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考點(diǎn)80 PCR技術(shù) 1．PCR原理 （1）細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打開(kāi)DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3’端起點(diǎn) （2）細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程 ①DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸。 ②在DNA的復(fù)制過(guò)程中，復(fù)制的前提是雙鏈解開(kāi)。在體外可通過(guò)控制溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)。在80~100 ℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為變性。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過(guò)程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來(lái)耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。 ③PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，需提供：DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 2．PCR的反應(yīng)過(guò)程 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。 3．實(shí)驗(yàn)操作 （1）PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、兩種RNA引物、水。 （2）實(shí)驗(yàn)操作步驟 ①按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液； ②將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5 mL）中； ③將微量離心管放到PCR儀中； ④設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)； ⑤DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。 考向 PCR的反應(yīng)過(guò)程 1．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述30多次循環(huán)：95 ℃下使模板DNA變性、解鏈→55 ℃下復(fù)性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72 ℃下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中不正確的是 A．變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn) B．復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的 C．延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需酶的最適溫度較高 【參考答案】C 【試題解析】變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，解旋酶也具有該作用，A正確。復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的，B正確。延伸是合成DNA的過(guò)程，所以該過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種脫氧核糖核苷酸，C錯(cuò)誤。PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需酶的最適溫度較高，因?yàn)镻CR過(guò)程需要高溫變性，即使在復(fù)性時(shí)的溫度也比較高，D正確。 2．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是 A．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列 B．設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連 C．退火溫度過(guò)高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物 D．第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/16 【答案】D 1．PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，如圖表示合成過(guò)程。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是 A．甲過(guò)程高溫使DNA變性解旋，該過(guò)程不需要解旋酶的作用 B．丙過(guò)程用到的酶在高溫下失活，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)需要再添加 C．如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不做標(biāo)記，循環(huán)3次后，在形成的子代 DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占25% D．PCR中由堿基錯(cuò)配引起的變異屬于基因突變 2．下列有關(guān)PCR技術(shù)中引物的敘述，正確的是 A．引物是一小段DNA分子或雙鏈RNA分子 B．?dāng)U增一個(gè)DNA分子至少需要的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目 C．兩種引物之間能夠發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì) D．DNA聚合酶只能從引物的5＇端連接脫氧核苷酸 3．利用PCR技術(shù)將某DNA分子擴(kuò)增n代的過(guò)程中，下列敘述錯(cuò)誤的是 A．引物越短，PCR出來(lái)的非目標(biāo)DNA就越多 B．適溫延伸過(guò)程中，需要提供ATP C．引物中G/C含量越高，退火溫度越高 D．共有2n-1對(duì)引物參與子代DNA分子的合成 4．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，其簡(jiǎn)要過(guò)程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是 A．PCR技術(shù)是在實(shí)驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù) B．反應(yīng)中新合成的DNA可以作為下一輪反應(yīng)的模板 C．每擴(kuò)增一次溫度發(fā)生90℃→75℃→55℃變化 D．應(yīng)用PCR技術(shù)與DNA分子雜交技術(shù)可以檢測(cè)基因突變 5．小鼠雜交瘤細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體用于人體試驗(yàn)時(shí)易引起過(guò)敏反應(yīng)，為了克服這個(gè)缺陷，可選擇性擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因（目的基因）后再重組表達(dá)。下列相關(guān)敘述正確的是 A．設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)不必考慮表達(dá)載體的序列 B．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要知道基因的全部序列 C．PCR體系中G—C堿基對(duì)含量將影響使DNA解鏈的所需溫度 D．PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶 6．用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，x為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的 A． B． C． D． 7．用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜。其中：1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液（Marker），10號(hào)為蒸餾水，PCR過(guò)程中加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析不合理的是 A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250~500 bp之間 B．3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNA C．9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株 D．10號(hào)可確定反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果沒(méi)有干擾 8．根據(jù)某基因上游和下游的堿基序列，設(shè)計(jì)合成了用于該基因PCR的兩段引物（單鏈DNA)。引物與該基因變性DNA(單鏈DNA)結(jié)合為雙鏈DNA的過(guò)程稱為復(fù)性。下圖是兩引物的Tm（引物熔解溫度，即50%的引物與其互補(bǔ)序列形成雙鏈DNA分子時(shí)的溫度）測(cè)定結(jié)果，下列敘述錯(cuò)誤的是 A．通常引物1和引物2不能有堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系 B．兩引物分別是子鏈延伸的起點(diǎn)，并可以反復(fù)利用 C．若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同，推測(cè)引物2的GC含量較高 D．復(fù)性所需溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度等因素 9．以下為形成cDNA過(guò)程和PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖。據(jù)圖分析，下列說(shuō)法正確的是 A．④過(guò)程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合 B．催化①過(guò)程的酶是DNA聚合酶 C．催化①②⑤過(guò)程的酶都必須能耐高溫 D．過(guò)程③需要解旋酶 10．在遺傳病及刑偵破案中常需要對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題。據(jù)圖回答相關(guān)問(wèn)題。 （1）在相應(yīng)的橫線上寫(xiě)出引物Ⅱ，并在復(fù)性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。__________________。 （2）在相應(yīng)的橫線上寫(xiě)出循環(huán)一次后生成的DNA分子。________。 （3）若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記，請(qǐng)分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點(diǎn)：________，循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為_(kāi)_______。 （4）PCR反應(yīng)過(guò)程的前提條件是________，PCR技術(shù)利用了DNA的________原理解決了這個(gè)問(wèn)題。 （5）在對(duì)樣品DNA分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是___________________。 11．（2018江蘇卷）為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個(gè)堿基對(duì)），利用基因工程大量制備琢α-淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)下圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： （1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α-淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 （2）為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的＿＿＿＿端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 （3）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中＿＿＿＿＿＿＿的設(shè)定與引物有關(guān)，＿＿＿＿＿＿＿＿的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。（填序號(hào)） ①變性溫度 ②退火溫度 ③延伸溫度 ④變性時(shí)間 ⑤退火時(shí)間 ⑥延伸時(shí)間 （4）下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列： 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含＿＿＿個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有＿＿種。 （5）獲得工程菌表達(dá)的α-淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50mmol/LNa2HPO4-KH2PO4 50mmol/LTris-HCl 50mmol/LGly-NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對(duì)活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為＿＿＿＿＿＿。 12． (2016天津卷)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的醫(yī)用價(jià)值，只能從人血漿中制備。下圖是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA（rHSA）的兩條途徑。 （1）獲取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成總cDNA，然后以cDNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴(kuò)增方向，請(qǐng)用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出另一條引物的位置及擴(kuò)增方向。 （2）啟動(dòng)子通常具有物種及組織特異性，構(gòu)建在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)rHSA的載體，需要選擇的啟動(dòng)子是_____________（填寫(xiě)字母，單選）。 A．人血細(xì)胞啟動(dòng)子 B．水稻胚乳細(xì)胞啟動(dòng)子 C．大腸桿菌啟動(dòng)子 D．農(nóng)桿菌啟動(dòng)子 （3）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過(guò)程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是_____________________。 （4）人體合成的初始HSA多肽，需要經(jīng)過(guò)膜系統(tǒng)加工形成正確空間結(jié)構(gòu)才能有活性。與途徑II相比，選擇途徑I獲取rHSA的優(yōu)勢(shì)是_______________________________________。 （5）為證明rHSA具有醫(yī)用價(jià)值，須確認(rèn)rHSA與_________________的生物學(xué)功能一致。 1．【答案】B 【解析】PCR中解旋是通過(guò)高溫進(jìn)行的，故甲過(guò)程高溫使DNA變性解旋，該過(guò)程不需要解旋酶的作用，A正確；丙過(guò)程用到的酶為耐高溫的DNA聚合酶，在高溫下不會(huì)失活，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)不需要再添加，B錯(cuò)誤；如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不做標(biāo)記，循環(huán)3次后，形成的DNA分子為8個(gè)，而含有15N標(biāo)記的DNA分子為2個(gè)，故在形成的子代DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占25%，C正確；PCR中由堿基錯(cuò)配引起的變異屬于基因突變，D正確。 2．【答案】B 3．【答案】B 【解析】引物越短，PCR出來(lái)的非目標(biāo)DNA就越多，A正確；適溫延伸過(guò)程中，不需要提供ATP，B錯(cuò)誤；引物中G/C含量越高，則DNA模板中G/C的含量也高，高溫變性的溫度就越高，退火溫度也越高，C正確；PCR技術(shù)的原理是DNA復(fù)制，根據(jù)DNA分子半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，共有2n-1對(duì)引物參與子代DNA分子的合成，D正確。 4．【答案】C 【解析】PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，能以少量DNA為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出大量的DNA，A正確；PCR技術(shù)需要模板DNA，且反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，B正確；每擴(kuò)增一次溫度發(fā)生95℃→55℃→72℃變化，C錯(cuò)誤；應(yīng)用PCR技術(shù)與DNA分子雜交技術(shù)可以檢測(cè)基因突變，D正確。 5．【答案】C 【解析】設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)，要考慮表達(dá)載體相關(guān)序列，從而保證目的的基因能與表達(dá)載體相連接及正常表達(dá)，A錯(cuò)誤；用PCR方法擴(kuò)增目的基因的前提是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，因此不需要知道基因的全部序列，B錯(cuò)誤；在每個(gè)雙鏈DNA分子中，堿基對(duì)A與T之間有2個(gè)氫鍵，C與G之間有3個(gè)氫鍵，且DNA分子含有的氫鍵數(shù)越多，其熱穩(wěn)定性就越高，因此PCR體系中G—C堿基對(duì)含量將影響使DNA解鏈的所需溫度，C正確；PCR體系中一定要添加耐高溫的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，而從受體細(xì)胞內(nèi)提取的DNA聚合酶不耐高溫，D錯(cuò)誤。 6．【答案】D 【解析】利用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)引物與母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，子鏈延伸的方向總是從5′端到3′端，據(jù)此依題意和圖示分析可知，A、B、C均錯(cuò)誤，D正確。 7．【答案】B 8．【答案】B 【解析】通常引物1和引物2不能有堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，以免二者結(jié)合，A項(xiàng)正確；兩引物參與構(gòu)成子鏈，不能反復(fù)利用，B項(xiàng)錯(cuò)誤；若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同，引物2的熔解溫度較高，推測(cè)其GC含量較高，C項(xiàng)正確；結(jié)合以上分析可知，復(fù)性所需溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度等因素，D項(xiàng)正確。 9．【答案】A 【解析】分析題圖：圖示為形成cDNA過(guò)程和PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖，其中①是由RNA形成單鏈DNA的過(guò)程，為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程；②是由單鏈DNA合成雙鏈DNA的過(guò)程，是DNA分子復(fù)制過(guò)程；③④⑤是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段，其中③是變性、④是復(fù)性、⑤是延伸階段。④為復(fù)性過(guò)程，發(fā)生的變化是引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合，A正確；①為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，該過(guò)程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，B錯(cuò)誤；圖中②⑤過(guò)程為DNA復(fù)制，這兩個(gè)過(guò)程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤過(guò)程進(jìn)行的溫度是70～75℃，因此催化該過(guò)程的DNA聚合酶能耐高溫，但催化②過(guò)程的酶不耐高溫，C錯(cuò)誤；過(guò)程③為高溫解鏈，該過(guò)程不需要解旋酶，D錯(cuò)誤。 10．【答案】（1）5′—G—A—OH(或HO—A—G—5′) （2） （3）每個(gè)DNA分子各有一條鏈含32P 1/2n （4）DNA解旋 熱變性 （5）蛋白酶 【解析】（1）由圖可知，引物Ⅱ?yàn)?’-G-A-OH。（2）循環(huán)一次后生成的DNA分子如下：。（3）若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記，根據(jù)DNA半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，循環(huán)一次后，每個(gè)DNA分子各有一條鏈含32P，循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為2/2n+1=1/2n。（4）PCR反應(yīng)過(guò)程的前提條件是DNA解旋，PCR技術(shù)利用DNA的熱變性原理解決了這個(gè)問(wèn)題。（5）在對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，DNA摻雜著一些組蛋白，根據(jù)酶的專一性原理，要去除這些組蛋白可加入蛋白酶。 11．【答案】（1）基因組DNA （2）5’ 使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連 （3）② ⑥ （4）8 13 （5）pH為8.5，緩沖液為50mmol/LTris-HCl 12．【答案】（1）總RNA（或mRNA） （2）B （3）吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細(xì)胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化 （4）水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對(duì)初始rHSA多肽進(jìn)行高效加工 （5）HSA