生長、發(fā)育、生殖有重要影響。楊金蓉運用“恐傷腎”原理恐嚇母鼠，造成子鼠先天腎氣虧虛的動物模型，然后檢驗子鼠胸腺核酸含量，發(fā)現(xiàn)恐嚇各組DNA、RNA含量及RNA／DNA值均有所降低，且恐嚇程度越重，降低越明顯。王米渠報道受驚嚇母鼠所產子鼠大腦皮層厚度變薄，尤以分子層明顯變薄，說明圍產期緊張情緒直接影響到下一代子鼠的生長發(fā)育。用RT—PCR技術發(fā)現(xiàn)腎陽虛證和下丘腦室旁核促腎上腺皮質激素的mRNA表達受抑，將腎陽虛證定位在下丘腦。脾統(tǒng)血，主運化，是機體的后天之本。王曉明等通過脾氣虛證大白鼠模型LPO及其相關抗氧化酶變化研究，提示中醫(yī)認為“脾為后天之本”在生理上同分子生物學水平的抗氧化酶活性和(含量)的正常，從而維持了生物膜的正常功能的認識相類似，對中醫(yī)“脾”的本質的現(xiàn)代化科學解釋有一定的學術意義。這一切都說明中醫(yī)臟象學說是有分子生物學基礎的。,1．3 中獸醫(yī)證的研究與分子生物學技術,證，即證候，是對疾病發(fā)展過程中某一階段病因、病機、病性、邪正雙方力量對比等方面情況的概括，是中醫(yī)的核心問題。而辨證施治就是針對證的差異，以四診為依據，認識疾病、診斷疾病的過程。故中醫(yī)有“有諸于內必行諸于外”的說法。 中獸醫(yī)中的同病異治、異病同治在分子生物學上的體現(xiàn)就是將同一疾病不同證候和同一證候不同疾病的動物進行基因圖譜表達，觀察分析其基因突變、異常表達同疾病的關系。從中西醫(yī)結合的角度，中醫(yī)證本質的含義是指引起證發(fā)生發(fā)展的物質基礎，這些物質決定著證的動態(tài)變化過程。 證研究的突破，對于解釋中獸醫(yī)的科學內涵，推動中醫(yī)各學科的發(fā)展具有十分重要的意義。分子生物學對于蛋白質研究的突破將為證候與蛋白質的結合研究奠定基礎，在這一方面，有關蛋白質芯片的深入研究和納米技術的使用將為蛋白質的研究與中醫(yī)證候的研究提供發(fā)展的契機。而證候一基因組學也是中醫(yī)現(xiàn)階段研究的一個重要課題，將宏觀的中醫(yī)證候與微觀的基因功能相聯(lián)系。為中醫(yī)證候的現(xiàn)代化研究提供了新的探索路徑。 目前運用分子生物學技術對于臟腑辨證的研究比較多，在一定程度上揭示了這些理論的分子生物學基礎。如鐘歷勇等觀察補腎、健脾、活血三類復方對下丘腦一垂體一腎上腺一胸腺軸(HPAT)受抑模型的下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)基因表達的影響，從分子水平闡明藥物對陽虛證的主要調節(jié)點。結果表明惟有補腎藥可通過提高下丘腦CRF mRNA表達來保護HPAT軸免受外源性皮質酮的抑制。,健脾藥對免疫系統(tǒng)有直接的促進作用，而活血藥對HPAT軸無任何影響，其結論是藥物對腎陽虛證的主要調節(jié)位點在下丘腦。劉福春等通過H2一TdR摻入細胞核DNA的方法。 發(fā)現(xiàn)“陽虛”動物骨髓細胞DNA合成率下降，認為中醫(yī)腎主骨生髓藏精理論與促進核酸蛋白質代謝有關。 通過對中藥抗衰老作用機制的研究發(fā)現(xiàn)端粒長度縮短與衰老有關。端粒是線形染色體末端的特殊結構，含有DNA’高度重復序列，隨著細胞的衰老，血液及結腸黏膜細胞中端粒的平均長度在不斷減少，抗衰老中藥的作用可能表現(xiàn)在對端粒DNA重復序列有保護作用。而中藥通過提高DNA的修復能力、清除自由基、增強神經生長因子(NCF)受體等作用來達到抗衰老之目的。 標準化、規(guī)范化是涉及中醫(yī)藥科研各個領域亟待解決的難題，也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國際化的基礎。要實現(xiàn)這一目標，引入被醫(yī)學界公認為對指導臨床實踐、制定計劃、解釋結果和臨床決策具有重要價值的方法學是完全有必要的。目前對于證的研究只是從某一角度進行了分子生物學微觀闡述，但卻為辨證施治提供了一條新的思路,分子生物學技術在中醫(yī)臨床中的應用,在中獸醫(yī)辨證施治的原則下，從分子水平尋求中藥制劑療效確切的客觀依據，不僅證實了中藥的有效性，而且展現(xiàn)了中醫(yī)藥防治疾病的廣闊前景。如馬增春等用蛋白質組技術考察四物湯對血虛證小鼠血清蛋白的影響，在分子水平上探討四物湯補血的作用機制。成玉斌等探討了腎虛型糖尿病腎病(DN)與腎素血管緊張素轉移酶(ACE)基因多態(tài)性的相關性。虛證的主要病因之一可能是由于某些機體功能受到抑制等原因導致基因功能普遍下降。所以在基因芯片技術中可見大規(guī)?；蛳抡{。例如．NM一002462人類黏液病毒(流感病毒)抵抗子l一干擾素類蛋白p78(小鼠)mRNA，該基因不但與RNA聚合酶亞單元PB2作用，并且與流感NP作用而抑制流感病毒的轉錄，是嗜中性粒細胞獨立的旁分泌因子抗病毒基因。該基因表達下調：與中醫(yī)理論“正氣存內，邪不可干”有關，正常機體的防御衛(wèi)外功能下降正是虛證的病機病理之一。另外虛證會導致某些機體功能的虛性亢奮。與部分上調基因可能有關，如NM一005896IDH[，它的活性與脂肪的生物合成相關。 吳志奎等根據中醫(yī)理論，采用補腎生血對B一地中海貧血進行治療，能明顯提高地中海貧血患者血紅蛋白和抗堿血紅蛋白，提高血紅蛋白鏈比，通過BT—PCR檢測，該藥物能促進珠蛋白的mRNA基因轉錄和表達，誘導HbF合成，從而代償了β-珠蛋白基因缺陷。王振義從分子生物學水平研究早幼粒細胞白血病的發(fā)病機理，運用砒霜治療白血病，印證了中醫(yī)“以毒攻毒”的治療方法，療效十分理想。最近報道，半胱氨酸酶的激活可能是砒霜誘導NamMwa細胞凋亡的機制之一。,分子生物學技術在中藥研究中的應用,3．1 分子生物學技術與中藥作用機理的研究 我國的中藥資源豐富，具有完整的理論體系應用法則，中藥中的有效成分通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點調節(jié)機體內部的動態(tài)平衡。中藥多采用復方，講究君、臣、佐、使。以求各味藥之間能協(xié)同作用。由于成分復雜，研究起來比較困難，這就要求采用分子生物學技術分離中藥有效成分進行中藥現(xiàn)代化的研究。 1994年，Wilkins和Williams首先提出了蛋白質組?；瘜W蛋白質組學是利用化學小分子直接從功能角度切入蛋白質組的研究，通過化學小分子處理前后的差異蛋白質組展示，研究蛋白質的翻譯后修飾過程。這種研究模式為中藥對機體的作用機制提供了研究平臺。 分子生物學技術應用于中藥藥理的研究開始于中藥單體的研究，集中于人參三醇皂苷、云芝多糖等中藥單體對細胞內相關因子及受體mRNA轉錄、基因表達上有調控作用。對于中藥復方的研究尚處于起步階段。我國學者曾對人參、黃芪、青蒿、淫羊藿、銀耳、靈芝等藥物對體內重要的細胞因子(IL—l、IL一2、IL一3、IL一6、TNF等)的基因表達調控機體的免疫反應做了探討。曹穎英等[26 J應用斑點雜交法研究表明，淫羊藿苷(ICA)可促進刀豆蛋白(ConA)誘導的淋巴細胞IL一3 mRNA、IL一6 mRNA的表達，其促進作用具有一定的劑量依賴性，且它對IL一6 mRNA表達的促進作用優(yōu)于IL一3 mRNA，初步闡明了ICA促進某些細胞因子產生的分子機制。王平等研究了加味溫膽湯對日本快速老化模型鼠肝細胞核活性基因的影響，結果表明，加味溫膽湯具有提高SAM—P／10鼠肝細胞核活性基因水平、增強其轉錄活性的作用。,用細胞培養(yǎng)的方法研究發(fā)現(xiàn)，復方補益劑(四君子湯、四物湯、八珍湯、十全大補湯)對細胞生長均有顯著促進作用，而且不同補益劑對同種細胞的促生長作用明顯不同，同種補益劑對不同細胞或同種細胞的不同生長時期作用也不完全相同。賀雙騰等運用No．hem雜交檢測到，加入補腎醒腦解毒復方中藥煎液后，感染神經元NGF和BDNF表達較正常海馬神經元明顯提高并且能持續(xù)增加，維持潛伏感染神經元存活達lO周以上。凌云彪等[30 J利用核素摻人試驗、流式細胞術觀察到，通過兩種不同途徑制備的中藥復方“肝纖方”可以抑制大鼠肝星狀細胞(HSC)的增殖及其膠原合成。 隨著中醫(yī)藥防治腫瘤研究的廣泛與深入，療效高、副作用小、多靶位、多環(huán)節(jié)抗腫瘤中藥的研制，將是未來腫瘤防治的希望。日本學者對小柴胡湯的研究發(fā)現(xiàn)，柴胡湯水溶液能誘導肝癌細胞KIM一1和膽管細胞KMC—l凋亡。而不影響正常細胞。另有日本學者報道，黃芪苷元能有效抑制撲拓異構酶一2的活性和3種肝癌細胞系的增殖，并能誘導KIM一1細胞發(fā)生凋亡，誘導HuH一7、HLF細胞壞死。孫饒鴻等采用流式細胞技術發(fā)現(xiàn)消瘤飲(根據益氣解毒抗癌的原則組成的治療腫瘤中藥方劑)具有明顯的抑瘤作用，可促使b娃基因表達，誘導腫瘤細胞凋亡。,分子生物學技術與中藥鏊定,我國中藥材資源豐富，種類繁多，過去一直采用形態(tài)學分類法來鑒定中藥材。這種建立在宏觀監(jiān)測水平上的方法往往不完善，尤其是動物藥及破碎中藥的鑒定，這也是中藥質控的難點，而蛋白質電泳法和核酸分析法作為新的分子生物學技術正在中藥鑒定中廣泛應用。 任冰如等用RAPD技術(隨機擴增多態(tài)性DNA)對南、北蒼術不同居群間的親緣關系做了鑒定，從DNA水平上證實了南、北蒼術親緣關系很近，差異很小，從而證實了北蒼術是南蒼術的變種，而非不同種。羅志勇等m’運用AFLP技術(擴增片斷長度多態(tài)性法)成功構建出多態(tài)性豐富和重復性好的人參、西洋參指紋圖譜，并運用計算機軟件對結果進行二維圖象處理，計算出不同樣品間相似度指數(shù)，并從相似度指數(shù)發(fā)現(xiàn)西洋參與引種到我國吉林的西洋參的DNA發(fā)生一定的變異，但變異程度小于人參與西洋參間的差異。國外學者運用各種分子標記法對淫羊藿屬、黃芪屬、貝母屬、栝樓屬、蒼術屬、沙參屬、紫蘇屬、天南星屬等藥用植物進行了較為系統(tǒng)的研究。此外，DNA分子標記方法還可用于中成藥質量分析，如臺北醫(yī)學院利用RAPD標記技術成功檢出玉屏風散中的白術、黃芪和防風3味藥材，臺灣藥物食品檢測局利用PCR技術成功鑒別出四物湯中當歸和中降湯中大和當歸成分。,分子生物學技術與中藥品質改良,由于野生藥材資源日益減少，栽培品種品質退化，有效成分含量不足以及農藥殘留量超標等一系列問題，給中藥材質量控制和臨床應用帶來了一定困擾。胡之璧引用植物細胞培養(yǎng)技術進行洋地黃培養(yǎng)細胞的生物轉化研究，篩選出高產細胞并獲得了遺傳穩(wěn)定性。另外，還可以應用轉基因技術開發(fā)新藥。如國外報道可從轉基因綿羊羊奶50％蛋白質中提取出抗胰蛋白酶用于臨床疾病的治療。,二：分子生物學軟件在動物醫(yī)學研究中的應用,分子生物學作為基礎學科，在動物醫(yī)學研究領域（動物疾病發(fā)生機理、診斷與預防）中的應用不斷拓展，其相關應用軟件已成為廣大研究人員必不可少的輔助工具，熟練掌握一套相關生物學軟件的使用，可以為科研工作者節(jié)省大量寶貴的時間，并起到事半功倍的效果。但是其應用軟件的種類和數(shù)目層出不窮，即使某些功能的相似的軟件，其開發(fā)環(huán)境、運行平臺和操作方法都各不相同，有些軟件還涉及的一些計算機語言的使用，而我國大多 數(shù)動物醫(yī)學研究人員使用的是Windows操作系統(tǒng)作為工作平臺，而且對相關計算機語言了解不多，這就給使用者造成了許多的不便。因而很有必要推薦一些較為實用軟件給從事動物醫(yī)學研究的科研工作者  結合從事相關研究和自己的實踐經驗，就動物醫(yī)學中涉及到的軟件，按照一定的順序介紹如下。,1 參考文獻收集整理,作為相關專業(yè)的科研工作者，首先要對自己的研究內容和國內外研究現(xiàn)狀有所了解，這就需要參閱大量的文獻資料，在這里向大家推薦《書目資料庫管理系統(tǒng)v 11.0》(Reference Manager v 11.0)。Reference Manager是一個專門設計來管理書目參考文獻的資料庫程序。收集參考文獻和制作書目都可以使用Reference Manager輕易地管理資料。功能強大兼容Word 2003，可在線查找，能自動插入Word，并自動生成所定格式的參考文獻。它可以完成下列甚至更多的工作： 快速地從草稿中準備格式化的內文引用文獻和參考書目，建立并維護部門的研究資料庫，追蹤再版館藏，從不同的參考文獻來源收集參考文獻。 目前提供新資料庫可以將您收集完成的Reference Manager資料庫放在網絡環(huán)境中，可以通過網絡進入您的Web Publisher網站檢索并建立參考文獻清單或輸出參考文獻。,2 實驗設計與實施,本階段包括限制酶分析、引物設計、同源序列比較、質粒作圖、結構域(motif)查找、RNA二級結構預測、蛋白二級結構分析、克隆策略圖譜、三維結構顯示 、電泳條帶定量分析、數(shù)據統(tǒng)計分析作圖等方面的內容,2.1 引物設計、酶切分析、基序分析,在眾多相關軟件中首推Primer Premier 5.0 ，它是一種用來幫助研究人員設計最適合引物的應用軟件，利用它的高級引物搜索、引物數(shù)據庫、巢式引物設計、引物編輯和分析等功能可以設計出有高效擴增能力的理想引物。該軟件主要由以下5個主要功能板塊 組成：GeneTank 序列編輯、Primer 引物設計、Align 序列比較、Enzyme 酶切分析、Motif 基序分析。有如下功能：種間交叉引物設計、病理檢測引物設計、等位基因特效引物設計。 可簡單地通過手動拖動鼠標以擴增出相應片段所需的引物，并同時顯示各種參數(shù)的改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾結構等。也可以給定條件，讓軟件自動搜索引物，并將引物分析結果顯示出來，操作非常簡單,2.2 序列的同源比較（Alignment）、進化樹繪制,MEGA 3強調了序列獲得和演化分析的整合，該軟件允許多種格式數(shù)據輸入，用戶可以在多個窗口檢視結果，進行序列數(shù)據的操作和編輯、系列比對和系統(tǒng)發(fā)育關系樹推斷，并進行演化距離估計。結果輸出窗口允許使用者進行瀏覽、編輯、總結和輸出結果。MEGA3 .1還包括距離矩陣、系統(tǒng)發(fā)育關系展示窗口，以及一些用于直觀呈現(xiàn)輸入數(shù)據和輸出結果的高級圖形模塊，內嵌了穩(wěn)定的、可進行多序列比對的 CLUSTAL 軟件。結果可以直接粘貼到Word上，還能聯(lián)機的Web數(shù)據庫檢索，是很好用的分子進化遺傳分析軟件，在一些權威文獻中經常見到,2.3 質粒繪圖,就象限制酶切位點分析一樣，也是最常用的功能。好的質粒繪圖軟件首先能對已知序列自動作圖；如果是未知序列，但根據用戶已知的質粒信息也能繪出漂亮的圖譜來。推薦軟件：Gene Construction Kit 2.0。這是一個非常好的質粒構建軟件包。與大多數(shù)分析的軟件不同，它制作并顯示克隆策略中的分子構建過程；包括質粒構建，模擬電泳條帶；當然還可以質粒作圖（有無序列均可）。通過它繪出來的圖還可以繼續(xù)用來構建克隆策略圖譜。只是該軟件由于功能太強，使用起來也不簡單；但它附有詳細的使用幫助，認真研究后，應該沒有問題。 ,2.4 RNA二級結構,RNAdraw是一個進行RNA二級結構計算的軟件，依據Vienna RNA package V1.1最佳結構或堿基配對性的矩陣算法或熱力學曲線算法 、M.Zuker和P.stiegler的動力學算法等，進行RNA結構的預測，有較好準確度及速度。它是Windows下的多文檔窗口 (multipledocument interface) 軟件，允許你同時打開多個數(shù)據處理窗口。主窗口的工具條提供一些基本功能：打開文件、導入文件、關閉文件、設置程序參數(shù)、重排窗口，以及即時幫助和退出程序。RNAdraw中一個重要的特征是鼠標右鍵打開的菜單顯示對鼠標當前所指向的對象/窗口可以使用的功能列表。RNA文庫（RNA Library）用一種容易操作的方式來組織你所有的RNA數(shù)據文件。,2.5 蛋白質二級結構分析,ANTHEPROT 4.5是位于法國的蛋白質生物與化學研究院（Institute of Biology and Chemistry of Proteins）用十多年時間開發(fā)出的蛋白質研究軟件包。包括了蛋白質研究領域所包括的大多數(shù)內容，功能非常強大。使用個人電腦，可以進行氨基酸序列的二級結構預測，motif的尋找，酶切片段的分析，以及轉錄后的甲基化分析等各種蛋白序列分析與特性預測。更重要的是該軟件能夠提供蛋白序列的一些二級結構信息甚至可以分析信號肽斷點、跨膜區(qū)域等，使用戶有可能模擬出未知蛋白的高級結構，是為數(shù)不多的蛋白分析軟件。,2.6 凝膠分析軟件,Band leader 3.0提供處理DNA或蛋白分子凝膠電泳圖象和從凝膠電泳圖象獲得相關數(shù)據的工具。它可以對電泳圖譜進行半定量分析，用掃描儀將拍下來的照片掃進計算機生成WINDOWS圖象格式（BMP），然后就可以用本軟件操作進行分析。,2.7 三維結構顯示,數(shù)據統(tǒng)計軟件 CurveExpert ELISA標準曲線擬合、及其他各種有關的實驗數(shù)據分析，都可以應用CurveExpert進行數(shù)據分析。它使用非常方便， 可以說是實驗數(shù)據處理的圣手，并且可以生成漂亮的曲線應用到論文之中。,三：分子生物學技術在獸醫(yī)領域中的應用,核酸的分子雜交( molecular hybridization)技術是目前生物化學和分子生物學研究中應用最廣泛的技術之一, 是定性或定量檢測特異RNA 或DNA 序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的堿基互補原則而發(fā)展起來的。在堿性環(huán)境中加熱或加入變性劑等條件下, 雙鏈DNA 之間的氫鍵被破壞( 變性) , 雙鏈解開成條單鏈。這時加入異源的DNA 或RNA( 單鏈)并在一定離子強度和溫度下保溫( 復性) , 若異源DNA 或RNA 之間的某些區(qū)域有互補的堿基序列, 則在復性時可形成雜交的核酸分子。在進行分子雜交技術時, 要用一種預先分離純化的已知RNA 或DNA 序列片段去檢測未知的核酸樣品。作為檢測工具用的已知RNA或DNA 序列片段稱為雜交探針( probe) 。它常常用放射性同位素來標記。雖然核酸分子雜交技術的應用僅有二十多年的歷史, 但它在核酸的結構和功能的研究中作出了重要貢獻, 在基因的表達調控和物種的親緣關系研究中也發(fā)揮重要作用。而且, 隨著核酸探針制備及標記技術的豐富和完善以及以不同材料為支持物的固相雜交技術的發(fā)展, 使核酸分子雜交技術在分子生物學領域中的應用更加廣泛。這里我們將就分子雜交技術的幾個主要過程及其應用進行介紹。,四：分子生物學在獸醫(yī)細菌學中的應用,分子生物學在獸醫(yī)細菌學中的應用,本次課程結束，謝謝欣賞,,