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1、題目：培養(yǎng)條件對毛黴Mucor rouxii.生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸之影響 研究生：沈鳳堯 指導(dǎo)教授：楊芳鏘 摘要 本研究探討不同培養(yǎng)環(huán)境對Mucor rouxii BCRC 30546多元不飽和脂肪酸生成之影響。主要考量因素包括：培養(yǎng)時間、溫度、溶氧量、培養(yǎng)基組成、油類的添加、剪切力及外接式均質(zhì)機(jī)（Polytrron）等。 結(jié)果顯示：在三角瓶中，最佳培養(yǎng)條件為：碳源30 g/L、氮源5 g/L、pH 5.5、溫度30℃，其菌體濃度（5.608 g/L）、GLA濃度（0.086 g/L）、細(xì)胞油脂含量（21.6％）與總油脂（1.323 g/L）。培養(yǎng)

2、基中碳氮比的高低、添加的葵花油濃度及在不同的溶氧程度操作條件下，皆會造成菌體生長及代謝的明顯差異。在5 L發(fā)酵槽中，轉(zhuǎn)速500 rpm、通氣量1 vvm操作下，兩階段控溫造成菌體濃度減少，使得GLA濃度下降，但在菌體生產(chǎn)GLA的能力上卻能提高42％，推測可能在低溫時，菌體為了要適應(yīng)其環(huán)境，而增加PUFAs之生成。而在饋料批式操作下則提高12.5％細(xì)胞油脂含量，並且維持菌體濃度在8 g/L左右，且油脂穩(wěn)定累積。將兩階段控溫與饋料批式同時進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)不但可以有效增加菌體生產(chǎn)GLA的能力，提高了67％，並且最大GLA濃度則從0.285 g/L增加到了0.443 g/L ，約有55％的提昇。此外，將轉(zhuǎn)速

3、由500 rpm降低至300 rpm，利用兩階段控溫與饋料批式操作再加上外接式均質(zhì)機(jī)，則可以在低轉(zhuǎn)速下，有效阻止菌絲體的聚集，最大菌體濃度由原本的7.65 g/L增加至9.11 g/L，增加了19％，且在脂肪酸生合成以及油脂累積方面，也有明顯的提升效果。 一、 緒論 1-1 前言 多元不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid, PUFAs)，對於人體生理功能有很大的益處，例如：γ-次亞麻油酸（γ-Linolenic Acid，GLA）是人體母乳中所含的多元不飽和脂肪酸，具有緩和過敏性皮膚炎、改善生理痛、緩和痛風(fēng)等功效，是嬰兒攝取多元不飽和脂肪酸的主要來源，一般如

4、要取得大量油脂的方法大多由植物或動物組織所萃取。一般植物油，如紅花油、葵花油、大豆油..等含有豐富的ω-6系脂肪酸；動物油方面，一般家禽、家畜所含的油脂多為飽和脂肪酸，長期食用容易發(fā)生心血管疾病。深海魚類之魚油及脂質(zhì)中，則含有豐富的ω-3系多元不飽和脂肪酸，不會使血液中之膽固醇及三酸甘油脂增加，不易使血管阻塞，並且還有抗血栓之形成及降低三酸甘油脂的作用，可以預(yù)防與治療人類心血管與免疫系統(tǒng)方面之疾病。 ω-6系多元不飽和脂肪酸之GLA為例，傳統(tǒng)來源為月見種子萃取油，琉璃苣種子萃取油以及黑醋栗種子萃取油。這些富含GLA的植物籽油，在美國大約有一年2000噸、每公斤市價(jià)100美金之市場[1

5、]。 二、文獻(xiàn)回顧 2-1多元不飽和脂肪酸簡介 脂質(zhì)主要是由脂肪酸（fatty acids）與甘油（glycerol）所組成，其中脂肪酸是存在於生物體內(nèi)之生物生合成物質(zhì)。脂肪酸為3~25 碳原子以單鍵或雙鍵相連而成的碳?xì)浠衔?，由碳、氫、氧三元素所組成，一端為甲基(-CH3)，另一端為羧基(-COOH)，原子之間以共價(jià)鍵串聯(lián)，中間的碳原子上都連接有兩個氫原子。天然脂肪酸為偶數(shù)碳，依其碳鏈?zhǔn)欠窈须p鍵，可區(qū)分成飽和脂肪酸、元不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸的雙鍵大多以順式（cis-configuration）存在。含有兩個以上雙鍵之不飽和脂肪酸稱為多元不飽和脂肪酸(Polyunsatur

6、ated Fatty Acid, PUFAs)，其命名方式可簡寫成CX：YnZ，X代表碳源子的多寡、Y為雙鍵數(shù)，nZ則是甲基端算起的第一個雙鍵位置[1]。以γ-次亞麻油酸為例，C18：3n6，即有18個碳、三個雙鍵，由結(jié)構(gòu)得知雙鍵位置是從甲基端算起第六、第九及第十二個碳上。（圖1）為脂肪酸之分類。 2-2多元不飽和脂肪酸之微生物來源 傳統(tǒng)上大量的多元不飽和脂肪酸之取得方法多由動物組織或植物之果實(shí)種子所萃取。植物部分如紅花油、葵花油、大豆油、玉米油以及上述的月見草籽油、琉璃苣子油等。動物方面如深海魚類之魚油以及脂質(zhì)中，則含有豐富的ω-3系多元不飽和脂肪酸，如EPA與DHA。但這只是因?yàn)?/p>

7、累積食物鏈中微生物的油脂於體內(nèi)（海洋微藻->浮游生物->魚類），魚類本身並沒有合成多元不飽和脂肪酸之能力[1]。所以微藻類、細(xì)菌、黴菌和真菌等微生物，才是合成多元不飽和脂肪酸的主要來源。 2-3多元不飽和脂肪酸之合成途徑 微生物體內(nèi)鏈增長與所有生物體脂肪酸增長路徑相同，以乙醯輔酶A或乙醯磷脂質(zhì)(acyl-phopspholipid)為起始，然後經(jīng)去飽和脂肪酵素作用，分成ω-3、ω-6、ω-9三系列之脂肪酸生成路徑，因此原核細(xì)胞以及某些細(xì)菌的多元不飽和脂肪酸生合成之有氧路徑，是由飽和脂肪酸經(jīng)⊿9去飽和酵素作用為起始，由此可之微生物是以油酸(C18：1 cis 9)為起始，於⊿12去飽和

8、成亞麻油酸(C18：2)，在以⊿15去飽和生成α-次亞麻油酸( C18：3)，此三種脂肪酸即為ω-9、ω-6以及ω-3系列脂肪酸的先驅(qū)物質(zhì)，而多元不飽和脂肪酸的生合成分別是從此三種先驅(qū)物之⊿6位置去飽和及延長，再一次於⊿5位置去飽和及增長，分別產(chǎn)生C20和C22的多元不飽和脂肪酸如（圖2）。 2-4影響油脂性真菌產(chǎn)油量之因素 環(huán)境因素影響包括了物理（溫度、機(jī)械剪切力、pH），或化學(xué)因子（培養(yǎng)基組成）。 （1）培養(yǎng)時間： 隨著培養(yǎng)時期的進(jìn)行，油脂性微生物合成脂質(zhì)可分為兩階段：第一階段，細(xì)胞生長期（Growth Phase），此時營養(yǎng)充分，微生物的菌體量與油脂同時增加中；第兩階

9、段為脂肪合成期（Production Phase），若碳源仍充足但其他養(yǎng)分耗盡，脂肪酸持續(xù)累積於菌體內(nèi)；若碳源與其他養(yǎng)分皆耗盡時，某些微生物會自行分解內(nèi)脂質(zhì)作為碳源來使用[2]。 （2）培養(yǎng)基組成 影響微生物生長最重要的因素莫過於培養(yǎng)基的組成，特別是基質(zhì)組成裡比重很大的碳源與氮源，其影響微生物生理狀態(tài)的程度更加直接。碳源與氮源是微生物合成細(xì)胞時所需要的成分，但在碳源足夠而氮源欠缺的情況下，微生物不在增殖，而是將所吸收的碳源轉(zhuǎn)變成脂質(zhì)。 (3）pH 培養(yǎng)基的酸鹼度往往直接了培養(yǎng)基裡養(yǎng)分的溶解度以及對微生物的質(zhì)傳，甚至影響與生長有關(guān)的酵素反應(yīng)。在菌相型態(tài)上，在不同的pH値培養(yǎng)下會有

10、不同的菌體型態(tài)，是由於pH値影響了真菌細(xì)胞壁對機(jī)械應(yīng)力的抵抗力。 （4）溫度 許多研究皆發(fā)現(xiàn)在低溫時，微生物具有較高的之ω-3系列不飽和脂肪酸之生產(chǎn)能力。推測是在低溫環(huán)境下，微生物為了要適應(yīng)低溫，而增加多元不飽和脂肪酸之生成。文獻(xiàn)指出在低溫時有較多氧溶於培養(yǎng)基中，而氧氣是脂肪酸進(jìn)行去飽和酵素作用時所必需，故可能是溫度的不同造成溶氧不同而影響菌體生長以及代謝。 （5）震盪速率 震盪培養(yǎng)提供了菌體與養(yǎng)分與較佳氧氣的質(zhì)傳效果。當(dāng)震盪速率過慢時，除了菌體與培養(yǎng)基間的接觸變的不均勻之外，液面與空氣接觸的面積變小，而造成溶氧不足導(dǎo)致去飽和與鏈延長酵素作用能力下降；過快，所生的剪應(yīng)力（Shear S

11、tress）對菌體生長的有一定的傷害。 （6）油類與酒精的添加 油類的添加不但可以增加油脂的累積並且可以從碳鏈的長度以及添加油脂結(jié)構(gòu)的改變知道累積的油脂組成.有文獻(xiàn)指出在培養(yǎng)基中，細(xì)胞外的油脂會造成絲狀真菌在生合成脂肪酸時，油脂會在液面或菌體表面形成油膜，改變培養(yǎng)基質(zhì)、氧傳效果以及菌體間營養(yǎng)物質(zhì)傳遞，間接改變菌體吸收以及代謝能力，而使得去飽和以及延長作用受到抑制，但是由於加入的油脂中會含特定的脂肪酸，因此可以扮演基質(zhì)或前驅(qū)物來合成新的脂肪酸，可由此達(dá)到可以有商業(yè)價(jià)值的脂肪酸進(jìn)行生產(chǎn)[3]。 三、實(shí)驗(yàn)材料與分析方法 3-1 菌株 本研究菌株來源為新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所之生物資源

12、保存暨研究中心的Mucor rouxii BCRC No.30546。 前培養(yǎng)之液態(tài)培養(yǎng)基組成 以Lindberg(1991)[4]最佳化之培養(yǎng)基質(zhì)組成作為前培養(yǎng)基質(zhì)。 主培養(yǎng)之液態(tài)培養(yǎng)基組成 本研究以(2005,宋)[5]中的培養(yǎng)基組成作為主培養(yǎng)基。 3-2實(shí)驗(yàn)分析方法 菌體濃度 菌體分析方法如下： （1） 當(dāng)菌體培養(yǎng)至收成時間，取100 mL菌液並抽氣過濾之。 （2） 沖洗過濾菌體若干次再濾乾。 （3） 將菌體從濾紙刮下並放置於玻璃取樣瓶中，隨後於-20℃下冰凍之。 （4） 於取樣瓶口中用鋁箔紙密封並戳數(shù)洞，於-110℃、＜100 mmHg下冷凍乾燥24 hr。 （

13、5） 取出冷凍乾燥之菌體秤重紀(jì)錄之，並經(jīng)由換算可得菌體濃度。 脂質(zhì)萃取與水解 稱取0.1克之菌體重，使用均質(zhì)機(jī)以15000 rpm打碎2分鐘，再加入8 mL之15％（w/v）氫氧化鉀酒精溶液置於一密封玻璃瓶中於70℃水浴中水解2小時後，利用濃鹽酸將pH調(diào)至3以下，再用正己烷8 mL連續(xù)萃取兩次，每一次均震盪1分鐘，合併後取出正己烷層，置於70℃烘箱中24小時，測油脂重。 脂肪酸甲酯之製備 樣品處理步驟如下： （1）細(xì)胞破碎：秤取0.1克之細(xì)胞乾重並加入KOH / MeOH溶液、以細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)胞，儘可能的不要有糾結(jié)成團(tuán)的菌體存在，以免造成實(shí)驗(yàn)上分析誤差。 （2）皂化：將以

14、破碎的KOH / MeOH菌液，於60℃密閉狀態(tài)下水浴30分鐘進(jìn)行皂化反應(yīng)。本反應(yīng)為鹼催化製程，生成脂肪酸鉀。 （3）甲酯化：將前述皂化後的產(chǎn)物冷卻至室溫，加入HCl / MeOH以及BF3 / MeOH 作為催化劑。於60℃水浴30分鐘形成脂肪酸甲酯，反應(yīng)冷卻後加入飽和NaCl 溶液均勻混合，以避免乳化。再添加正己烷（n-Hexane）以萃取脂肪酸甲酯再以GC分析。 第四章 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 4-1三角瓶實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)時間之影響 如圖3所示，在4天以前為生長期，其菌體濃度與油脂隨時間進(jìn)行而累積，到第四天時其碳源已經(jīng)消耗完了，而此時的菌體濃度（5.608 0.244 g/L）、G

15、LA濃度（0.086 0.0025 g/L）、細(xì)胞油脂含量（21.6 2.35％）與總油脂（1.323 0.111 g/L）則到達(dá)到最高點(diǎn)，第四天後，推測由於沒有碳源可以提供微生物生長以及代謝，菌體便會自我分解細(xì)胞體內(nèi)儲存的油脂來當(dāng)作碳源使用，而菌體的自我分解導(dǎo)致細(xì)胞油脂含量、GLA濃度與總油脂的減少。 碳氮比之影響 由圖4可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)我們將菌體培養(yǎng)至一定濃度時，再置入於新的培養(yǎng)基中，而當(dāng)新的培養(yǎng)基中沒有任何氮源時，其細(xì)胞油脂含量為最高，但是因?yàn)槿狈Φ?，使得菌體無法再次生長，因此菌體濃度為最低，也造成總油脂無法再往上提升；當(dāng)在有添加氮源時，無論氮源濃度的多寡，其細(xì)胞油脂含量，

16、皆低於不加氮源的條件。 添加Sunflower oil之影響 由圖5所示，當(dāng)添加10 g/L的葵花油時達(dá)到最大值，GLA濃度從沒有添加時的0.086 g/L提升到0.095 g/L，提高了將近10％，但是無論添加多少濃度的油類，對菌體的生成以及油脂的累積則有不利的影響，推測由於添加油類會在液面或菌體表面形成油膜，改變培養(yǎng)基質(zhì)、造成氧傳效果變差以及菌體間營養(yǎng)物質(zhì)傳遞困難，改變了菌體吸收以及代謝能力。並且因?yàn)閬喡橛退崾谴蝸喡橛退岬那膀?qū)物，因此有刺激次亞麻油酸（GLA）的生成效果，但是當(dāng)濃度過高則不利於GLA之生產(chǎn)。 4-2 5 L發(fā)酵槽 兩階段控溫 由圖6可知，第48小時將溫

17、度降低至20℃後，明顯的發(fā)現(xiàn)菌體濃度開始減少，造成GLA濃度、總油脂的下降，值得注意的是，當(dāng)將溫度從30℃降到20℃時，DO值也從100％降到80％左右，推測可能是微生物為要適應(yīng)低溫的環(huán)境下，在生產(chǎn)大量多元不飽合脂肪酸的同時，對氧的需求量增加了。 饋料批式 由圖7可知，第48小時加入320 g/L 的葡萄糖250 mL 觀察發(fā)現(xiàn)，其菌體濃度均維持在8 g/L左右，雖然此時菌體已不再繼續(xù)生長，但是加入的碳源則可以有效的抑制菌體自我分解的情況發(fā)生，也因?yàn)槿绱?，使得總油脂也穩(wěn)定維持在4 g/L上下，而DO溶氧的下降在此實(shí)驗(yàn)中並沒有發(fā)生。 兩階段控溫並搭配饋料批式 有鑒於兩階段控溫

18、以及饋料批式之實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中降低溫度，可以增加菌體生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸的能力，但是此時的菌體濃度會因此而減少，導(dǎo)致GLA濃度與總油脂的減少；而在培養(yǎng)過程中加入碳源，則可以減少細(xì)胞因?yàn)樘荚吹牟蛔?，而發(fā)生自我分解的現(xiàn)象，因此將兩者同時操作將可能有利於脂肪酸合成以及油脂累積。 如圖8發(fā)現(xiàn)在48小時將溫度改變以及添加碳源之後，其菌體濃度依然會呈現(xiàn)減少的趨勢，有別於單純只是改變溫度時之條件，此時菌體減少的速率較慢，這說明了溫度對於菌體濃度的影響大於碳源的影響。 polytron 間歇式均質(zhì) 如圖9所示，雖然有外接polytron，但在48小時後，降溫所產(chǎn)生的影響以及饋料批式

19、的效果一樣存在，且在轉(zhuǎn)速300 rpm時，利用polytron間歇式均質(zhì)，就不會有菌體聚集的情形發(fā)生，且最大菌體濃度達(dá)到9.11 g/L。 將不同的操作方式做一個比較如表1，當(dāng)我們在培養(yǎng)過程採用兩階段控溫，發(fā)現(xiàn)菌體生產(chǎn)GLA的能力增加了，對於恆溫以及饋料批式條件下分別增加了42％與47％，說明了溫度對產(chǎn)GLA的影響；而對於油脂的累積，發(fā)現(xiàn)添加的碳源的確是可以增加細(xì)胞的油脂含量，對於恆溫以及兩階段控溫條件下則分別增加了12.5％以及17％，說明碳源影響到細(xì)胞油脂的累積；而將兩階段控溫搭配饋料批式之方法則可以將GLA濃度提升，從恆溫條件下的0.285 g/L到0.443 g/L提高了將近

20、55％，且又不會造成油脂累積的減少；而在300 rpm轉(zhuǎn)速下，外接polytron間歇式均質(zhì)，可以使最大菌體濃度由原本的7.65 g/L增加至9.11 g/L，增加了19％，且在脂肪酸生合成以及油脂累積方面，也有明顯的提升效果。 第五章、結(jié)論以及未來展望 5-1 結(jié)論 　　Mucor rouxii生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸時，需要氧分子進(jìn)行去飽和作用，因此培養(yǎng)中如何讓菌體有充足的溶氧，是影響多元不飽和脂肪酸濃度高低以及組成的重要關(guān)鍵。在三角瓶實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)：適當(dāng)?shù)奶荚磁c限制的氮源濃度，是菌體生長以及油脂累積的關(guān)鍵，除此之外，發(fā)現(xiàn)溫度、碳氮比、震盪速率以及培養(yǎng)體積，亦會影響菌體濃度，還會造成培養(yǎng)液

21、裡溶氧程度的不同，而影響菌體在合成多元不飽和脂肪酸時的能力，而添加油類則可以有效的促進(jìn)GLA的生成。當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)中如果有溶氧不足、碳源缺乏或者碳源濃度過高等情形時，菌絲的尾端就會有大量的分節(jié)孢子出現(xiàn)，當(dāng)有這種現(xiàn)象發(fā)生時，皆不利於菌體生長、脂肪酸生合成以及油脂的累積。 5 L發(fā)酵槽實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通氣量的大小、溶氧值差異以及轉(zhuǎn)速高低不同，影響菌體濃度、不飽和脂肪酸、油脂累積的情形更明顯；兩階段控溫雖然會提高菌體生產(chǎn)GLA的能力但卻不利於菌體濃度；饋料批式則可以有效的抑制菌體的自我分解情況發(fā)生；而將兩者結(jié)合，則發(fā)現(xiàn)菌體濃度依然會受到溫度的影響，但添加的碳源則可減緩菌體濃度下降的速度，而細(xì)胞油脂

22、含量並沒有如預(yù)期的增加，但菌體生產(chǎn)GLA的能力則明顯增加，而且GLA濃度則從0.285 g/L增加到了0.443 g/L；外接式的polytron的確可以有效的降低菌體的聚集，對於脂肪酸生合成以及油脂累積皆有明顯的幫助，但是polytron的效果取決於均質(zhì)頻率，因?yàn)闀r間的長短以及轉(zhuǎn)速的高低，皆會對菌體生長及代謝造成不同程度的影響。 5-2未來展望 1. 以農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，例如：米糠、麥麩、馬鈴薯皮等，亦可生產(chǎn)多元不飽和脂肪酸，利用農(nóng)產(chǎn)廢棄物不僅可減少環(huán)境污染，也可以降低發(fā)酵成本，是種符合經(jīng)濟(jì)效益的生產(chǎn)方式。 2. 均質(zhì)機(jī)（polytron）在發(fā)酵槽的應(yīng)用上， 其均質(zhì)的頻率對

23、於菌體形態(tài)、生長以及代謝有很大的關(guān)聯(lián)，因此找出最佳的均質(zhì)條件，將是可以未來可以再進(jìn)一步探討的方向。 參考文獻(xiàn) [1] Alonso, D.L., Maroto, F.G.,（2000）.,Plant as chemical factories for the production of polyunsaturated fatty acids, Biotechnology Advances 18：481-497. [2] Kavadia, A., Komaitis, M., Chevalot, I., Blanchard, F., Mark, I. and Aggelis, G.,（200

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26、 圖1. 脂肪酸之分類 圖2. 微生物合成PUFAs之途徑 圖3. 培養(yǎng)時間對菌體、脂肪酸、油脂之變化 圖4. 碳氮比對菌體、脂肪酸、油脂之變化 圖5. Sunflower oil對菌體、脂肪酸、油脂之變化 圖6. 兩階段控溫對菌體、脂肪酸、油脂之變化 圖7. 饋料批式對菌體、脂肪酸、油脂之變化 圖8. 兩階段控溫搭配饋料批式對菌體、脂肪酸、油脂之變化 圖9. Polytron 均質(zhì)對菌體、脂肪酸、油脂之變化 表1. 操作策略對菌體、脂肪酸、油脂之影響 F1 F2 F3 F4 F5 Biomass(g/L) 8.84 7.80

27、 8.62 8.20 9.11 Total lipid (g/L) 3.48 2.66 3.90 3.23 3.34 Cellular lipid content (g/L) 42.4 40.8 47.7 40.0 42.5 GLA conc.(g/L) 0.285 0.315 0.268 0.443 0.280 F1：500 rpm、1 vvm 恆溫（30℃） F2：500 rpm、1 vvm ＋第48小時改變溫度（30℃－20℃） F3： 500 rpm 、1 vvm ＋ 第48小時加入320 g/L葡萄糖250 mL F4：500 rpm 、1 vvm ＋ 第48小時改變溫度（30℃－20℃）以及加入320 g/L葡萄糖250 mL F5：300 rpm 、1 vvm ＋ polytron 均質(zhì)（2 min/12 hr）＋ 第48小時改變溫度（30℃－20℃）以及加入320 g/L葡萄糖250 mL