[歷史學(xué)]倫敦大學(xué)帝國(guó)學(xué)院igem項(xiàng)目之 學(xué)習(xí)筆記
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1、倫敦大學(xué)帝國(guó)學(xué)院igem項(xiàng)目之 學(xué)習(xí)筆記 一:荒漠化 土壤侵蝕和荒漠化是全球范圍內(nèi)的問題。導(dǎo)致耕地的損失,經(jīng)濟(jì)困難和環(huán)境退化。我們的項(xiàng)目側(cè)重于解決這些嚴(yán)重問題的工程菌,以提高植物根系生長(zhǎng)。我們正計(jì)劃來實(shí)現(xiàn)我們的細(xì)菌帶入一個(gè)種皮,以幫助重新植被的土地侵蝕的風(fēng)險(xiǎn)。樹木和植物有助于保持土壤和防止水土流失,導(dǎo)致荒漠化。 荒漠化是下降的,其中包括干旱,半干旱和亞濕潤(rùn)干旱地區(qū)的干旱地區(qū)。干旱地區(qū)近40%的地球陸地約兩個(gè)億人,其中大部分生活在發(fā)展中國(guó)家。旱地土壤維持一個(gè)脆弱的生態(tài)系統(tǒng),適應(yīng)罕見的降水和劇烈的溫度變化。過度開發(fā)旱地種植和原料用途的土壤呈現(xiàn)無益的,強(qiáng)迫遷移的社區(qū)搜索肥沃的土地,離開貧瘠
2、的土地裸露,容易受到侵蝕力。在許多發(fā)展中國(guó)家的糧食供給缺乏強(qiáng)制的土地短期收益,以及砍伐森林,耕地不斷培養(yǎng)。 影響:土壤侵蝕影響的氣候和生物多樣性,往往會(huì)導(dǎo)致不可逆的荒漠化。羅茨提高土壤的穩(wěn)定性和防止水土流失 。此外,樹木提供掩護(hù)和保護(hù)附近的動(dòng)物和植物。在容易發(fā)生水土流失的區(qū)域,這是特別重要的,因?yàn)榻涤晖呛币姷?,但是?dāng)它發(fā)生,它往往是非常激烈的,很容易造成表土被沖走。 二:植物路線 趨化性是根據(jù)吸引或排斥的化學(xué)品的細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。根系分泌多種化合物,大腸桿菌 大腸桿菌不會(huì)被吸引到自然。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種化學(xué)感受器到我們的底盤,可以感知蘋果酸鹽,一個(gè)共同的根滲出物中,以便它可以向根游泳。此
3、外,E. 大腸桿菌都在積極采取了由植物的根,這將使成根,我們的系統(tǒng),有針對(duì)性的IAA交付。 主要由細(xì)菌運(yùn)動(dòng)對(duì)植物根系的植物路由模塊。細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的根源,微生物到自己的根。事實(shí)上,細(xì)菌,它們被用來對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的植物,在植物的根,是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn),去年只當(dāng)Paungfoo Lonhienne等 。非致病性大腸埃希氏菌的吸收到根的擬南芥(豆瓣)和番茄(番茄植物)。他們已經(jīng)成功地復(fù)制了這些調(diào)查結(jié)果。為他們的項(xiàng)目,這是特別有趣的,將暴露于作為植物內(nèi)的根細(xì)胞,這顯著影響的細(xì)菌濃度的IAA需要產(chǎn)生的,以實(shí)現(xiàn)最佳的根生長(zhǎng)的細(xì)菌的生長(zhǎng)素。此外,植物路線有可能被用來作為一個(gè)平臺(tái),提供化合物,自然不會(huì)發(fā)生在工廠,
4、沒有基因改造植物本身的根。 (1)細(xì)菌趨 他們的主要底盤,濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)是大腸埃希氏菌。趨化性E. 大腸桿菌是有據(jù)可查的。這些細(xì)菌可以執(zhí)行兩種類型的運(yùn)動(dòng),翻滾和光滑游泳。兩者之間的差異被確定由鞭毛運(yùn)動(dòng)。在翻滾運(yùn)動(dòng),鞭毛順時(shí)針移動(dòng)。這是崔泰源-P和FLIM的,一體的鞭毛相關(guān)蛋白之間的復(fù)合物的形成引起的。在平滑游泳,鞭毛逆時(shí)針移動(dòng)。崔泰源未磷酸化,并因此,不能與鞭毛蛋白,導(dǎo)致在相反的方向旋轉(zhuǎn)的鞭毛。 平滑游泳是運(yùn)動(dòng),進(jìn)行細(xì)菌對(duì)引誘或遠(yuǎn)離劑。平滑游泳是控制趨化蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使一些示范。 圖1:大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)superfolder GFP(sfGFP)的擬南芥根的植物與細(xì)菌培養(yǎng)過
5、夜后利用共聚焦顯微鏡可以看到里面。根在PBS中洗滌,成像前,以避免“假陽性”的根的外側(cè)附著的細(xì)菌。根內(nèi)的細(xì)菌對(duì)于一個(gè)很酷的3D視頻,看看我們的結(jié)果頁。(數(shù)據(jù)和影像帝國(guó)IGEM 2011)。 (2)產(chǎn)品規(guī)格 1。應(yīng)積極邁向根的細(xì)菌。 為了做到這一點(diǎn),需要的細(xì)菌是能夠感應(yīng)到一個(gè)共同的根滲出物。我們選擇了重新布線E. 大腸桿菌的趨化通路朝著L( - )的蘋果酸(也簡(jiǎn)稱為蘋果酸),檸檬酸循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的化合物。它是由分泌的根在低濃度。 2。根吸收的細(xì)菌進(jìn)入。 吸收細(xì)菌進(jìn)入根,接著所分泌的天然化學(xué)物質(zhì)提出了一個(gè)新的平臺(tái),為修改而基因改造植物基因組的植物。 3。在我們的機(jī)箱的外源基因的高效表達(dá)。
6、 由于我們是從土壤細(xì)菌的基因?qū)氲紼. 大腸桿菌我們必須考慮到影響密碼子偏性,可以發(fā)揮我們的結(jié)構(gòu)的表達(dá)。因此,我們必須確保我們的結(jié)構(gòu)并不受這種現(xiàn)象的表達(dá)。 (3)設(shè)計(jì) 目標(biāo)是確保制定的規(guī)格。 1。這種細(xì)菌應(yīng)該感覺到蘋果酸,積極邁向根。 雖然蘋果酸敏感的傳感器不自然地發(fā)生在E. 大腸桿菌,他們已經(jīng)確定了其他一些細(xì)菌的種類,包括土壤中的微生物銅綠假單胞菌 PA01株和惡臭假單胞菌 KT2440株。PA2652是一個(gè)敏感的蘋果酸的化學(xué)感受器中發(fā)現(xiàn)P. 銅綠微囊藻和MCP是一種受體,發(fā)現(xiàn)P. 惡臭響應(yīng)一些TCA循環(huán)的中間體,包括蘋果酸的[1] [2] 。銅綠假單胞菌和P.趨化的分子機(jī)制 惡臭
7、不同的大腸桿菌 大腸桿菌。然而,有高度的結(jié)構(gòu)相似性的蛋白質(zhì),使在這些生物體的趨化性途徑之間。因此,這是合理的假設(shè),PA2652或MCPS域的將互動(dòng)與本地的趨化途徑E. 大腸桿菌,細(xì)菌將能夠執(zhí)行引入受體結(jié)合的趨化反應(yīng)后,蘋果酸鹽。 2。他們的底盤中的高效表達(dá)。 他們用他們的密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化PA2652結(jié)構(gòu)(BBa_K515102)表達(dá)的E. 大腸桿菌。 3。構(gòu)建體必須是如模塊化盡可能。 表達(dá)的蘋果酸的化學(xué)感受器的基因結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜。然而,他們是模塊化的。目前的結(jié)構(gòu),表達(dá)組成型啟動(dòng)子J23100受。這是的組成啟動(dòng)的零件注冊(cè)表中最強(qiáng)的之一。我們選擇了這個(gè),因?yàn)樗歉菀椎囊粋€(gè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的表達(dá),
8、而不是調(diào)整它的啟動(dòng)子。要表達(dá)的遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)整,我們已經(jīng)推出了15個(gè)基點(diǎn)絕緣體序列,可以方便的啟動(dòng)子通過PCR使用的互換性和微調(diào)的表達(dá)水平。確保啟動(dòng)子替換時(shí)不改變的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的TIR(翻譯起始速率)。PA2652和MCP翻譯起始率,分別為42010和44050。 4。根吸收的細(xì)菌進(jìn)入。 根系的吸收都E. 大腸桿菌和面包師的酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中可以觀察到的模式生物擬南芥,并在番茄植株。這是一個(gè)自然發(fā)生的過程,(雖然它在土壤中,則仍有待觀察),我們并不需要把額外的基因,我們的設(shè)計(jì)吸收發(fā)生。 (4)模型 1)簡(jiǎn)介 趨化性上升趨化因子(如在我們的
9、項(xiàng)目中的蘋果酸)的濃度梯度和遠(yuǎn)離的驅(qū)蟲劑是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)(例如毒物)。E. 大腸桿菌是太小的,檢測(cè)到任何在其兩個(gè)端部之間的濃度梯度。這些細(xì)菌周圍的環(huán)境重新取樣,每隔3-4秒,無論是翻滾導(dǎo)致細(xì)胞或運(yùn)行。趨化因子短暫的“翻滾”(或偏見)的概率增加。這之后,由感官的適應(yīng)過程,返回到基線偏置,使細(xì)胞進(jìn)一步的濃度變化來檢測(cè)和響應(yīng)。在趨化因子濃度的變化在空間上均勻的環(huán)境中增加一小步的響應(yīng)時(shí)間從1秒到2-4秒。改變的飽和水平的趨化可以增加響應(yīng)時(shí)間到幾分鐘。 每一個(gè)化學(xué)感受器上的細(xì)菌周質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域通信的鞭毛馬達(dá)通過CHEA,崔泰源,和Chez蛋白的磷酸化繼電器順序。趨化通路建模的結(jié)果,將決定
10、的閾值用于細(xì)菌檢測(cè)的趨化因子的濃度和飽和細(xì)菌趨化檢測(cè)成為在哪一級(jí),降低細(xì)菌的趨化反應(yīng)的效率。 2)模型的趨化途徑 2.1目的 使用MATLAB模型的趨化作用的途徑和8μM化學(xué)感受器,從而確定檢測(cè)閾值和飽和度水平的趨化因子的細(xì)菌。因?yàn)樗徽J(rèn)為應(yīng)放置在靠近最佳生長(zhǎng)的種子(<0.25厘米[4] )的生長(zhǎng)素。因此,這是至關(guān)重要的,以確定是否我們的細(xì)菌能夠保持密切的種子。 2.2說明 圖1 [1] :趨化的信令組件和途徑 E. 大腸桿菌。 E.在趨化途徑 圖1表明在大腸桿菌。化學(xué)感受器,形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物與謝和咀嚼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)控制鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)方向[5] 。的信令組的貨幣是在磷酰(
11、對(duì)),它是由的崔泰源和CHEB的效應(yīng)蛋白可通過自身磷酸化CHEA [1]的形式。崔泰源p啟動(dòng)鞭毛響應(yīng)通過與電機(jī)提升運(yùn)行 [1]的概率相互作用。海布p是一個(gè)感覺適應(yīng)電路的一部分,終止運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[1] 。因此,研究海布和崔泰源的甲基化和磷酸化水平的了解一個(gè)單細(xì)胞的趨化是很重要的。斯皮羅等人的模型的基礎(chǔ)上。(1997)[1]被用來研究的濃度是如何隨時(shí)間變化的趨化通路中的蛋白質(zhì)。 此外,鏈接崔泰源p濃度與運(yùn)動(dòng)類型的(運(yùn)行與翻滾)的數(shù)量被稱為偏置。它被定義為上運(yùn)行花費(fèi)的時(shí)間相對(duì)于總的運(yùn)動(dòng)時(shí)間的幾分之一。的相對(duì)濃度的崔泰源p的轉(zhuǎn)換成馬達(dá)偏置使用希爾函數(shù)(公式1)。 2.3結(jié)果與討論 基于斯皮羅模型
12、 ,甲基化水平崔泰源和CHEB的受體和磷酸化水平(圖2)進(jìn)行了研究。此外,我們研究的運(yùn)行/干衣決策,這是基于相對(duì)受體占用的依賴。這意味著,僅依賴于任何特定的化學(xué)感受器的概率被占用趨化外部concetration的,但不是總數(shù)量的化學(xué)感受器。即使不依賴閾值和飽和度水平的化學(xué)感受上的趨化因子的濃度(圖3) 。不同數(shù)量的受體肯定會(huì)允許進(jìn)行更加細(xì)致的適應(yīng),因此選擇了最強(qiáng)的啟動(dòng)子為最佳的靈敏度。 圖2(a):崔泰源圖2的磷酸化水平,(二):磷酸化的CHEB 圖2(c):甲基化水平美洲蜚蠊下顎,圖2(d):在不同的運(yùn)行狀態(tài)的概率中的細(xì)菌在崔泰源p圖2(a)(B)(C)的水平表示的閾值檢測(cè)的濃度是10 -
13、8 M,并且飽和濃度為10 -5 M。(建模的基礎(chǔ)上螺等人[1],代碼進(jìn)行了修改,帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 圖3:與趨化因子濃度的化學(xué)感應(yīng)檢測(cè)閾值和飽和度水平。此圖清楚地表明,不依賴閾值和飽和度水平的化學(xué)感受上的趨化因子的濃度。 3)模擬的細(xì)菌人口的趨化 3.1目標(biāo) 趨化實(shí)驗(yàn)和自然條件下的細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)模擬。實(shí)驗(yàn)室條件下的模型將有助于的濕實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)在他們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。該模型的現(xiàn)實(shí)土壤條件會(huì)通知我們的項(xiàng)目如何以及在何處,我們可以把我們的細(xì)菌。 在實(shí)驗(yàn)條件下,趨化擴(kuò)散,不斷從源頭上。然而,在現(xiàn)實(shí)的土壤,根產(chǎn)生蘋果酸所有的時(shí)間。因此,我們假設(shè),分布的趨化以外的種子是穩(wěn)定的
14、,與時(shí)間無關(guān)的。因此,細(xì)菌群體趨化建模將建成的趨化因子分布與不同的模式。 3.2說明 這部分的造型專注于創(chuàng)建一個(gè)模型的細(xì)菌人口趨化運(yùn)動(dòng)。在趨化,化學(xué)感受器感受到的趨化因子的濃度增加,然后發(fā)送一個(gè)信號(hào),即抑制翻滾。同時(shí),變得越來越甲基受體。相反,在趨化因子的濃度減少翻滾頻率增加,并導(dǎo)致受體的去甲基化。翻滾頻率大約為1赫茲時(shí),鞭毛運(yùn)動(dòng)是公正的,并降低到幾乎為零的細(xì)菌向上移動(dòng)的趨化梯度[5] 。為了準(zhǔn)確地建立模型,作如下假設(shè)的基礎(chǔ)上文獻(xiàn): 1)定向運(yùn)動(dòng)相位期間,平均血流速度在哪些E. 大腸桿菌移動(dòng)為24.1微米/秒[7] 。鑒于在翻滾階段,是不顯著的速度慢,可以忽略不計(jì)。 2) E. 大
15、腸桿菌通常需要作為其基礎(chǔ)上決定是否集中度有所提高或過去的第二。因此,在我們的模型中的細(xì)菌將能夠比較濃度的趨化因子在t秒,在t-1秒。 3)在我們的模型中,我們忽略了,E. 大腸桿菌不行駛在一條直線上在運(yùn)行過程中,而是采取曲線路徑由于不平等的射擊鞭毛。 4)我們的模型沒有考慮細(xì)菌的生長(zhǎng),或由于法定人數(shù)感應(yīng)到一個(gè)小面積的細(xì)菌聚集的傾向。 在此模型中,細(xì)菌應(yīng)該是能夠比較在當(dāng)前時(shí)間點(diǎn)的過去的第二處的濃度的趨化因子的濃度。如果濃度的降低(即 T1 -C T2 ≤0),細(xì)菌就會(huì)跌倒的頻率為1 Hz。如果增加的濃度(C t1的 -C t2的 > 0),翻滾頻率減小,因此翻滾的概率減小。參考中的式(1
16、0)[6],我們知道,當(dāng)C t1的 -C t2的 > 0,翻滾隨著chemostatic常數(shù),細(xì)菌速度,濃度差之間相鄰的時(shí)間點(diǎn)和角度之間的指數(shù)函數(shù)的概率的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。[8]因此,我們可以凝聚上面的描述,下面的語句: 3.3結(jié)果與討論 3.3.1 Baterial趨化實(shí)驗(yàn)室 在實(shí)驗(yàn)室條件下,趨化因子從源頭上不斷擴(kuò)散,因此,趨化因子隨時(shí)間變化的分布格局。的誤差函數(shù)(方程2)在這種情況下,被用來描述的非穩(wěn)定狀態(tài)下的趨化分布。 對(duì)于趨化的濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn),用戶界面設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證其可行性。最初,一個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是作為放置一定數(shù)量的細(xì)菌的6厘米距離與不同濃度的趨化源。放置100個(gè)細(xì)菌
17、的趨化性的模擬的6厘米遠(yuǎn)離5 mM的蘋果酸源示出在下面的電影。而這MATLAB程序具有一個(gè)圖形用戶界面(GUI)(圖4),它可用于由濕實(shí)驗(yàn)室學(xué)生簡(jiǎn)單的輸入?yún)?shù)和生成靜態(tài)的圖形或動(dòng)畫。 圖4: MATLAB的圖形用戶界面,(帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 上面的視頻顯示,趨化需要14000秒擴(kuò)散到菌落。在這段時(shí)間內(nèi)的細(xì)菌會(huì)被復(fù)制到所有的板。因此,從建模,可以推斷,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能無法清楚地表明趨化性(看到的結(jié)果,在我們的濕實(shí)驗(yàn)室)。因此,設(shè)計(jì)了新的實(shí)驗(yàn)設(shè)置,作為趨化因子被保持在毛細(xì)管和以及與細(xì)菌懸浮液放入;誘食擴(kuò)散入井設(shè)置濃度梯度。細(xì)菌游泳的濃度梯度,給定的時(shí)間后進(jìn)入毛細(xì)管,毛
18、細(xì)管被除去,并在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。表明在圖5示出在整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。這種新的模式整合,完善我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這進(jìn)一步細(xì)化又是通知的設(shè)計(jì),我們的分析,這將導(dǎo)致更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù),從而創(chuàng)造出精致的植物檢疫路由模塊之間的循環(huán)的建模和濕實(shí)驗(yàn)室。 圖5:演示實(shí)驗(yàn)裝置的毛細(xì)管分析。(圖由倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)。) 毛細(xì)管和趨化因子的分布狀況是不同的。因此,兩種趨化因子分布狀況進(jìn)行了推導(dǎo),推導(dǎo)的詳細(xì)信息,請(qǐng)?jiān)谶@里下載。示出的單核細(xì)胞趨化在阱的分布,在毛細(xì)管內(nèi)的分布方程中所示的等式3和等式4。 同樣地,一個(gè)用戶接口的設(shè)計(jì),使?jié)駥?shí)驗(yàn)室學(xué)生不同的輸入?yún)?shù)(圖6)。以下的視頻顯示
19、的模擬與1000個(gè)細(xì)菌,用直徑為1mm的填充用1mM的趨化chemotaxing朝向毛細(xì)管。圖。圖7示出了在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)量。該模型表明,在毛細(xì)管中積累的細(xì)菌,是在3600秒的最大數(shù)目。因此,我們的模型表明,的濕實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生應(yīng)執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)為60分鐘,然后收集數(shù)據(jù)。 圖6: Matlab的圖形用戶界面,為我們的趨化毛細(xì)管分析。(帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 圖7:細(xì)菌的數(shù)量在毛細(xì)管與時(shí)間(帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 3.3.2在土壤中的細(xì)菌趨 在現(xiàn)實(shí)的土壤,蘋果酸鹽用作趨化。馬拉特是不斷從根尖分泌3 mM的[9]的濃度。在這種情況下,蘋果酸源
20、總是補(bǔ)充由于持續(xù)分泌從根和分配方式可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的(即與時(shí)間無關(guān))。的穩(wěn)定狀態(tài)Keler的謝格爾模型是用來證明這個(gè)分布(公式5)。 真正的蘋果酸在土壤中的分布顯示在圖5。細(xì)菌趨藥性的路徑,當(dāng)將細(xì)菌在穩(wěn)態(tài)蘋果酸分布在不同的位置上時(shí),表明在圖5。 圖8(a):的蘋果酸鹽的距離(1D),圖8(b):蘋果酸鹽用半徑(2D)中的分布的分布,圖8(b)示出的位置的閾值檢測(cè)的濃度(1e的-8 M的半徑= 0.028 m)和飽和濃度(是1e-5 M的半徑= 0.012)。 圖9:與細(xì)菌的趨化性放置在不同的起始位置。 藍(lán):210 5秒趨化開始于半徑= 0.015米(之間0.012 m和0.028
21、米的),綠色:210 5秒趨化開始于半徑=0.008米,這是小于0.012。這表明的細(xì)菌的趨化反應(yīng)是低效的,當(dāng)它們被放置在從根尖端0.0028米0.0012米。綠線表示,這種細(xì)菌可保持接近的種子,當(dāng)它被放置在遠(yuǎn)離根尖的距離小于0.012米。因此,該模型表明,這種細(xì)菌被放置在一個(gè)距離小于0.012米,在我們的項(xiàng)目實(shí)施。 最后,用于細(xì)菌檢測(cè)的閾值的趨化因子的濃度是110 -8 M和細(xì)菌趨化檢測(cè)變得飽和水平是110 -5 M。我們還表明,檢測(cè)閾值和飽和度水平是趨化因子受體的數(shù)量無關(guān),然而,為了使最大靈敏度,最強(qiáng)的啟動(dòng)子應(yīng)該選擇植物路由模塊。此外,與蘋果酸濃度等于3 mM的,閾值檢測(cè)的濃度是在從根0
22、.028米的距離,和飽和濃度達(dá)到0.012米(1.2厘米)遠(yuǎn)離根。從建模的細(xì)菌種群的趨化性,我們觀察到根的趨化性是緩慢的,如果該細(xì)菌最初放置在兩者之間0.012 m和0.028米的,同時(shí),放置從根0.012米內(nèi)細(xì)菌時(shí),細(xì)菌很可能穩(wěn)定和保持密切的根。穩(wěn)定的細(xì)菌本地化,(1.2厘米)的距離是大于0.25厘米(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以有效地根的距離),因此,建議的細(xì)菌,我們的種皮的實(shí)施,應(yīng)放置在或接近0.25厘米遠(yuǎn)離根。 二:生長(zhǎng)素 (1) 概觀 生長(zhǎng)素,或吲哚-3 -乙酸(IAA),是一種植物生長(zhǎng)的激素,它是通過幾個(gè)土壤細(xì)菌。我們已經(jīng)采取的基因編碼,從假單胞菌savastanoi IAA生產(chǎn)的途徑,并表
23、示他們?cè)诖竽c埃希氏菌。植物路由模塊對(duì)根和吸收趨化之后,IAA表達(dá),目的是提高土壤的穩(wěn)定性,促進(jìn)根系生長(zhǎng)其也被稱為是一個(gè)充分研究的負(fù)責(zé)響應(yīng)于生物和非生物脅迫的用于植物生長(zhǎng)的植物激素。通常,類似的α-萘乙酸(αNAA)和2,4 - 二氯苯氧乙酸(2,4-D)的合成生長(zhǎng)素作為除草劑的使用。在過去的50年來,由于他們的高效率和廉價(jià)的成本,他們已經(jīng)在作為除草劑的用途。 雖然生長(zhǎng)素是一種促生長(zhǎng)的激素,它可以在高濃度下對(duì)植物的代謝負(fù)擔(dān),因此,毒性。合成生長(zhǎng)素是非常穩(wěn)定,在土壤中能堅(jiān)持幾個(gè)星期,這就是為什么他們是非常有效的除草劑。IAA,在另一方面,是化學(xué)不穩(wěn)定的,并可以很容易地由植物代謝。因此,如果我們?cè)?/p>
24、我們的底盤生產(chǎn)IAA,它應(yīng)該促進(jìn)而不是阻礙植物根系的生長(zhǎng)。仍然是一種風(fēng)險(xiǎn),即IAA可以仿照在硅片告知生長(zhǎng)素隨心模塊的設(shè)計(jì),其合成前在高濃度,因此,基因表達(dá)水平的植物是有毒的。我們的目標(biāo)是產(chǎn)生IAA E. 大腸桿菌中以受控的方式,以便它永遠(yuǎn)不會(huì)到達(dá)的毒性閾值。在整個(gè)項(xiàng)目,該模塊將負(fù)責(zé)影響根系生長(zhǎng),形成復(fù)雜的根網(wǎng)絡(luò),可以有效地保持土壤,防止其侵蝕的目的。 圖1。的化學(xué)結(jié)構(gòu),合成的和天然的生長(zhǎng)素。(圖片由先正達(dá)提供)。 (2)產(chǎn)品規(guī)格 1。一個(gè)簡(jiǎn)單的的IAA生產(chǎn)的途徑,可以表現(xiàn)在我們的底盤。 IAA是一種植物激素,促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌快遞(PGP) IAA的植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。有幾種不同
25、的途徑可以制作IAA(圖1)。我們決定使用的IAM的途徑,因?yàn)樗驯蛔C明在E.工作 大腸桿菌,并且由的只有兩種酶。 2。片段序列設(shè)計(jì)適合聚合酶延伸組件的方法,以最低的成本。 我們決定用聚合酶延伸,而不是標(biāo)準(zhǔn)限制連接的組件的裝配,因?yàn)樗鼘⑹刮覀兡軌蛴嗁彾鄠€(gè)片段的序列。這將保持低于1000 bp的訂單,也降低了生產(chǎn)時(shí)間。此外,像吉布森和CPEC的方法,使我們能夠建立包含多個(gè)組件的結(jié)構(gòu),在一個(gè)反應(yīng)??,而不是不必結(jié)扎每個(gè)BioBrick順序的。 3。實(shí)現(xiàn)足夠的IAA的表達(dá)水平在我們的底盤,在我們的工廠模式,以提高根系的生長(zhǎng)。 IAA在我們的底盤表達(dá)的目的是提高植物根系的生長(zhǎng),并最終提高土壤的
26、穩(wěn)定性。因此,我們需要的IAA濃度的影響根系生長(zhǎng)模擬和測(cè)試,以確定最佳的濃度不引起毒性。 4。調(diào)整的IAA生產(chǎn)水平啟動(dòng)子不影響RBS強(qiáng)度的情況下切換。 要促進(jìn)未來調(diào)整的表達(dá),我們?cè)谠O(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)時(shí),蘇格蘭皇家銀行是不會(huì)受到影響的發(fā)起人。為了做到這一點(diǎn),我們?cè)黾恿?5個(gè)基點(diǎn)絕緣體它們之間的序列。 5。建立一個(gè)結(jié)構(gòu),密碼子優(yōu)化為E. 大腸桿菌和B??莶菅挎邨U菌。 我們使用的是E. 大腸桿菌作為我們的機(jī)箱,因?yàn)槿祟悓?shí)踐問題,周圍環(huán)境中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的蔓延。此外,它已被證明,大腸桿菌 大腸桿菌是采取了積極的擬南芥 [2] 。然而,在未來,我們希望有可能建立相同的
27、構(gòu)造B. 枯草芽孢桿菌,一個(gè)突出的土壤中的孢子形成的細(xì)菌。 圖1。有幾種不同的IAA的生產(chǎn)途徑。該IAM通路是一個(gè)兩步驟的途徑,從前驅(qū)體色氨酸生成吲哚-3 -乙酸(IAA)。IAA色氨酸單加氧酶(IAAM),催化氧化羧化的L-色氨酸為吲哚-3 -乙酰胺水解為吲哚-3 -乙酸和氨的吲哚乙酰胺水解酶(IAAH)[1] 。 (3)設(shè)計(jì) 他們心中的規(guī)格,我們通過文獻(xiàn)搜索和咨詢專家告知我們的IAA表達(dá)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)。 1。該IAM通路是一個(gè)簡(jiǎn)單的IAA的制造途徑與只有一個(gè)中間。 他們選擇,使用IAM(吲哚乙酰胺)的途徑,來源于假單胞菌savastanoi。此途徑只涉及兩種酶產(chǎn)生IAA(iaaM和戰(zhàn)
28、勝饑餓國(guó)際聯(lián)盟),因此最大限度地減少碎片的數(shù)量,我們需要在我們的結(jié)構(gòu)組裝。 2。設(shè)計(jì)適合于基于聚合酶延伸組裝的基因序列。 由于他們有兩個(gè)比較大的酶(約61 kDa和47 kDa的),他們決定每一個(gè)分裂成兩個(gè)片段,以加快其合成。他們?cè)O(shè)計(jì)了50 bp的重疊區(qū)域的端部的每一個(gè)的四個(gè)片段,以便能夠快速基于聚合酶延伸的組裝成標(biāo)準(zhǔn)pSB1C3矢量。 3。實(shí)現(xiàn)足夠的IAA的表達(dá)水平在我們的底盤,以提高我們的模式植物的根系生長(zhǎng)。 我們將iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國(guó)際聯(lián)盟基因的控制下的Pveg2啟動(dòng)。我們選擇該啟動(dòng)子,因?yàn)樗枪δ蹺. 大腸桿菌和B??莶菅挎邨U菌。 4。是絕緣體序列設(shè)計(jì),使啟動(dòng)開關(guān)。 為了使
29、調(diào)整的IAA生產(chǎn),使用不同強(qiáng)度的推動(dòng)者,我們正在設(shè)計(jì)一個(gè)絕緣體序列前面iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國(guó)際聯(lián)盟,不影響RBS實(shí)力的情況下啟動(dòng)開關(guān),以方便使用PCR的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。 5。聯(lián)合密碼子優(yōu)化E. 大腸桿菌和B??莶菅挎邨U菌 他們做了一個(gè)密碼子優(yōu)化軟件,優(yōu)化兩款機(jī)箱都提供靈活性,在未來的iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國(guó)際聯(lián)盟序列,盡管我們目前使用的E. 大腸桿菌作為我們的底盤。 (4)模型 1)簡(jiǎn)介 足夠的生產(chǎn)能有效地促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的植物激素或轉(zhuǎn)基因(GM)大腸埃希氏菌吲哚-3 -乙酸(IAA) 。但是,IAA是對(duì)植物有毒的,如果它的濃度過高。因此,重要的是IAA表達(dá)水平能夠預(yù)測(cè)一個(gè)給定的子,然后調(diào)
30、整子強(qiáng)度,以保證我們的大腸桿菌最佳的IAA 增加根系生長(zhǎng)。 IAA增加根系生長(zhǎng),根長(zhǎng)和分支數(shù)量方面。為了研究不同濃度的IAA影響根系的生長(zhǎng)模式,建模工具,用濕實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果,結(jié)合預(yù)測(cè)和可視化擬南芥根系生長(zhǎng)。 2)IAA合成模擬 2.1目的 一個(gè)單一的E.確定IAA表達(dá)水平 大腸桿菌細(xì)胞與IAA啟動(dòng)子強(qiáng)度4.536 RNA /分鐘/μg的底物DNA,然后預(yù)測(cè)要放置在種子涂層,誘導(dǎo)最佳的根生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)量。 2.2說明 遺傳工程的IAA途徑涉及兩個(gè)基因,iaaM和IAAH,這兩者都是組成型表達(dá)。IAAM基因編碼色氨酸2 -單加氧酶(T-2-monase),色氨酸(Trp)的吲哚-3
31、 -乙酰胺的催化轉(zhuǎn)換(IAM),然后將其水解以釋放吲哚-3 -乙酸(IAA)由水解酶IAAH [3] 。在同一時(shí)間,合成的IAM和IAA將競(jìng)爭(zhēng)性地抑制色氨酸2 -單加氧酶的酶活性,從 ??而誘導(dǎo)的IAA的表達(dá)上的負(fù)反饋環(huán)路。圖1中示出在該途徑所涉及的酶促反應(yīng)。 圖1:IAA合成途徑。(圖由倫敦帝國(guó)學(xué)院的iGEM比賽的隊(duì))。 此外,從美國(guó)科羅拉多大學(xué)的研究進(jìn)行了數(shù)學(xué)生物學(xué)研究組的基礎(chǔ)上[4] ,色氨酸也是負(fù)面的控制內(nèi)的細(xì)菌。因此,色氨酸合成途徑應(yīng)納入上述模型。此外,為了減少的數(shù)目的參數(shù),如在圖1中的參數(shù)大多數(shù)是不提供給我們,在IAA通路然后分為兩個(gè)米氏米氏方程,與色氨酸的途徑和組成型
32、基因表達(dá)的T相結(jié)合的簡(jiǎn)化-2-monase和IAAH。整個(gè)色氨酸IAA通路模型[5]中描述的公式1 ,和參數(shù)定義在下面的參數(shù)部分。 在這個(gè)模型中,我們提出以下假設(shè): (1)他們忽視了很短的時(shí)間延遲,由于TRP-T-2-monase(底物酶(ES)復(fù)雜的),IAM-戰(zhàn)勝饑餓國(guó)際聯(lián)盟(ES的復(fù)雜),IAM-T-2-monase(抑制酶的合成( EI)配合物)和IAA-T-2-monase(抑制劑的酶(EI)絡(luò)合物),并假定這些物種幾乎在瞬間達(dá)到其平衡。 (2)IAA的降解率在黑暗中細(xì)菌的生長(zhǎng)速度相比是非常低的。因此,我們使用了細(xì)菌的生長(zhǎng)速率,在這個(gè)模型中的IAA降解率。 在建模的IAA通路
33、(3),我們發(fā)現(xiàn),IAA合成的速率確定的物種是(I??AM),而不是酶IAAH,因?yàn)樯a(chǎn)的IAM被抑制本身和IAA。 2.3結(jié)果與討論 1。每個(gè)蛋白物種的濃度是如何隨時(shí)間變化。 2。各物種的酶促反應(yīng),與O F = 1.5410 -4 μM,M F = 3.7810 -4 μM,E = 0.378μM,色氨酸= 4.1μM和所有其他= 0的初始濃度的模擬[4]。 此外,圖2示出,IAA的表達(dá)水平為72.35μM,這意味著每個(gè)細(xì)菌生產(chǎn)的7.2410 -14微摩爾每細(xì)菌在穩(wěn)定狀態(tài)下與細(xì)菌的體積等于10 -15分米3。從潮濕的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中,我們知道,IAA以促進(jìn)根系生長(zhǎng)的最佳濃度為0.1 nm
34、,和擬南芥種子的體積約等于3.610 -9米3 [7] 。因此,需要存在于種皮,以最大限度地提高根根系生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)為4.9710 6。 詳細(xì)的計(jì)算中列出如下: 1。一個(gè)單一的細(xì)菌所產(chǎn)生的摩爾數(shù)是72.35微米* 10 -18米3(7.235 * 10 -17微摩爾)。 2。的IAA的摩爾數(shù),需要在一個(gè)種皮是3.6 * 10 -9米3 * 0.1 nmol。 3。細(xì)菌的數(shù)量需要是發(fā)生在一個(gè)種皮(3.6 * 10 -10微摩爾)/(7.23510 -17)= 4.9710 6。 圖2(a):(的IAM)隨時(shí)間的演變。圖2(b):的IAA對(duì)時(shí)間的演變。 總之,我們獲得的IAA濃度的,I
35、AA DNA結(jié)構(gòu)(72.25μM)產(chǎn)生的。從這個(gè)值,我們計(jì)算出的細(xì)菌數(shù)量,將需要輸入理想的生長(zhǎng)條件,而忽略死亡和分裂的細(xì)菌,這被認(rèn)為是4.97x10 6 細(xì)菌擬南芥的根目錄下。此值由于在不同的植物種子大小的變化而變化。由于細(xì)菌細(xì)胞可從該植物中丟失,不是所有的細(xì)菌從種皮進(jìn)入工廠,在種皮所需的細(xì)菌的數(shù)目將是高于此。此外,在接下來的部分根系生長(zhǎng)模型幫助我們想象的根系生長(zhǎng)。 3)IAA的吸收和根系的生長(zhǎng) 3.1目標(biāo) 1創(chuàng)建一個(gè)圖形程序來演示的擬南芥根系的生長(zhǎng)過程,Lindenmayer系統(tǒng)和植物生理學(xué)的原則的基礎(chǔ)上。 2使用Matlab數(shù)據(jù)擬合工具來開發(fā)IAA濃度和增長(zhǎng)速度的分行數(shù)目之間的關(guān)系
36、。 3.2說明 我們使用計(jì)算的工具,visulise根系生長(zhǎng)的現(xiàn)象,(主要根長(zhǎng),分枝,根系密度等)在不同的enviromental條件下,特別是根序和根長(zhǎng)。根為了描述一個(gè)根系統(tǒng)的分支“代”,被定義為一個(gè)零階根的根不分枝。根系生長(zhǎng)取決于環(huán)境因素的影響,比如引力和土壤的非均質(zhì)性。 3.2.1向性 一個(gè)根系統(tǒng)啟動(dòng)的零階根單根的尖端。然后根遠(yuǎn)離植物的莖生長(zhǎng)在一個(gè)錐形的方式[10] 。 根系生長(zhǎng)取決于環(huán)境因素的影響,比如引力和土壤的非均質(zhì)性。因此,兩個(gè)更多的變量被定義為描述植物適應(yīng) - 多么強(qiáng)大的根每平方厘米的增長(zhǎng)方向的變化 - 一個(gè)更大的值表示更偏轉(zhuǎn)的根和更扭曲的根系統(tǒng) - 試驗(yàn)的次數(shù)
37、,其根部,以找到最佳的角度α和β的旋轉(zhuǎn) 的向下運(yùn)動(dòng) - N可以是任意實(shí)數(shù)。如果N = 1.5,如果,N可以是1或2的裝置。 圖3:不同的N值和σ的根系統(tǒng)之間的差異。(建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改,由倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 3.2.2 Lindenmayer系統(tǒng)和根系的生長(zhǎng)模型 L-系統(tǒng)是一個(gè)平行的重寫系統(tǒng),即一個(gè)正式的語法的一個(gè)變體,最有名的用于模擬植物發(fā)育過程中的生長(zhǎng),但也能夠模擬各種生物體的形態(tài),由于兩個(gè)主要性能:遞歸和自相似性[11] 。植物模型和自然的有機(jī)形態(tài)很容易定義,如通過增加遞歸級(jí)別的形式慢慢“長(zhǎng)大”,并變得更加復(fù)雜。 使
38、用L-系統(tǒng),用于產(chǎn)生圖形圖像的要求,在模型中的符號(hào)是指在計(jì)算機(jī)屏幕上的圖的元素。解釋每不變的L-系統(tǒng)模型的龜命令。 3.2.3根系生長(zhǎng); 造型的IAA攝取的預(yù)測(cè)答案的問題,如: “什么是初生根的生長(zhǎng)率是多少?” “什么是根系統(tǒng)一段時(shí)間后的樣子嗎?” “如何擬南芥不同IAA濃度?“ 我們修改一個(gè)MATLAB程序開發(fā)丹尼爾萊特納的研究小組[6]展示的3D根系統(tǒng)的基礎(chǔ)上的原則林登梅耶系統(tǒng)(龜?shù)拿睿?,并在根增長(zhǎng)模型工具箱由丹尼爾萊特納等人從BOKU(Universitt獻(xiàn)給Bodenkultur維也納開發(fā)維也納的自然資源和生命科學(xué)大學(xué))[12] 。 3.2.4數(shù)據(jù)擬合 我們采取
39、了從文獻(xiàn)的增長(zhǎng)速度參數(shù),我們的濕實(shí)驗(yàn)室的原始數(shù)據(jù),為我們的項(xiàng)目提供更準(zhǔn)確,更合適的參數(shù)進(jìn)行了分析。擬南芥植物種植和根的長(zhǎng)度和數(shù)量的分支記錄每?jī)商鞆牡?天到第9天。根長(zhǎng),每天根系生長(zhǎng)速率和分支數(shù)量繪制了時(shí)間和IAA濃度。 3.3結(jié)果與討論 3.3.1根系統(tǒng)的可視化 從文獻(xiàn)中的值給外部IAA濃度之間的關(guān)系,和根的伸長(zhǎng)為510 -5 mol / L的→200μm的伸長(zhǎng)率在30分鐘內(nèi)。因此,生長(zhǎng)速度的建模參數(shù)是9.6 * 10 -3 m /天。 我們觀察到真正的根的生長(zhǎng)模式和修改我們的模擬,以提供更可靠,更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)根的生長(zhǎng)。擬南芥中有一個(gè)主根與零階和它厚比分行。擬南芥一般長(zhǎng)到20-30厘米
40、的深度內(nèi)的土壤和分支只有一次。如下所示的3D畫面預(yù)測(cè)的根的生長(zhǎng)具有不同伸長(zhǎng)率(與IAA = 0.96厘米/天;未經(jīng)IAA = 0.46厘米/天[10] )。它們可與一個(gè)真正的根系統(tǒng)的照片。 圖4:擬南芥根系統(tǒng)的3D visalisation。的曲線圖圖4(a)(b)表示不同IAA濃度作為我們的模擬結(jié)果中的生長(zhǎng)時(shí)間為20天的條件下與的擬南芥根系統(tǒng)中示范。圖4(c)(d)是真正的擬南芥植物的文獻(xiàn)和我們的濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際照片。(建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改,由倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 (4)裝配 圖。1:大會(huì)戰(zhàn)略為我們的生長(zhǎng)素隨心結(jié)構(gòu)。(圖由倫敦帝國(guó)
41、學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 我們下令iaaM和IAAH作為兩個(gè)片段的編碼序列,以減少成本和時(shí)間(片段1,2,3和4)。我們不希望使用PCR擴(kuò)增的片段,以避免引入到我們的最終構(gòu)建的突變,因此我們將我們的MlyI限制性內(nèi)切酶的合成序列兩側(cè)的鈍的一端切點(diǎn)。說穿了,Mly1(II型限制性內(nèi)切酶)削減5個(gè)堿基的識(shí)別位點(diǎn)距離。此屬性允許我們只切出各片段的編碼序列。每一個(gè)消化的片段,然后凝膠提取準(zhǔn)備組裝。 pSB1C3載體的骨架載體的同時(shí)反PCRd放大所需的重疊。 我們計(jì)劃相結(jié)合的四個(gè)片段到pSB1C3載體由吉布森裝配,不幸的是,我們的嘗試都失敗了,我們推測(cè),這是由于骨架載體上的同源性,
42、使其重新退火。 我們恢復(fù)到CPEC組裝結(jié)構(gòu),一種方法,需要更廣泛地使用PCR比吉布森。這就是說,通過引入MlyI的酶切位點(diǎn),我們的人數(shù)減少一半所需要的PCR步驟,從而減少了潛在的突變率。 循環(huán)聚合酶延伸克?。–PEC)是一個(gè)獨(dú)立的引物PCR裝配技術(shù),它依賴于各部分之間的重疊序列進(jìn)行組裝。有了一個(gè)變性步驟中,雙鏈DNA的熔融,允許兼容的單鏈的兩端各部分加入。出于這個(gè)原因,它是必不可少的,該部件被設(shè)計(jì)為同源的端部(被設(shè)計(jì)我們所使用的片段用50 bp的重疊)。退火后的重疊端,然后作為引物,聚合酶延伸的部分加入到一個(gè)無縫的構(gòu)造。 CPEC的第一次嘗試是成功的。DNA由E. 大腸桿菌 DH5α中菌
43、落的組裝構(gòu)造轉(zhuǎn)化miniprepped并發(fā)送到歐陸用于測(cè)序。序列進(jìn)行了驗(yàn)證,所以我們進(jìn)行特征IAA生產(chǎn)建設(shè)。 圖。2:組裝結(jié)構(gòu)限制切割骨干前綴和后綴分別用EcoRI和PstI消化,使我們能夠確定如果插入是正確的大小。1巷包含1 KB +梯作為參考。泳道2,泳道3 PstI和第4泳道都用EcoRI消化。將得到的帶的大小是約4 kb的與組裝的四個(gè)片段的大小。(數(shù)據(jù)由倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 圖。3:甲最終生長(zhǎng)素隨心構(gòu)造示意圖。點(diǎn)擊每個(gè)部分被定向到零件注冊(cè)表的相關(guān)頁面。(圖由倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 三:基因衛(wèi)士 遏制是一個(gè)嚴(yán)重的問題,關(guān)于釋放
44、到環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因生物(轉(zhuǎn)基因生物)。為了防止基因水平轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)我們的底盤,我們已經(jīng)開發(fā)出一種系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,編碼holin,反holin和溶素的基因。我們是工程的抗holin到我們的底盤,在那里它的作用作為抗毒素,和holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒DNA上的基因組中。在與土壤細(xì)菌的水平基因轉(zhuǎn)移事件,holin和細(xì)胞內(nèi)溶素將不含抗holin轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞非可行的和有效含有生長(zhǎng)素Xpress和植物路線基因在我們的機(jī)箱的。 (1)概觀 對(duì)于人類實(shí)踐告訴我們項(xiàng)目的設(shè)計(jì),我們決定拿出新的解決方案,以轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。我們?cè)噲D想超越遏制“殺死開關(guān)”機(jī)制,并提出了這樣的問題:“什么最壞
45、的情況下,如果我們要釋放我們到野外的轉(zhuǎn)基因?“ 和“如何避免這些問題呢?”。 轉(zhuǎn)基因生物釋放的最棘手的后果之一是水平基因轉(zhuǎn)移的非天然質(zhì)粒DNA,以現(xiàn)有的土壤細(xì)菌,經(jīng)常發(fā)生的過程。 基因Guard是一種新的機(jī)制,以防止轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的交流,以防止自然發(fā)生的微生物基因的水平轉(zhuǎn)移,因此一個(gè)可行的解決方案。它將使用一個(gè)毒素/抗毒素系統(tǒng),其中反holin被整合到基因組中,我們的機(jī)箱中,將防止holin上的質(zhì)粒編碼的內(nèi)溶素,以裂解細(xì)胞。然而,如果該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到任何其他細(xì)菌的物種,是不是我們改造細(xì)菌,它會(huì)引起細(xì)胞裂解,從而防止包含在我們的GMO的遺傳信息的傳播。 該模塊的組裝和測(cè)試的同時(shí),我們嘗
46、試與土壤中的細(xì)菌,看到多久,他們保留了GFP表達(dá)E.獲得的熒光 通過水平基因轉(zhuǎn)移的大腸桿菌。 對(duì)于我們?nèi)祟悓?shí)踐的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因釋放的更多信息 (2)產(chǎn)品規(guī)格 1。防止任何其他細(xì)胞,是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移 水平基因轉(zhuǎn)移(圖1)是主要的問題,我們能想到的,當(dāng)它來釋放轉(zhuǎn)基因生物在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試,后來在項(xiàng)目的實(shí)施階段。這是一個(gè)共同的問題,即使在轉(zhuǎn)基因作物,轉(zhuǎn)基因生物和自然生物之間的異花授粉是恒定的憂慮。在細(xì)菌中,基因通常轉(zhuǎn)移到其他物種通過共軛或通過從溶解的轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的攝取。由于遺傳物質(zhì)仍然可以采取其他物種的裂解后我們的轉(zhuǎn)基因生物,其中一個(gè)使用一個(gè)輸入誘導(dǎo)裂解是一個(gè)傳統(tǒng)的殺
47、開關(guān)不是一個(gè)可行的和安全的選項(xiàng)。因此,我們認(rèn)為,設(shè)備必須是內(nèi)的遺傳物質(zhì)本身,而不是自然產(chǎn)生的細(xì)菌引起的反應(yīng)。 展望殺死在過去已經(jīng)使用的開關(guān),我們發(fā)現(xiàn)的T4 holin-溶素系統(tǒng)。如果我們要添加這些基因的質(zhì)粒,我們可能引起的任何有機(jī)體,我們已經(jīng)采取了質(zhì)粒的直接裂解。 圖1。水平基因轉(zhuǎn)移(格雷斯金,2006年[1] ) 2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因 T4噬菌體必須能夠延緩其主機(jī)之前,它是可以復(fù)制和裝配的許多副本本身的裂解。為了做到這一點(diǎn)也有T4噬菌體的蛋白質(zhì)稱為抗holin結(jié)合從而防止細(xì)胞裂解的holin。本質(zhì)上,該系統(tǒng)的工作原理作為定時(shí)器給噬菌體足夠的時(shí)間來復(fù)制。
48、 通過使用反holin的從這個(gè)系統(tǒng)中,我們可以防止我們自己的細(xì)胞裂解。然而,我們不能有它的質(zhì)粒否則仍可能有兩個(gè)質(zhì)粒的有機(jī)體的可能性。因此,我們必須錨定的基因組內(nèi)。為了做到這一點(diǎn),我們需要用CRIM質(zhì)粒。CRIM(復(fù)制的條件,整合和模塊化)質(zhì)??梢约稍趩我坏母北镜交蚪M的E. 大腸桿菌。 3。表達(dá)的設(shè)備不會(huì)有太大的代謝負(fù)擔(dān) 由于我們的最終系統(tǒng)將使用植物路線和生長(zhǎng)素隨心模塊的,我們必須考慮,修改后的細(xì)菌就已經(jīng)是下一個(gè)巨大的代謝負(fù)擔(dān)。因此,使用必要的最低限度的資源基因警衛(wèi)促進(jìn)趨化對(duì)蘋果酸和IAA生產(chǎn)由我們的系統(tǒng)將是有益的。 4。必須能夠來測(cè)試系統(tǒng)是否 要做到這一點(diǎn),我們必須使用報(bào)告基因。
49、最常見的報(bào)告基因的熒光蛋白R(shí)FP和GFP等。由于質(zhì)粒CRIM,已經(jīng)有sfGFP,我們將使用,測(cè)試表達(dá)反holin。為了測(cè)試是否該質(zhì)粒是功能,我們將結(jié)合RFP到質(zhì)粒。我們希望能夠看到一個(gè)天然的細(xì)菌質(zhì)粒熒光紅色寬視場(chǎng)顯微鏡前裂解。 (3)設(shè)計(jì) 目標(biāo)是確保制定的規(guī)格,被認(rèn)為是基因衛(wèi)隊(duì)的設(shè)計(jì)。 1。防止任何其他細(xì)胞,是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移 T4細(xì)胞內(nèi)溶素和T4 holin的是反PCRd從BBa_K112808。然而,我們必須確保接收這些基因的細(xì)胞裂解。為了確定所使用的啟動(dòng),我們模擬整個(gè)系統(tǒng)。既然有這么多的holin和溶素(高拷貝質(zhì)粒)等少數(shù)幾個(gè)副本的holin基因(基因組)
50、的副本,我們決定J23103子相對(duì)于J23100子,我們可以選擇正確的強(qiáng)度。但是,我們也有這個(gè)弱的啟動(dòng)子型號(hào)是否有足夠的接收質(zhì)粒的細(xì)胞裂解。根據(jù)我們的模型,任何接收我們的holin的和溶素基因的細(xì)胞裂解。 2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因 此模塊主要依賴于模型在設(shè)計(jì)過程中。我們必須考慮到一個(gè)事實(shí),即質(zhì)粒的拷貝數(shù)和基因組中的拷貝數(shù)是可變的設(shè)計(jì)時(shí),毒素和抗毒素成分。我們發(fā)現(xiàn),該啟動(dòng)子的holin-細(xì)胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒具有弱于的holin構(gòu)建體中的基因組是有效的是40-400倍。該比率應(yīng)采取考慮到的基因的拷貝數(shù)之間的可變性,并確保不存在的至少一個(gè)為每一個(gè)反holin分子產(chǎn)生holin分子。
51、 可以肯定的是,我們修改后的細(xì)菌會(huì)存活holin的和溶素的生產(chǎn),我們選擇了J23103的啟動(dòng)子具有一定的實(shí)力在低端的啟動(dòng)子強(qiáng)度范圍。這提供了以下兩種結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì): 3。表達(dá)的設(shè)備不會(huì)有太大的代謝負(fù)擔(dān) 雖然這個(gè)規(guī)范是非常重要的,它沒有在這個(gè)版本的模塊的設(shè)計(jì)中發(fā)揮了巨大的作用。這是因?yàn)?,就目前而言,生長(zhǎng)素是一種概念證明系統(tǒng)。一旦它已經(jīng)表明,基因Guard是一個(gè)可行的遏制方法,我們將修改的構(gòu)造,以實(shí)現(xiàn)具有抗holin滅活holin,而不是對(duì)細(xì)胞是一個(gè)很大的負(fù)擔(dān)之間的理想平衡。 4。能夠測(cè)試系統(tǒng)的工作原理 為了做到這一點(diǎn),我們決定附加RFP作為holin根據(jù)相同的啟動(dòng)子和細(xì)胞內(nèi)溶素的基因的編碼
52、序列。這將使我們能夠輕松,直觀的測(cè)試細(xì)胞是否包含我們的質(zhì)粒。至于holin構(gòu)建體,CRIM質(zhì)粒已經(jīng)包含一個(gè)sfGFP的序列。 將能夠區(qū)分我們完成的構(gòu)建從每一個(gè)其他的細(xì)胞,由于其卡那霉素和氨芐青霉素抗性,以及其生產(chǎn)的RFP和sfGFP。因此,我們將能夠看到我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個(gè)單元格不發(fā)出綠色熒光,應(yīng)該是能夠跟蹤是否溶解或下寬視場(chǎng)顯微鏡。 (4)模型 1)簡(jiǎn)介 基因防護(hù)裝置包括三種蛋白質(zhì): 1。 Holin是一種蛋白質(zhì),形成孔隙的配合物在細(xì)菌內(nèi)膜和這些孔允許細(xì)胞內(nèi)溶素進(jìn)入的周質(zhì)空間。 2 溶素是一種酶,能分解細(xì)胞壁和誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。 3。 反holin結(jié)合holin并阻止它的形成毛孔。
53、 我們的系統(tǒng)將holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的基因一起的草本-路由和生長(zhǎng)素隨心基因的質(zhì)粒上,和反holin基因的強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下的基因組上。該生產(chǎn)的抗holin的會(huì)阻止細(xì)胞裂解的轉(zhuǎn)基因(GM)細(xì)菌通過停用holin。如果該質(zhì)粒不含抗holin它的基因組(例如任何野生型土壤細(xì)菌)轉(zhuǎn)移到一個(gè)不同的細(xì)菌,holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。這將防止擴(kuò)散的生長(zhǎng)素載體,含有植物的路線和生長(zhǎng)素隨心基因,自然產(chǎn)生的土壤細(xì)菌。 2)目標(biāo) 此設(shè)備的成功的關(guān)鍵是正確的比例,這樣的反holin的,可以關(guān)閉所有holin,我們修改后的細(xì)菌中產(chǎn)生的,并holin的表達(dá)水平野生型細(xì)菌的holin和反holin的生產(chǎn)是
54、高到足以誘導(dǎo)細(xì)胞溶解??刂苹虮磉_(dá)的啟動(dòng)子強(qiáng)度和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的實(shí)力,造型的基因警衛(wèi),重要的是要幫助我們選擇適當(dāng)強(qiáng)度的一個(gè)子和蘇格蘭皇家銀行的。 3)說明 基因衛(wèi)兵的建模由兩部分組成,一個(gè)是在野生型細(xì)菌的holin生產(chǎn)和其他抗holin holin的失活在我們的改性的細(xì)菌。因?yàn)樵谖覀兊南到y(tǒng)中的所有的基因組成型表達(dá),我們只考慮穩(wěn)定狀態(tài)。 在野生型土壤細(xì)菌的Holin生產(chǎn) 導(dǎo)出一個(gè)單一的質(zhì)粒的啟動(dòng)子強(qiáng)度之間的關(guān)系,和RBS強(qiáng)度holin集中在這部分的造型。為了模擬這種情況,作如下假設(shè): 1)基因衛(wèi)隊(duì)包含在一個(gè)pSB1C3質(zhì)粒含有pUC19中衍生的促進(jìn)pMB1復(fù)制起點(diǎn)(100-3
55、00分子每單元)[5] 。在細(xì)菌中的質(zhì)粒的數(shù)量范圍從100到300每個(gè)細(xì)胞。為了確保子和蘇格蘭皇家銀行是足夠強(qiáng)大的的holin /溶素是有效的,我們低估了質(zhì)粒的土壤細(xì)菌為50,盡管他們總是至少有100。因此,我們的系統(tǒng)時(shí),應(yīng)該工作的質(zhì)粒在土壤細(xì)菌的數(shù)目是大于50。 2)該文獻(xiàn)表明,發(fā)生細(xì)胞溶解在holin等于1000個(gè)分子/細(xì)胞的濃度[1],[5],[6] ,因此,我們用這樣的細(xì)胞裂解在我們的系統(tǒng)中的閾值濃度。 3)由于所使用的結(jié)構(gòu)表征Pveg子去年包含一個(gè)突變中,我們假設(shè), 我們用于抗holin的啟動(dòng),Pveg2具有相同的強(qiáng)度,Pveg。 基于這些假設(shè),野生型細(xì)菌細(xì)胞裂解的動(dòng)力學(xué)模型,
56、用普通的微分方程(ODEs)的holin表達(dá)和holin的蛋白質(zhì)(公式1)。在穩(wěn)定狀態(tài)(即 [表達(dá)holin ] / DT = 0和d [holin] / DT = 0),重新整理式(1)[holin] = 1000,我們獲得了表達(dá)在所示為P holin K表holin的公式2。 Holin抑制基因細(xì)菌 在我們的細(xì)菌的基因組上的強(qiáng)度的啟動(dòng)子和RBS控制表達(dá)的反holin應(yīng)該高于與holin一個(gè)單一的質(zhì)粒,例如,300的質(zhì)粒的拷貝(最大拷貝數(shù)在一個(gè)單一的細(xì)菌所產(chǎn)生的所有的holin )可以被抑制。在我們的系統(tǒng)中,抗-holin到holin結(jié)合形成二聚體,它被定義為失活的holin。由式(
57、3)的機(jī)制,我們修改后的細(xì)菌。我們定義的啟動(dòng)子和RBS強(qiáng)度的比率分別為抗-holin和holin為“m”,如公式4中看到。 4)結(jié)果與討論 通過改變比m的公式4中,我們發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因細(xì)菌holin濃度下降至零比米≥300(參見圖1)。然后,我們測(cè)試了米= 400與反holin啟動(dòng)子(J23100),我們有與強(qiáng)度13.1皮克核糖核酸/分鐘/μg的底物DNA,其結(jié)果是顯 ??示在圖2中。 圖1:在轉(zhuǎn)基因細(xì)菌holin濃度與比m(米=(P 的抗holin ? 抗holin)/(P holin ? holin))。本圖顯示了細(xì)胞內(nèi)的濃度holin保持在零,如果m> 300。(模型由英國(guó)倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì))。 圖2:在m = 400的不同蛋白物種隨時(shí)間的演變。所有的holin蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抑制的holin濃度保持在所有的時(shí)間,而holin野生型細(xì)菌的濃度達(dá)到1000每單元后5000秒的模型由倫敦帝國(guó)學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)。 總之,基因后衛(wèi)的造型告訴他們,啟動(dòng)子的強(qiáng)度和RBS holin和反holin的強(qiáng)度可任意選擇,只要他們的比率(即 P的反holin K表抗holin)/(holin K表holin的) > 300),以使其一定,的比例值400被選擇為我們的項(xiàng)目。
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