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考點81 基因工程（二） 1．基因工程的操作過程與應用 （1）基因工程的操作步驟 （2）基因工程的應用：培育轉基因植物和轉基因動物，生產基因工程藥物，進行基因治療。 （3）目的基因導入不同受體細胞的過程 生物種類 植物 動物 微生物 常用方法 農桿菌轉化法 顯微注射技術 感受態(tài)細胞法 受體細胞 體細胞或受精卵 受精卵 原核細胞 轉化過程 將目的基因插入到Ti質粒的TDNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達 將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子 （4）基因治療與基因診斷的不同點 原理 操作過程 進展 基因治療 基因表達 利用正?；驅胗谢蛉毕莸募毎校员磉_出正常性狀來治療(疾病) 臨床實驗 基因診斷 堿基互補配對 制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況 臨床應用 2．蛋白質工程 （1）流程圖 寫出流程圖中字母代表的含義： A．轉錄，B．翻譯，C．分子設計，D．多肽鏈，E．預期功能。 （2）結果：改造了現有蛋白質或制造出新的蛋白質。 （3）應用：主要集中應用于對現有蛋白質進行改造，改良生物性狀。 考向一 目的基因的獲取及基因表達載體的構建 1．利用人胰島B細胞構建cDNA文庫，然后通過核酸分子雜交技術從中篩選目的基因，篩選過程如下圖所示。下列說法錯誤的是 A．cDNA文庫的構建需要用到逆轉錄酶 B．圖中的菌落是通過稀釋涂布法獲得的 C．核酸分子雜交的原理是堿基互補配對 D．從該文庫中可篩選到胰高血糖素基因 【參考答案】D 歸納整合 幾種目的基因獲取方法的比較 方法 從基因文庫中獲取 人工合成 從基因組文 庫中獲取 從部分基因文庫，如cDNA文庫中獲取 化學合成法 反轉錄法 過 程 2．下圖是利用基因工程技術生產可食用疫苗的部分過程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性核酸內切酶。下列有關說法中正確的是 A．圖示過程是基因工程的核心步驟，所需的限制性核酸內切酶均來自原核生物 B．圖示中構建基因表達載體時，需用到一種限制性核酸內切酶 C．一種限制性核酸內切酶只能識別一種特定的核糖核苷酸序列 D．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來 【答案】D 考向二 基因工程的操作及應用實例分析 3．下面圖1為某植物育種流程，圖2表示利用農桿菌轉化法獲得某種轉基因植物的部分操作步驟。下列相關敘述錯誤的是 A．圖1子代Ⅰ與原種保持遺傳穩(wěn)定性，子代Ⅱ和子代Ⅲ選育原理相同 B．圖1子代Ⅲ選育顯性性狀需自交多代，子代Ⅴ可能發(fā)生基因突變和染色體變異 C．圖2中①過程的完成需要限制酶和DNA連接酶的參與 D．圖2中⑥可與多個核糖體結合，并可以同時翻譯出多種蛋白質 【參考答案】D 技法提煉 1．基因表達載體中啟動子、終止子的來源 （1）如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子，因為目的基因中已含有啟動子、終止子。 （2）如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。若只將基因的編碼序列導入受體生物中，目的基因沒有啟動子、終止子，是無法轉錄的，因此，在構建基因表達載體時，需要在與質粒結合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。 2．基因工程中的幾種檢測方法 4．科學家通過基因工程方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內，并成功實現了表達，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株——抗蟲棉。其過程大致如下圖所示： 根據題意，回答下列問題： （1）基因工程的操作程序主要包括的四個步驟是：目的基因的獲取、________________、____________________和_____________________。 （2）Ti質粒是農桿菌中的一種質粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti質粒的T-DNA中是利用T-DNA的______________________________特點。 （3）Bt毒蛋白基因轉入普通棉株細胞內并成功實現表達的過程，在基因工程中稱為___________。 （4）將目的基因導入受體細胞的方法有很多種，該題中涉及的是____________________。 （5）目的基因能否在棉株內穩(wěn)定維持和表達其遺傳性質的關鍵是____________________，這需要通過檢測才能知道，檢測采用的方法是________________________________。 【答案】（1）基因表達載體的構建 將目的基因導入受體細胞 目的基因的檢測與鑒定 （2）可轉移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體DNA上 （3）轉化 （4）農桿菌轉化法 （5）目的基因是否插入了受體生物細胞的染色體DNA上 DNA分子雜交技術 考向三 蛋白質工程概念和過程的辨析 5．下圖表示蛋白質工程的操作過程，相關說法不正確的是 A．蛋白質工程中對蛋白質分子結構的了解是非常關鍵的工作 B．蛋白質工程是完全擺脫基因工程技術的一項全新的生物工程技術 C．a、b過程分別是轉錄、翻譯 D．蛋白質工程中可能構建出一種全新的基因 【參考答案】B 解題技巧 蛋白質工程與基因工程的比較 （1）區(qū)別 項目 蛋白質工程 基因工程 過程 預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列 獲取目的基因→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定 實質 定向改造或生產人類所需的蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型和生物產品 結果 可生產自然界沒有的蛋白質 只能生產自然界已有的蛋白質 （2）聯系 ①蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程。 ②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造。 6．現代生物技術并不是各自獨立的，而是相互聯系、相互滲透的。下圖表示利用乳腺生物反應器生產某種動物蛋白的流程示意圖，請分析回答下列問題： （1）該生產流程中應用到的現代生物技術有__________、______________(寫出其中兩種)。 （2）圖中A、B分別表示____________________________、______________________。 （3）為提高培育成功率，進行②過程之前，對早期胚胎的處理是取其部分細胞用目的基因探針進行__________________檢測，對受體動物的處理是用________________進行同期發(fā)情處理。 （4）蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質，原因是___________________________________________________。 【答案】（1）蛋白質工程 基因工程 胚胎移植技術(任寫兩種) （2）推測應有的氨基酸序列 基因表達載體 （3）DNA(核酸)分子雜交 促性腺激素 （4）改造后的基因能夠遺傳(且改造基因易于操作) 1．下列關于目的基因導入受體細胞的描述，不正確的是 A．農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞最常用的方法 B．顯微注射技術是轉基因動物中采用最多的方法 C．大腸桿菌最常用的轉化方法是用Ca2+使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變 D．基因槍法導入植物體細胞的方法比較經濟有效 2．下表是基因工程操作中鑒定含目的基因植株的4種方法。請預測同一后代種群中，4種方法檢出的含目的基因植株的比例最小的是 選項 方法 檢驗對象 檢測目標 A PCR擴增 基因組DNA 目的基因 B 分子雜交 總mRNA 目的基因轉錄產物 C 抗原—抗體雜交 總蛋白質 目的基因編碼的蛋白質 D 噴灑除草劑 幼苗 抗除草劑幼苗 A．A B．B C．C D．D 3．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，不正確的是 A．①→②利用兩種不同限制酶處理，能避免抗蟲基因的DNA片段自身環(huán)化 B．②→③可用氯化鈣處理農桿菌，有助于促進重組Ti質粒轉化到農桿菌細胞中 C．③→④用農桿菌侵染植物細胞，重組Ti質粒整合到植物細胞的染色體上 D．④→⑤用植物組織培養(yǎng)技術培養(yǎng)，具有抗蟲性狀的植株產生了可遺傳變異 4．利用基因工程技術生產羧酸酯酶(CarE)制劑，用于降解某種農藥的殘留，基本流程如圖。下列敘述正確的是 A．過程①的反應體系中需要加入逆轉錄酶和核糖核苷酸 B．過程②需使用限制酶和DNA聚合酶，是基因工程的核心步驟 C．過程③需要使用NaCl溶液制備感受態(tài)的大腸桿菌細胞 D．過程④可利用PCR技術鑒定CarE基因是否成功導入受體細胞 5．下圖表示利用基因工程生產胰島素的三種途徑，據圖判斷下列說法錯誤的是 A．導入受體細胞C需要用Ca2+處理使大腸桿菌處于感受態(tài) B．利用顯微注射的方法將目的基因導入受體細胞A即乳腺細胞 C．受體細胞B通常為萵苣的體細胞，經脫分化、再分化形成個體 D．三種方法得到的胰島素結構不完全相同 6．如圖是生產轉基因抗蟲棉技術的流程圖。已知卡那霉素抗性基因（kanR）常作為標記基因，只有含卡那霉素抗性基因的細胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長。下列敘述正確的是 ①為檢測抗蟲基因是否成功表達，將“離體棉花葉片組織”放在含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng) ②為了防止黏性末端任意連接，可將抗蟲基因和質粒均用兩種限制酶進行處理 ③卡那霉素抗性基因（kanR）中可能存在限制酶的酶切位點 ④生產抗蟲棉的整個過程中只需要基因工程操作即可 A．②④ B．①② C．②③ D．③④ 7．下列不屬于基因工程應用實例的是 A．培育出抗煙草花葉病毒的番茄植株 B．在大腸桿菌內獲取人的干擾素 C．利用克隆技術保護珍稀動物 D．利用“工程菌”生產乙肝疫苗 8．北極比目魚有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有11個氨基酸的重復序列，該序列重復次數越多，抗凍能力越強。如圖是獲取轉基因抗凍番茄植株的過程示意圖，有關敘述正確的是 A．將多個抗凍基因編碼區(qū)依次相連成能表達的新基因，不能得到抗凍性增強的抗凍蛋白 B．過程①獲取的目的基因，可用于基因工程和比目魚基因組測序 C．過程①需要的工具酶是RNA聚合酶 D．采用DNA探針可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其完全表達 9．美國和澳大利亞的研究人員發(fā)現，從錐形蝸牛體內提取出的毒液有望幫助人類開發(fā)出超級速效的胰島素。他們研究表明錐形蝸牛毒蛋白(Con-InsGl)能加速受體細胞信號轉換，比人類胰島素更加快速的發(fā)揮作用。因此制造這類“速效胰島素”以及利用轉基因技術實現批量生產成為Ⅰ型糖尿病治療的新思路。請回答下列問題： （1）利用基因工程制造Con-InsGl這種速效胰島素過程中，構建的基因表達載體一般包括目的基因、啟動子、標記基因、_________和復制原點，標記基因的作用是________________________。 （2）為了獲得目的基因可以通過提取分析Con-InsGl毒蛋白中的__________序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，再用DNA合成儀直接大量合成?；蚬こ讨行枰狣NA連接酶，根據酶的來源不同分為________兩類。 （3）將人工合成的目的基因導入大腸桿菌體內，一般先用藥物處理大腸桿菌使之成為____________細胞，再將重組DNA溶于____________中與該類細胞融合，在一定溫度下促進細胞吸收重組DNA分子完成轉化過程。 （4）經過目的基因的檢測和表達，獲得的Con-InsGl毒蛋白活性未能達到期待的“速效胰島素”的生物活性，導致這種差異的原因可能是___________________________。 10．蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對人體沒有影響。我國科學家欲獲得高效表達蛋白A的轉基因大腸桿菌作為微生物農藥，做了相關研究。 （1）研究者用相同的_________酶處理蛋白A基因和pET質粒，得到重組質粒，再將重組質粒置于經_________處理的大腸桿菌細胞懸液中，獲得轉基因大腸桿菌。 （2）檢測發(fā)現，轉入的蛋白A基因在大腸桿菌細胞中表達效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與蛋白A基因結合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基），并按圖2方式依次進行4次PCR擴增，以得到新的蛋白A基因。 ①這是一種定點的_________技術。 ②圖2所示的4次PCR應該分別如何選擇圖1中所示的引物？請?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“”）。 引物A 引物B 引物C 引物D PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 （3）研究者進一步將含有新蛋白A基因的重組質粒和_________分別導入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質，用_________方法檢測并比較三組受體菌蛋白A的表達產物，判斷新蛋白A基因表達效率是否提高。為檢測表達產物的生物活性，研究者將上述各組表達產物加入到長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，比較_________的大小，以確定表達產物的生物活性大小。 （4）作為微生物農藥，使用時常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產物而不是轉蛋白A基因的大腸桿菌，其優(yōu)點是_________。 11．（2018全國Ⅱ卷）某種熒光蛋白（GFP）在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1-GFP融合基因（簡稱為甲），并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1~E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： （1）據圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是_________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證_______________，也是為了保證__________________。 （2）將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和_________過程。 （3）為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產生綠色熒光細胞的_____________移入牛的____________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 （4）為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的____________（填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”）作為PCR模板。 12．（2018海南卷）甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質。為了改善黃瓜的品質，科學家采用農桿菌轉化法將一種甜蛋白基因成功導入黃瓜細胞，得到了轉基因植株?；卮鹣铝袉栴}： （1）用農桿菌感染時，應優(yōu)先選用黃瓜＿＿＿＿（填“受傷的”或“完好的”）葉片與含重組質粒的農桿菌共培養(yǎng)，選用這種葉片的理由是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 （2）若在轉基因黃瓜中檢測到這種甜蛋白，則表明該重組質粒中＿＿＿＿已轉移到植物細胞中且能夠表達；用該轉基因黃瓜的某一植株與一株非轉基因植株雜交，發(fā)現子代中含甜蛋白個體數與不含甜蛋白個體數之比為1：1，則說明甜蛋白基因已經整合到＿＿＿＿（填“核基因組”“線粒體基因組”或“葉綠體基因組”）中。 （3）假設某種轉基因作物因為受到病毒感染而減產，若要以該轉基因作物為材料獲得脫毒苗，應選用＿＿＿＿作為外植體進行組織培養(yǎng)。 （4）通常，基因工程操作主要有4個步驟，即目的基因獲取、重組表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 1．【答案】D 【解析】目的基因導入植物細胞最常用的方法是農桿菌轉化法，該方法比較經濟有效，還有基因槍法和花粉管通道法，A正確，D錯誤；顯微注射技術是將目的基因導入動物細胞中采用最多的方法，B正確；大腸桿菌細胞最常用的轉化方法是用鈣離子處理細胞，使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，完成轉化過程，C正確。 2．【答案】D 3．【答案】C 【解析】圖示是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖，其中①為質粒，作為運載體；②為重組質粒；③為含有重組質粒的農桿菌；④為含有目的基因的植物細胞；⑤為轉基因植株。①→②利用兩種不同限制酶處理，能避免含抗蟲基因的DNA片段自身環(huán)化，A正確；②→③可用氯化鈣處理農桿菌，使之成為易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)細胞，這樣有助于促進重組Ti質粒轉化到農桿菌細胞中，B正確；③→④用農桿菌侵染植物細胞，重組Ti質粒的T-DNA片段整合到植物細胞的染色體上，C錯誤；④→⑤用植物組織培養(yǎng)技術培養(yǎng)，具有抗蟲性狀的植株產生了可遺傳變異，D正確。 4．【答案】D 【解析】過程①為逆轉錄過程，反應體系中需要加入逆轉錄酶和脫氧核苷酸，A項錯誤；過程②為基因表達載體的構建，需使用限制酶和DNA連接酶，B項錯誤；過程③需要使用CaCl2溶液制備感受態(tài)的大腸桿菌細胞，C項錯誤；鑒定CarE基因是否成功導入受體細胞，可利用PCR技術擴增受體細胞DNA片段，用基因探針進行DNA分子雜交，D項正確。 5．【答案】B 6．【答案】C 【解析】卡那霉素基因是標記基因，只能檢測目的基因是否導入受體細胞，不能檢測目的基因是否表達，①錯誤；為了防止黏性末端任意連接，可將抗蟲基因和質粒均用兩種限制酶進行處理，②正確；卡那霉素抗性基因（kanR）中可能存在限制酶的酶切位點，③正確；生產抗蟲棉的整個過程中除了需要基因工程操作，還需要采用植物組織培養(yǎng)技術將轉基因受體細胞培育成轉基因植株，④錯誤。綜上所述，敘述正確的是②③，故選C。 7．【答案】C 【解析】培育出抗煙草花葉病毒的番茄植株屬于基因工程應用實例，A不符合題意；在大腸桿菌內獲取人的干擾素屬于基因工程應用實例，B不符合題意；利用克隆技術保護珍稀動物屬于克隆技術應用的實例，C符合題意；利用“工程菌”生產乙肝疫苗屬于基因工程應用實例，D不符合題意。 8．【答案】A 【解析】將多個抗凍基因編碼區(qū)相連形成的能表達的新基因可能不再是抗凍基因，所以可能得不到抗凍性增強的抗凍蛋白，A正確；圖中①是獲取目的基因的過程，獲取的目的基因，可用于基因工程，但不能用于比目魚基因組測序，B錯誤；過程①需要的工具酶是DNA聚合酶，C錯誤；利用DNA探針技術檢測目的基因是否導入到受體細胞，利用抗原—抗體雜交技術檢測目的基因是否表達，D錯誤。 9．【答案】（1）終止子 鑒別和篩選含有目的基因的細胞 （2）氨基酸 EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶 （3）感受態(tài) 緩沖液 （4）大腸桿菌中基因表達獲得的蛋白質未加工 【解析】（1）基因表達載體的組成包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子、復制原點幾部分，其中標記基因的作用是鑒別和篩選含有目的基因的細胞。（2）為了獲得目的基因可以通過提取分析Con-InsGl毒蛋白中的氨基酸序列推知毒蛋白基因的核苷酸序列，再用DNA合成儀大量合成目的基因。基因工程中需要DNA連接酶，根據酶的來源不同分為E?coliDNA連接酶和T4DNA連接酶兩類。（3）將人工合成的目的基因導入大腸桿菌體內，一般先用藥物處理大腸桿菌使之成為感受態(tài)細胞，再將重組DNA溶于緩沖液中與該類細胞融合，在一定溫度下促進細胞吸收重組DNA分子完成轉化過程。（4）經過目的基因的檢測和表達，獲得的Con-InsGl毒蛋白活性未能達到期待的“速效胰島素”的生物活性，導致這種差異的原因可能是大腸桿菌屬于原核生物，原核細胞中沒有內質網和高爾基體，因此基因表達獲得的蛋白質未經內質網和高爾基體的加工，不具有生物學活性。 10．【答案】（1）限制酶和DNA連接 CaCl2 （2）基因突變 （3）含有蛋白A基因的重組質粒、空質粒（pET質粒） 抗原—抗體雜交 抑菌圈 （4）對人、畜、農作物和自然環(huán)境安全；不會造成基因污染；有效成分純度較高 【解析】（1）在基因工程中，利用相同的限制酶和DNA連接酶處理蛋白A基因和pET質粒，得到重組質粒；大腸桿菌作為受體細胞，需要用氯化鈣處理，以便重組質粒的導入。（2）①根據題意和圖示分析，經過4次PCR技術后獲得了新的基因，這是一種定點的基因突變技術。②研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與蛋白A基因結合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個堿基），因此4次PCR應該分別選擇如圖所示的引物： 。 11．【答案】（1）E1和E4 甲的完整 甲與載體正確連接 （2）轉錄 翻譯 （3）細胞核 去核卵母細胞 （4）核DNA 12．【答案】（1）受傷的 葉片傷口處的細胞釋放出大量酚類物質，可吸引農桿菌移向這些細胞 （2）甜蛋白基因 核基因組 （3）莖尖 （4）按照人們的愿望進行設計，并通過體外重組和轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型 【解析】（1）用農桿菌感染時，應優(yōu)先選用黃瓜受傷的葉片與含重組質粒的農桿菌共培養(yǎng)，理由是葉片傷口處的細胞釋放出大量酚類物質，可吸引農桿菌移向這些細胞。（2）若在轉基因黃瓜中檢測到這種甜蛋白，則表明該重組質粒中甜蛋白基因已轉移到植物細胞中且能夠表達；用該轉基因黃瓜的某一植株與一株非轉基因植株雜交，發(fā)現子代中含甜蛋白個體數與不含甜蛋白個體數之比為1：1，則說明甜蛋白基因已經整合到核基因組中。（3）假設某種轉基因作物因為受到病毒感染而減產，若要以該轉基因作物為材料獲得脫毒苗，應選用莖尖作為外植體進行組織培養(yǎng)。（4）通常，基因工程操作主要有4個步驟，即目的基因獲取、重組表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為按照人們的愿望進行設計，并通過體外重組和轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型。