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1、中草藥添加對靈芝液態(tài)培養(yǎng)生理活性成分生成之影響 研究生：方凱平 指導(dǎo)老師：楊芳鏘 摘要--靈芝是中國人自古以來珍貴的要用真菌，靈芝多醣及三萜類化合物，可經(jīng)由口服來提昇免疫機能，達(dá)成間接破壞癌細(xì)胞的作用。本研究主要目的在使用中草藥內(nèi)含有的有效成分來進行靈芝的液態(tài)培養(yǎng)，並尋找適當(dāng)?shù)闹胁菟幏N類以及最適當(dāng)?shù)奶砑恿俊Ｓ山Y(jié)果顯示，添加花椒濃縮液和薑黃濃縮液的效果較好。在菌重方面，花椒濃縮液培養(yǎng)十五天達(dá)到8.19 g/L，為對照組的1.20倍；多醣方面，花椒濃縮液培養(yǎng)第六天達(dá)到3.2 g/L，為對照組的1.6倍；靈芝酸方面，薑黃濃縮液培養(yǎng)在第十五天達(dá)到14.33 (mg/g D.W.)，為對照組的

2、2.67倍；總多酚方面，薑黃濃縮液培養(yǎng)在第六天達(dá)到56.32(mg/g D.W.)，為對照組的2.74倍；類黃酮方面，在第十二天達(dá)到4.59(mg/g D.W.) ，為對照組的3.08倍。希望研究結(jié)果可供日後靈芝生理活性成分產(chǎn)量提升之參考。 關(guān)鍵字:靈芝、中草藥、三萜類 一、緒論 1-1 前言 自古以來，靈芝為珍貴的食藥用真菌，其主要原因是靈芝含有多種具有生物活性與療效的物質(zhì)，如多醣體、三萜類、超氧歧化酶、生物鹼以及蛋白質(zhì)等。許多藥物學(xué)方面的研究顯示出，靈芝多樣的萃取物具有保肝、降血脂、降血壓、提升免疫系統(tǒng)、抗過氧化和抗癌的功能，用治咳嗽、支氣管炎、關(guān)節(jié)炎等(林，19

3、90)。 靈芝代謝產(chǎn)物可能與中草藥的有效成分產(chǎn)生複方，如靈芝在添加中草藥的培養(yǎng)液中可能會加速或增加萜類的生成，使靈芝原有的效用得到增強的效果。 1-2 研究動機 萜類、多醣、及類黃酮具有多種生物活性，抗癌性、抗發(fā)炎效應(yīng)、抗腫瘤活性。由於靈芝子實體的培養(yǎng)一般 , 需要2~3個月，從開始到採收相當(dāng)費時，且野生靈芝不易取得，所以發(fā)展出類似以液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)多醣體、三萜類。本實驗主要目的為：利用中草藥具有的萜類、多醣、及類黃酮化合物，進行靈芝液態(tài)深層培養(yǎng)。已探討添加中草藥是否能促使靈芝之生理活性含量提升。 二、文獻(xiàn)回顧 2-1 靈芝生理活性成分 靈芝有許多的生理活性成份，主要是以大

4、分子的多醣體（polysaccharides）及小分子的三萜類化合物（triterpenoids）和固醇類(steroids)為主。 2-1-2 多醣體（polysaccharides） 多醣體在許多藥用菇類的研究上一直是一個很重要的主題，現(xiàn)已有許多研究發(fā)現(xiàn)菇類純化的多醣體具有抗腫瘤作用，且均具有β-D-葡聚醣的結(jié)構(gòu)。而靈芝所含β-D-葡聚醣抗癌活性之強弱與水溶性、分子量大小、支鏈分支度、形狀、與主鍵結(jié)合方式β-1,3鍵結(jié)或β-1,6鍵結(jié)以及結(jié)合之蛋白質(zhì)與脂質(zhì)等均有關(guān)。以X-ray繞射分析得知，這種以β-1,3鍵結(jié)的D-葡聚醣骨架呈現(xiàn)3股右旋之螺旋結(jié)構(gòu)，可能是引發(fā)抗腫瘤作用的重要原

5、因(水野卓等, 1997)。 2-1-3 三萜類（triterpenoids） 萜類(Terpene)化合物是由碳?xì)浠衔锘蛑|(zhì)代謝而產(chǎn)生，以異戊二烯為單體之化合物，分子組成通式(C5H8)n。普遍存在於植物界的一類化合物，在動物界為數(shù)甚少，萜類的主要分類法是根據(jù)分子中包含異戊二烯單體數(shù)目分類，將含有兩個異戊二烯叫做單萜(monoterpene)；含有三個異戊二烯單體叫做倍半萜(sesquiterpene)；含有四個異戊二烯單體叫做雙萜(dieterpene)；含有五個異戊二烯單體叫做二倍半萜(sesterpene)；而含有六個異戊二烯單體則叫做三萜(triterpene)(肖崇厚

6、, 1989)。 2-2 中草藥介紹 選用的五種中草藥，有八角、黃耆、薑黃、花椒、肉桂，八角含有豐富的莽草酸(shikimic acid)，薑黃含有豐富的類黃酮(Flavonoids)，黃耆含有豐富的多醣(polysaccharides)，花椒和肉桂含有豐富的單萜類(monoterpenes)，我們期望得到的產(chǎn)物是三萜(triterpenes)，我們試圖增加莽草酸(shikimic acid)、類黃酮(Flavonoids)、多醣(polysaccharides)、單萜類(monoterpenes)的濃度，期望反應(yīng)能往三萜的方向進行，進而提高三萜的含量 三、材料與方法 3-

7、1 實驗菌株與細(xì)胞 本實驗所採用之菌株為靈芝屬之赤靈芝Ganoderma lucidum (BCRC36123)，係購自新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，菌株以生物資源中心所建議之PDA做為斜面培養(yǎng)基，接菌完畢後於30℃培養(yǎng)箱生長，之後置於4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，?個月更新一次。 3-2水萃液製備 將秤重50 g的基質(zhì)(八角、黃耆、薑黃、花椒、肉桂)加入1 L的水，煮沸3個小時，用100 mesh篩網(wǎng)過濾後，以真空濃縮器於60℃下減壓濃縮為10倍之中草藥水萃液，取出濃縮液於4℃冷藏備用。 3-3 三角瓶液態(tài)培養(yǎng)試驗 此試驗之主要目的，為探討不同培養(yǎng)天數(shù)，及添加中草藥水

8、萃液對靈芝有效成分生成之影響。培養(yǎng)條件為，使用250 ml三角瓶，其總操作體積為100 ml，培養(yǎng)溫度為30℃。試驗方法，配置98 ml液態(tài)培養(yǎng)基，並利用0.1 N HCl 和0.1 N NaOH，將液態(tài)培養(yǎng)基之pH調(diào)整為4，倒入250 ml三角瓶中，添加中草藥水萃液2 ml，使總體積達(dá)到100 ml，用矽膠塞將錐形瓶口塞緊，至直立式滅菌釜在120℃滅菌20分鐘後，放置於無菌操作臺，冷卻至室溫。之後，把三角瓶前培養(yǎng)的種菌，利用滅過菌的均質(zhì)機(polytron)攪碎菌絲球10秒後，取5 ml的接菌量接種於250 ml三角瓶中，於100 rpm、30℃迴轉(zhuǎn)式恆溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄pH、菌體濃度、葡

9、萄糖濃度。 3-4 濃度變化實驗 添加花椒、薑黃濃縮液於第12天時，菌絲濃度、胞內(nèi)外多醣、靈芝酸、總多酚、類黃酮皆有很好的效果。故選用花椒、薑黃濃縮液當(dāng)添加劑，分別在靈芝基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的水萃液，以未添加任何水萃液為對照組，其他則以添加1 ml、2 ml、4 ml、8 ml、10 ml的水萃液為實驗組，搖瓶總體積為100 ml，而此實驗的目的在探討添加量不同則對靈芝生長、生理活性之影響。 3-5 不同時機添加中草藥實驗 添加肉桂濃縮液的靈芝菌絲體在前6天都沒有生長，一直到了第9天開始才開始生長，主要是想探討如果先讓菌絲生長到一定程度，再加入誘導(dǎo)劑，是否會提高靈芝酸及多醣

10、的產(chǎn)量。 四、結(jié)果與討論 4-1 靈芝三角瓶液態(tài)培養(yǎng)試驗 4-1-1中草藥水萃液添加對靈芝液態(tài)發(fā)酵之生理活性影響 圖4-1 中草藥水萃液添加培養(yǎng)之生理活性 由圖4-1，花椒和薑黃對於靈芝液態(tài)培養(yǎng)菌絲體的生理活性成分優(yōu)於八角、黃耆、肉桂。添加2ml花椒濃縮液培養(yǎng)15天之菌重達(dá)到8.19 (g/L)，相對於控制組培養(yǎng)第12天菌重為6.44(g/L)，添加效果增加1.27倍；但是胞內(nèi)多醣的部分，最高是控制組培養(yǎng)第9天的283.15 mg/g D.W.，比5種中草藥添加都要來的高；在靈芝酸含量、總多酚含量、類黃酮含量部份、都是以添加2ml薑黃濃縮液效果最好

11、，分別是第15天的14.33 mg/g D.W.、第6天的56.32 mg/g D.W.以及第12天的4.59 mg/g D.W.，相對於控制組靈芝酸含量、總多酚含量、類黃酮含量，分別為第12天的5.40 mg/g D.W.、第9天的23.75 mg/g D.W.以及第6天的1.57 mg/g D.W.，添加效果分別提高了2.65倍、2.37倍與2.92倍。故選用花椒與薑化進行添加量變化的實驗。 4-1-2 添加水萃液之添加量影響

12、圖4-2添加不同濃度花椒、薑黃萃取液靈芝培養(yǎng)基本生理活性與三萜含量圖。 添加的含量越多則菌體重量以及生理活性並未達(dá)到最好的效果；添加4ml花椒濃縮液之菌體重量為最高，添加8 ml及添加10 ml花椒濃縮液之葡萄糖幾乎沒有消耗，故菌體重量相對較低。 添加的含量越多則菌體重量以及生理活性並未達(dá)到最好的效果；添加1 ml薑黃濃縮液之菌體重量為最高，添加8 ml及添加10 ml薑黃濃縮液之葡萄糖幾乎沒有消耗，故菌體重量相對較低；結(jié)果顯示，胞外多醣含量隨著濃度上升，以添加8 ml薑黃濃縮液為最高，達(dá)到3.02 g/L，隨著濃縮液濃度上升到10 ml，胞外多醣含量又下降至1.67 g/L。

13、 4-1-3不同時機添加中草藥實驗 靈芝在第3天添加2 ml肉桂濃縮液，菌體重量在第15天達(dá)到最大值，達(dá)到7.84 g/L，第6天、9天、12天添加2 ml肉桂濃縮液之菌體重量則逐漸降低，此結(jié)果與第0天就添加肉桂濃縮液，菌絲重量有顯著的提升。推測肉桂仍會抑制靈芝菌絲的生長，因為葡萄糖的殘量仍很高，菌絲都沒消耗到葡萄糖。胞內(nèi)多醣含量方面，第0天添加肉桂濃縮液到第3天添加肉桂濃縮液呈現(xiàn)上升的趨勢，第3天添加達(dá)到最高值164.85 mg/g D.W.，第6天、第9天、第12天添加又逐漸下降；靈芝酸含量方面，由圖4-30顯示，第3天添加至第12天添加為逐漸上升

14、，第12天達(dá)到最高為9.53 mg/g D.W.；總多酚方面，由圖4-35顯示，第0天添加逐漸上升至第9天添加，第9天添加達(dá)到最高，為27.06 mg/g D.W.，第12天添加又下降至10.62 mg/g D.W.；類黃酮方面，由圖4-36顯示，逐漸上升至第6天添加達(dá)到最高，類黃酮含量為0.41 mg/g D.W.。 五、結(jié)論與未來展望 本研究主要探討添加不同中草藥添加對靈芝液態(tài)培養(yǎng)之發(fā)酵產(chǎn)物與菌絲體萃取物對靈芝生理活性成分之影響。 發(fā)現(xiàn)花椒和薑黃對於靈芝液態(tài)培養(yǎng)菌絲體的生理活性成分優(yōu)於八角、黃耆、肉桂。添加2ml花椒濃縮液培養(yǎng)15天之菌重達(dá)到8.19 (g/L)，相對於控

15、制組培養(yǎng)第12天菌重為6.44(g/L)，添加效果增加1.27倍；但是胞內(nèi)多醣的部分，最高是控制組培養(yǎng)第9天的283.15 mg/g D.W.；在靈芝酸含量、總多酚含量、類黃酮含量部份、都是以添加2ml薑黃濃縮液效果最好，分別是第15天的14.33 mg/g D.W.、第6天的56.32 mg/g D.W.以及第12天的4.59 mg/g D.W.，相對於控制組，分別為第12天的5.40 mg/g D.W.、第9天的23.75 mg/g D.W.以及第6天的1.57 mg/g D.W.，添加效果分別提高了2.65倍、2.37倍與2.92倍。 添加8ml以上之中草藥，不管是花椒還是薑黃

16、，對於靈芝的生長都產(chǎn)生抑制的效果。在花椒添加量變化的部份，添加1 ml、2 ml、4 ml的菌重，以添加4ml之薑黃濃縮液為最高，達(dá)到5.73 (g/L)，不過三者與控制組並沒有太大的落差。但添加量增加並不會使多醣成分增加；靈芝酸與總多酚的部份，隨著添加量增加到4 ml，含量依序上升，8 ml與10 ml添加，因為抑制了菌絲的生長。在薑黃添加量變化的部份，低量的添加反而刺激菌絲的生長，添加1 ml薑黃濃縮液菌重達(dá)到4.96 (g/L)，添加2 ml以及4 ml依序下降，8 ml及10 ml的添加跟花椒一樣，完全抑制了菌絲的生長；胞內(nèi)多醣的部分，以添加4 ml為最高，但仍低於控制組；靈芝酸與總多

17、酚都以添加2 ml為最高。 肉桂濃縮液添加時機改變的實驗中，靈芝在第3天添加2 ml肉桂濃縮液，菌重在第15天達(dá)到最大值，達(dá)到7.84 g/L，第6天、9天、12天添加2 ml肉桂濃縮液之菌重則逐漸降低，推測肉桂仍會抑制靈芝菌絲的生長，因為葡萄糖的殘量仍很高；胞內(nèi)多醣含量方面，第3天添加肉桂濃縮液在第15天取樣達(dá)到最高值164.85 mg/g D.W.，比第0天添加，在第15天取樣的56.73 mg/g D.W.，高出了約3倍；靈芝酸含量在第12天添加肉桂濃縮液在第15天取樣達(dá)到最高值9.53 mg/g D.W.，比第0天添加，在第15天取樣的3.71 mg/g D.W.，高出了2.57倍。

18、由以上結(jié)果得知，先讓菌絲生長之後再加入肉桂濃縮液，的確有助於靈芝生理活性的提升。 未來展望 本實驗所用之萃取劑只有水，往後可以探討以其他有機溶劑進行萃取，是否能提高靈芝之生理活性，例如八角含有多量的Shikimic acid，但文獻(xiàn)指出Shikimic acid需用醇類才能將其萃取出。而本研究大部份針對靈芝酸含量提升，則對萃取劑、添加時間點、抗氧化活性或其他活性並沒有做深入的探討，同時必須探討中草藥中何種成份影響靈芝生理活性，本研究對於中草藥的成分並沒有做深入的分析，以上幾點可供往後繼續(xù)研究之參考。 參考文獻(xiàn) 水野卓、合川正允(賴慶亮譯)(1997)。菇類的化學(xué)、生化學(xué)

19、。國立編譯館。409。 方瑋(2011)。培養(yǎng)基添加物對靈芝菌絲體活性成分生成之影響。東海大學(xué)化學(xué)工程研究所博士論文。 林俊清 (1990)。生藥的解說-靈芝的介紹。藥學(xué)雜誌，6，104-111。 Zhu LW., Zhong JJ , Tang YJ.(2008). Significance of fungal elicitors on the production of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides by the submerged culture of medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Process Biochemistry ,43,1359–1370.