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2019-2020年高中生物 5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段同步訓(xùn)練（含解析）新人教版選修1 目標(biāo)導(dǎo)航　1.知道細胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分與反應(yīng)條件；知道DNA合成方向。2.理解PCR的原理；掌握PCR的基本步驟及每個步驟前后發(fā)生的變化。 一、PCR技術(shù)的原理 1．PCR擴增方向 (1)3′端和5′端：為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為________，而含____________的末端稱為________；一個雙鏈DNA分子中含兩個3′端和兩個5′端，如果一條鏈的方向是________，則另一條鏈的方向就是________，這就是反向平行的含義。 (2)DNA分子中相鄰兩個脫氧核苷酸殘基通過________________相連，該化學(xué)鍵是由一分子脫氧核苷酸中3號碳原子上的羥基(—OH)，與相鄰的另一分子脫氧核苷酸中5號碳原子上的磷酸基團脫水聚合而成。所以DNA的合成方向總是從子鏈的________向________延伸。 2．PCR技術(shù)原理 (1)PCR原理：DNA分子在一定條件下可以進行半保留復(fù)制。 (2)DNA的熱變性原理：在________的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為________；當(dāng)溫度緩慢下降后，兩條被分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈，這個過程稱為________。 3．生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別 體內(nèi)復(fù)制 PCR反應(yīng) 解旋 在______作用下，細胞提供能量，部分解開 加熱至______，雙鏈全部解開，不需解旋酶 引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段 合成子鏈 在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成 分別從兩條鏈的______開始，都是連續(xù)合成，控制溫度______ 特點 ____________，半保留復(fù)制 體外迅速擴增 Taq DNA聚合酶 ______ ____ 循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制 30多次 相同點 生物體內(nèi)的DNA復(fù)制和PCR體外DNA擴增都需要____、____________作原料、____，子鏈延伸的方向都是從______到______，且都需要在一定的緩沖溶液中進行 二、PCR的反應(yīng)過程 1．反應(yīng)條件 (1)穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境。 (2)DNA模板。 (3)分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物。 (4)A、T、G、C四種脫氧核苷酸。 (5)耐高溫的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。 (6)能嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備。 2．過程 (1)________(90～95℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。 (2)________(55℃左右)：兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合，形成局部雙鏈。 (3)________(72℃左右)：在Taq DNA聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸為原料，根據(jù)堿基互補配對原則，從引物的5′端→3′端延伸合成與模板互補的DNA鏈。 3．結(jié)果 (1)PCR的每一輪循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三步，從第二輪循環(huán)開始，每次循環(huán)的產(chǎn)物也做模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸。這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的DNA序列呈____________。 (2)PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，處于兩引物間固定長度的序列數(shù)目約為________。 三、PCR反應(yīng)的實驗操作流程 1．操作步驟 ________：按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放于實驗桌上 　 ________：用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組成成分 　 ________：蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁 　 ________：將微量離心管放在離心機上，離心約10 s。目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部 　 ________：將離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進行反應(yīng) 2．操作提示 (1)避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前必須進行____________。 (2)緩沖液和酶分裝成小份，并在________儲存。 (3)每添加一種反應(yīng)成分，更換一個________的槍頭。 (4)混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在________底部。 3．實驗中DNA含量的測定 理論上DNA擴增呈指數(shù)增長，即一條DNA片段循環(huán)n次后的數(shù)目為2n，但實際可能會有諸多因素影響DNA含量，所以需要對DNA含量進行測定。 (1)原理 DNA在260 nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰。峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。可以利用DNA這一特點進行DNA含量的測定。 (2)過程 ①稀釋：2 μL PCR反應(yīng)液，加入98 μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋。 ②對照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對照，在波長260 nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。 ③測定：取DNA稀釋液100 μL至比色杯中，測定260 nm處的光吸收值。 ④計算：DNA含量(μg/mL)＝50(260 nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)。 知識點一　PCR的原理和反應(yīng)過程 1．DNA擴增過程中，DNA片段經(jīng)若干次擴增，與其數(shù)目的理論值變化相符的圖是(　　) 2．在PCR擴增DNA的實驗中，根據(jù)設(shè)計，一分子DNA經(jīng)30次循環(huán)后，應(yīng)得到約230個DNA分子，但結(jié)果只有約210個DNA分子。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是(　　) ①循環(huán)次數(shù)不夠?、赥aq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制?、垡锊荒芘c模板鏈結(jié)合　④系統(tǒng)設(shè)計欠妥 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④ 知識點二　PCR的實驗操作 3．在遺傳病及刑偵破案中常需要對樣品DNA進行分析，PCR技術(shù)能快速擴增DNA片段，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題。據(jù)圖回答相關(guān)問題： a鏈5′－G－G……T－C－3′　　5′－G－G－OH(引物Ⅰ) b鏈3′－C－C……A－G－5′　　________(引物Ⅱ) 　　　　　　 95℃↓ 5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′ 　　　　　　 55℃↓ 5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′ 　　　　　　　　　 5′－G－G－OH 　　　　　　 72℃↓ 　______________　　______________ (1)在相應(yīng)的橫線上寫出引物Ⅱ，并在復(fù)性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。 (2)在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。 (3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記，請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點是______________________________；循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為________。 4．有關(guān)下列操作過程的敘述，錯誤的是(　　) A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲存 C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換 一、選擇題 1．下列有關(guān)PCR的描述，不正確的是(　　) A．是一種酶促反應(yīng) B．引物決定了擴增的特異性 C．PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n指數(shù)擴增 D．?dāng)U增對象是氨基酸序列 2．DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是(　　) A．可加快DNA的復(fù)制速度 B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA鏈 D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈 3．變性作用是指核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，雙鏈解開，但共價鍵并未斷裂。引起變性的因素很多，升高溫度、過酸、過堿以及加入變性劑等都能造成核酸變性。PCR的反應(yīng)過程中，引起變性的因素是(　　) A．pH 過高 B．pH 過低 C．升高溫度 D．加入酒精 4．PCR技術(shù)擴增DNA，需要的條件是(　　) ①目的基因　②引物?、鬯姆N脫氧核苷酸　④DNA聚合酶等?、輒RNA　⑥核糖體 A．①②③④ B．②③④⑤ C．①③④⑤ D．①②③⑥ 5．用15N標(biāo)記的一個DNA分子放在含14N培養(yǎng)基中復(fù)制三次，含15N的DNA分子占全部DNA分子的比例和含15N的DNA單鏈占全部DNA單鏈的比例依次是(　　) A．1/4,1/6 B．1/4,1/8 C．1/2,1/8 D．1/2,1/4 6．下圖所示為PCR擴增的產(chǎn)物，請分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A．第一次循環(huán) B．第二次循環(huán) C．第三次循環(huán) D．第四次循環(huán) 7．關(guān)于DNA聚合酶催化合成DNA子鏈的說法中，正確的是(　　) A．以DNA為模板，使DNA子鏈從5′端延伸到3′端的一種酶 B．Taq DNA聚合酶必須在每次高溫變性處理后再添加 C．DNA聚合酶能特異性地復(fù)制整個DNA的全部序列 D．Taq DNA聚合酶是從深海生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的 8．使用PCR儀具體實驗操作順序應(yīng)為(　　) ①設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序?、诎磁浞綔?zhǔn)備好各組分?、塾梦⒘恳埔浩髟谖⒘侩x心管中依次加入各組分?、苓M行PCR反應(yīng)?、蓦x心使反應(yīng)液集中在離心管底部 A．②③⑤④① B．①⑤③②④ C．②③⑤①④ D．④②⑤③① 二、簡答題 9．下圖是PCR技術(shù)示意圖，請回答下列問題： (1)標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為__________、____________、____________三大步驟。 (2)引物是此過程中必須加入的物質(zhì)，從化學(xué)本質(zhì)上說，引物是一小段______________。 (3)將雙鏈DNA____________，使之變性，從而導(dǎo)致________________________。 (4)引物延伸需提供_________________________________________________作為原料。 10．PCR技術(shù)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，操作步驟簡介如下： 第Ⅰ步：準(zhǔn)備“湯”和模板DNA A．配制多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)“湯” 注：①SPU是一種溶液的計量單位；②礦物油可防止聚合酶在凍結(jié)時受傷害，以保證酶的活性；③dNTP有四種：dATP、dGTP、dCTP、dTTP。 B．準(zhǔn)備要拷貝的DNA 如要拷貝自己的DNA可以用一牙簽輕刮口腔內(nèi)壁，將牙簽放入蒸餾水中搖動。加熱使蒸餾水沸騰，使細胞破碎釋放出DNA。用離心機離心后，去除蒸餾水中較大的細胞碎片。這時上清液中就有了較純的DNA。 第Ⅱ步：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ①將DNA(B)放入湯(A)中。②水浴加熱。首先，95 ℃，使DNA雙螺旋打開，歷時1 min；然后，55℃，使引物結(jié)合到DNA上，歷時30 s；最后，72 ℃，與DNA聚合酶結(jié)合使DNA復(fù)制，歷時1 min。③重復(fù)步驟②。每重復(fù)一次，即完成一次拷貝。 根據(jù)上述操作過程回答下列問題： (1)以上材料可以說明(　　) A．DNA的復(fù)制必須在活細胞中才能完成 B．DNA能指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成 C．在合適的條件下，非細胞環(huán)境也能進行DNA的復(fù)制 D．PCR技術(shù)是一種無性生殖技術(shù) (2)若用人體細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)做PCR擴增，則擴增后的幾百億個DNA分子起碼可分為46種。要將其分開，可用電泳、染色等技術(shù)，常用的試劑有溴化乙錠等。有些試劑毒性較強，因此應(yīng)戴上化學(xué)實驗專用手套作為保護措施，以免其與皮膚接觸。溴化乙錠是一種強烈的誘變物，若接觸皮膚活細胞，很可能會引起(　　) A．基因重組 B．該個體會產(chǎn)生變異較大的后代 C．癌變 D．皮膚外層是死細胞，該物質(zhì)接觸皮膚后對人體不會有影響 (3)PCR技術(shù)中用到的DNA聚合酶，取自生長在熱泉中的一種細菌。就PCR技術(shù)來講，你認(rèn)為使用這種細菌中提取的酶較普通的動植物體內(nèi)提取的DNA聚合酶的優(yōu)勢是 ________________________________________________________________________。 (4)PCR技術(shù)能將某一DNA分子擴增成許多相同的DNA片段，原因是：①DNA分子具有____________________結(jié)構(gòu)；②DNA復(fù)制時遵循____________________原則。 (5)DNA分子進行擴增時，除了所要擴增的DNA片段外，還需要四種________________、________和________等條件。若已知DNA的一條單鏈的堿基組成為ATCCGAT，則與它互補的另一條單鏈的堿基組成為_________________________________________________。 第17課時　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段 知識清單 一、1.(1)3′端　磷酸基團　5′端　3′→5′　5′→3′ (2)3′5′磷酸二酯鍵　5′端　3′端 2．(2)80～100℃　變性　復(fù)性 3．解旋酶　95℃　引物端　72℃　邊解旋邊復(fù)制　不需要　需要　模板　四種脫氧核苷酸　酶　5′端　3′端 二、2.(1)變性　(2)復(fù)性　(3)延伸 3．(1)指數(shù)擴增　(2)230 三、1.準(zhǔn)備　移液　混合　離心　反應(yīng) 2．(1)高壓滅菌　(2)－20℃　(3)移液器　(4)離心管 對點訓(xùn)練 1．C　[PCR反應(yīng)中DNA的擴增數(shù)目和生物體內(nèi)的DNA復(fù)制是類似的，即1個DNA分子復(fù)制一次，變?yōu)?個，復(fù)制2次，產(chǎn)生4個DNA分子，呈指數(shù)擴增，開始有一個DNA分子的模板，經(jīng)過n次復(fù)制后得到的DNA分子的數(shù)量為2n，與曲線C相符合。] 規(guī)律鏈接　擴增后，循環(huán)次數(shù)與DNA總數(shù)間的有關(guān)計算問題 在進行PCR擴增后，若以一個DNA片段作為模板，經(jīng)n次循環(huán)后DNA分子總數(shù)為2n；若N個DNA片段作模板，經(jīng)n次循環(huán)后DNA分子總數(shù)為N2n。 2．D　[該現(xiàn)象屬于在PCR擴增中假陰性現(xiàn)象。其原因有：(1)Taq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少；(2)引物設(shè)計不合理，可能不能與模板DNA結(jié)合，導(dǎo)致無法進行擴增；(3)提取的模板數(shù)量或質(zhì)量不過關(guān)，不起模板作用，無法進行擴增；(4)PCR系統(tǒng)設(shè)置不妥，達不到預(yù)期的效果；(5)循環(huán)次數(shù)過少，產(chǎn)物的量比預(yù)期的少。] 3．(1)5′—G—A—OH 5′—G—G……T—C—3′　3′—C—C……A—G—5′ 　 HO—A—G—5′　5′—G—G—OH 72℃ (2)3′—C—C……A—G—5′　3′—C—C……A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′　5′—G—G……T—C—3′ (3)每個DNA分子各有一條鏈含32P標(biāo)記　1/2n 解析　(1)DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，所以引物就提供了3′端，子鏈延伸方向5′→3′，引物Ⅰ與b鏈部分堿基互補，引物Ⅱ則與a鏈部分堿基互補，且連接到a鏈的3′端，故引物Ⅱ的結(jié)構(gòu)為5′—G—A—OH，復(fù)性結(jié)果為： 　 HO—A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′ (2)經(jīng)過一次循環(huán)后，產(chǎn)生的兩個DNA分子分別含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。 (3)由于作為原料的四種脫氧核苷酸被32P標(biāo)記，所以新合成的子鏈均含有放射性，一次循環(huán)后的兩個DNA各有一條鏈含32P，若復(fù)制n次，產(chǎn)生子鏈共2n2，其中只有親本的兩條母鏈不含32P，則其所占比例為2/(2n2)＝1/2n。 聯(lián)想　PCR擴增的方向總是從子鏈5′端向3′延伸，所以子鏈的一端需要引物。 規(guī)律鏈接　PCR擴增需要注意的問題 1．DNA復(fù)制需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。PCR中，引物長度通常為20～30個核苷酸。 2．當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度由變性后快速冷卻到50℃左右時，引物與模板可結(jié)合，一般不需要考慮解開的兩個DNA模板鏈的重新結(jié)合，原因是： (1)模板DNA鏈比引物長得多而且復(fù)雜得多，不易重新結(jié)合。 (2)引物和模板之間的碰撞機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞機會。 (3)加入的引物的量足夠大，而模板鏈數(shù)量少。 4．C　[在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱中取出后應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速融化，即C錯誤。] 聯(lián)想　為避免外源DNA污染，所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前必須高壓滅菌，每添加一種反應(yīng)成分更換一個移液器的槍頭，混合后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。 達標(biāo)測試 1．D　[PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，它以極少量的DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原料，在引物作用下使DNA聚合酶從引物的3′端連接脫氧核苷酸，短時間內(nèi)迅速復(fù)制上百萬份的DNA拷貝，其擴增產(chǎn)量y＝a2n，a代表模板DNA量，y代表DNA片段擴增后的理論拷貝數(shù)，n代表循環(huán)次數(shù)；在擴增過程中，被擴增的是DNA序列，而不是氨基酸序列，因此D項錯誤。] 2．D　[DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模瑸榱嗣鞔_地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，而磷酸基團的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從5′端開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′延伸。] 3．C　[各選項的條件均能導(dǎo)致DNA分子變性，但在PCR反應(yīng)中，變性后還要進行復(fù)性和延伸等過程，過酸、過堿、酒精等會導(dǎo)致反應(yīng)過程中的酶變性失活，使DNA擴增不能進行，因此，在PCR反應(yīng)中，選用升高溫度使DNA變性。] 4．A　[PCR技術(shù)需要目的基因作為擴增的模板，DNA聚合酶催化反應(yīng)的進行，而引物是滿足DNA聚合酶起作用的需要，四種脫氧核苷酸是該過程的原料。] 5．B　[DNA是半保留復(fù)制，復(fù)制一次形成兩分子DNA，每條DNA都含有一條15N和14N單鏈；復(fù)制兩次，形成四個分子，含15N的只有兩分子DNA；復(fù)制三次形成的八個DNA分子中含15N的仍是兩分子。這時DNA單鏈有十六條，含15N的只有親代的兩條。] 6．A　[在PCR反應(yīng)中，以引物為標(biāo)記，第一次循環(huán)時，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每個DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng)，所以會形成DNA分子兩端均含引物的情況，如下圖所示，因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。] 7．A　[DNA聚合酶不能從頭開始催化合成DNA，而只能從DNA單鏈的3′端延伸子鏈；Taq DNA聚合酶能耐高溫，所以在反應(yīng)體系中可反復(fù)利用，無需另外再添加；PCR擴增的是引物之間的固定長度的DNA序列；Taq DNA聚合酶是1966年從美國黃石公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)的。] 8．C　[PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備(包括配置配方及將各配方放于實驗臺上)→移液→混合→離心→反應(yīng)，因PCR儀是一種自動控制溫度的儀器，設(shè)計好循環(huán)程序就可以進行反應(yīng)了。] 9．(1)變性　復(fù)性　延伸 (2)單鏈DNA或RNA (3)加熱到95℃　雙鏈DNA分離成兩條單鏈 (4)四種脫氧核苷酸 10．(1)C　(2)C　(3)耐高溫，在較高的溫度下不變性　(4)①規(guī)則的雙螺旋?、趬A基互補配對　(5)脫氧核苷酸　能量　酶　TAGGCTA 解析　(1)在合適的條件下，細胞外也可完成DNA復(fù)制。(2)溴化乙錠是一種化學(xué)誘變物，在DNA的復(fù)制過程中，誘發(fā)基因突變，可能導(dǎo)致細胞發(fā)生癌變。(3)PCR技術(shù)要在較高的溫度下進行，所以使用的DNA聚合酶要耐高溫，在較高的溫度下不變性。(4)DNA規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)和堿基互補配對原則使DNA能夠復(fù)制出與其完全相同的子代。(5)DNA分子復(fù)制時，不僅需要DNA片段，還需要四種游離的脫氧核苷酸、能量、酶等條件。由堿基互補配對原則可知，其互補鏈的堿基組成為TAGGCTA。