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1、 本科生畢業(yè)論文（設計） 論 文 題 目：大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌 感染斑馬魚研究 姓 名： 院 系： 生命科學學院 專 業(yè)： 生物技術 年 級、班 組： 06級3（1）班 指 導 教 師： 畢業(yè)論文（設計）任務書 設計（論文）題目 細菌感染斑馬魚研究 專業(yè)、班級 生物技術06生31 學生姓名 指導教

2、師姓名、職稱 下發(fā)日期 2009年12月1日 （任務起止日期：2009 年 12 月 1 日至 2010 年 5 月 30 日） 設計（論文）的主要內(nèi)容與要求及其主要技術指標： 主要內(nèi)容：本實驗以斑馬魚為研究對象，用細菌感染斑馬，連續(xù)觀察一個星期，統(tǒng)計致死率。 主要技術指標：1.靜水式試驗 2.細菌對斑馬魚致病性癥狀的觀察及記錄 3.獲得一星期的LC50 進 度 安 排 序號 畢業(yè)設計（論文）工作進度 日期（起止周數(shù)） % 1 收集有關實驗資料，材

3、料及實驗方法摸索 4月14日－19日 5 3 細菌對斑馬魚致病性的預實驗 4月27日—30日 10 4 細菌對斑馬魚致病性的預實驗 5月3日－9日 10 5 細菌對斑馬魚致病性的預實驗 5月11日—13日 10 6 細菌對斑馬魚致病性的預實驗 5月14日—15日 10 7 細菌對斑馬魚致病性的預實驗 5月16日—17日 20 8 細菌對斑馬魚致病性的正式實驗準備 5月18日 5 9 細菌對斑馬魚致病性的正式實驗 5月18—20日 5 10 完成實驗總結(jié)和畢業(yè)論文 5月 15

4、 同組設計（論文）者： 系意見： 簽字： 年 月 日 學院負責人意見： 簽字： 年 月 日 注：1.此任務書由指導教師填寫。2.此任務書最遲必須在第七學期16周之前下達給學生。3.此表由院收集存檔，以備教務處檢查。 本科生畢業(yè)論文（設計） 開 題 報 告 書 論 文 題 目：大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌 感染斑馬魚研究 姓 名： 院

5、 系： 生命科學學院 專 業(yè)： 生物技術 年級、 班組： 06級31班 指 導 教 師： 畢業(yè)論文（設計）開題報告表 課題題目 大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究 指導教師 職稱 副教授 課題組成員 畢業(yè)生年級 06生31 完成時間 2010年4月14日 立 題 依 據(jù) 1． 研究的目的和意義 目的：檢測弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌，對斑馬魚的致病性，并獲得致死溫度和致死劑量

6、。 意義：斑馬魚是一種亞熱帶觀賞魚類，具有個體小，產(chǎn)卵周期小，產(chǎn)卵量高，體外受精與發(fā)育等特點，同時由于其與人類基因組具有較高相似性，也具有較完整的獲得性和天然細胞免疫系統(tǒng)。本實驗以斑馬魚為模式動物，分析大腸桿菌的的致病性。 2． 國內(nèi)外研究進展及分析 大腸桿菌（Escherichia coli） 革蘭氏陰性短桿菌，大小0.51～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌是細菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細胞壁，只含有核糖體簡單的細胞器，沒有細胞核有擬核；細胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運載體。培養(yǎng)基中加入伊紅美藍遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否

7、存在。大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。人體與大腸桿菌的關系：在不致病的情況下（正常狀況下），可認為是互利共生（一般高中階段認為是這種關系）；在致病的情況下，可認為是寄生。 該菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強，55℃經(jīng)60分鐘或60℃加熱15分鐘仍有部分細菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。 當前大腸桿菌病給養(yǎng)禽業(yè)帶來的損失越來越大，其難于治愈、死亡率高、極易復發(fā)等臨床特點，正困擾著基層廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者。 大腸桿菌具有很多毒力因子，包括內(nèi)毒素，莢膜，〣型分泌系統(tǒng)，黏附素和外毒素等。 立 題 依 據(jù) 弗氏檸檬酸桿菌革

8、蘭氏陰性，通常以周生鞭毛運動。兼性厭氧。有呼吸和發(fā)酵兩種類型的代謝。在普通肉胨瓊脂上的菌落一般直徑2～4mm，光滑、低凸、濕潤、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。偶爾可見粘液或粗糙型。氧化酶陰性。接觸酶陽性?；苡袡C營養(yǎng)，能利用檸檬酸鹽作為惟一碳源。硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。沒有賴氨酸脫羧酶。不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶、明膠酶、脂肪酶和DNA酶。不分解藻朊酸鹽和果膠酸鹽。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。甲基紅試驗陽性 3．主要參考文獻 [1]康白.與正常微生物群有關的新概念.中國微生態(tài)學雜志,1992,4(4):1-5 [2]桂遠明,何幽峰,吳垠等.生態(tài)制品(Jy10、Jy31復合制劑)飼料添加劑對

9、提高鯉抗病力的研究.中國微生態(tài)學雜志,1994,6(6):27-33 [3] Jesse D M, Melody N N. Zebrafish as a model host for streptococcalpathogenesis. Acta Tropica, 2004, 91(1): 53-68 [4]Pressley M E, Phelan III P E,Eckhard W P,et al. Pathogen-esis and inflammatory response toEdwardsiella tardainfec-tion in the zebrafish[J]. Dev

10、elopmental & Comparative Im-munol,2005,29(6):501-513 [5] 陳　陽,吳　迪,陳雪燕,趙煥燦,扈鴻霞,Cheick A Diakite,方維煥*豬鏈球菌2型分離株對野生斑馬魚的致病性*動物醫(yī)學進展,2008,29(6):1-5 [6]濮俊毅，黃新新，陸承平，2007用斑馬魚檢測豬鏈球菌2 型的致病力，中國農(nóng)業(yè)科學40(11):2655-2658 研究內(nèi)容 研究的主要內(nèi)容： 1. 弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌對斑馬魚毒性的實驗 2. 獲得弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌對斑馬魚的致死率 3. 實驗期間斑馬魚的觀察及記錄 技術路線 和實

11、施方案 1． 購買斑馬魚，置于蒸餾水中飼養(yǎng)，同批次斑馬魚馴養(yǎng)一周。 2． 參照參考文獻，分批設計不同預實驗濃度，溫度大腸桿菌。 3． 針對預實驗結(jié)果，設計正式試驗的濃度，溫度。保證實驗條件與預實驗及以下實驗操作時條件一致。 4． 實驗開始后開始觀察斑馬魚，記錄魚死亡數(shù)目，時間，并及時清理死魚。 5． 實驗期間連續(xù)充氣 預期結(jié)果 1. 預實驗獲得實驗的濃度，溫度。 2. 正式實驗獲得致死劑量。 3. 獲得魚在試驗期間各種現(xiàn)象，整理實驗數(shù)據(jù)，計算結(jié)果。 4. 撰寫畢業(yè)論文一篇。 指導教師意見 （簽名） 年 月 日 院系

12、意見 （簽名） 年 月 日 大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究 摘要：以野生斑馬魚為實驗動物模型，分別采用大腸桿菌（Escherichia coli）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），以細菌濃度108-1010cfu之間，在25℃、28℃飼養(yǎng)條件下進行感染試驗。結(jié)果表明，斑馬魚在25℃時，大腸桿菌濃度4.0108的感染致死率為66.7%，半致死時間（LT50）為48h；濃度為4.0109致死率為66.7%，LT50為20h；濃度1.61010致死率為100%，LT50為7min；在28℃，

13、大腸桿菌濃度為4.0109致死率為66.7%，LT50為15h；濃度為8.0109致死率為66.7%，LT50為9h。弗氏檸檬酸桿菌濃度4.01010時25℃致死率為66.7%，LT50為27h；濃度2.01010時，28℃致死率為66.7%，LT50為20h。以上結(jié)果表明大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌可以感染斑馬魚，并與飼養(yǎng)溫度，菌液濃度有關。 關鍵詞：大腸桿菌；弗氏檸檬酸桿菌；斑馬魚；致死率 Escherichia coli andcitrobacter freundii infection of the zebrafish Experimental Study Abstrac

14、t: Wild zebrafish as experimental animal models were used to E. coli (Escherichia coli), Citrobacter freundii (Citrobacter freundii), to between 108-1010cfu bacterial concentration, in 25 ℃, 28 ℃ keeping infection under the conditions of test. The results show that zebra fish at 25 ℃, the concentrat

15、ion of 4.0 108 E. coli infection death rate was 66.7%, median lethal time (LT50) is 48h; concentration of 4.0 109 death rate was 66.7%, LT50 was 20h; concentration of 1.6 1010 death rate was 100%, LT50 was 7min; at 28 ℃, E. coli concentration of 4.0 109 death rate was 66.7%, LT50 was 15h; concen

16、tration of 8.0 109 death rate was 66.7%, LT50 was 9h. Citrobacter freundii concentration of 4.0 1010 when the death rate of 25 ℃ 66.7%, LT50 was 27h; concentration of 2.0 1010 hours, 28 ℃ death rate was 66.7%, LT50 to 20h. These results suggest that E. coli, Citrobacter freundii can infect zebra

17、fish, and with raising the temperature, bacteria concentration. Key words: Escherichia coli; citrobacter freundii;zebrafish;Infection;Fatality rate; 目錄 引言 1 1材料與方法 2 1.1主要試劑 2 1.2菌株與實驗動物 2 1.3斑馬魚浸泡試驗 2 1.3.1平板計數(shù) 2 1.3.2 OD值的測定 2 1.3.3斑馬魚創(chuàng)傷處

18、理 2 1.3.4浸泡斑馬魚 3 1.4 細菌分離與鑒定 3 2結(jié)果與分析 3 2.1平板計數(shù) 3 2.2菌液OD值 3 2.3 致死情況 4 2.4 斑馬魚的臨床及病理變化 6 3.討論 7 致謝 8 參考文獻 8 引言 本實驗中所使用的大腸桿菌來自于健康禽類的腸道，腸道菌群的組成是多種多樣的，而且每種細菌的數(shù)量及分布各不相同。腸道內(nèi)的細菌根據(jù)所起作用可以分為原籍菌群(Autocht honous flora)和外籍菌群(Allocht honous flora)，或分為固有菌群和非固有菌群等[1]。弗氏檸檬酸桿菌來

19、自于魚類腸道。 魚類對原籍菌群及外籍菌群的免疫作用是不同的。當腸道菌群進入斑馬魚腸道中，一些適應于腸道環(huán)境的種類(一般為厭氧菌)在腸道內(nèi)成為優(yōu)勢種群，定植下來成為原籍群。所以寄主的免疫活性細胞并不將它視為“非己”，因此并不引起或僅產(chǎn)生低水平的免疫反應。相反，魚類對外籍菌群的免疫反應是強烈的。侵入人、動物體內(nèi)的外籍菌很容易引起宿主產(chǎn)生抗體和致敏的免疫活性細胞。鯉進食生態(tài)制品后，免疫力增強，其白細胞吞噬率、白細胞吞噬指數(shù)、E玫瑰花環(huán)形成率等指標明顯高于對照組[2] 大腸桿菌（Escherichia coli） 革蘭氏陰性短桿菌，大小0.51～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌是細菌

20、，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細胞壁，只含有核糖體簡單的細胞器，沒有細胞核有擬核；該菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強，55℃經(jīng)60分鐘或60℃加熱15分鐘仍有部分細菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。當前大腸桿菌病給養(yǎng)禽業(yè)帶來的損失越來越大，其難于治愈、死亡率高、極易復發(fā)等臨床特點，正困擾著基層廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者。大腸桿菌具有很多毒力因子，包括內(nèi)毒素，莢膜，〣型分泌系統(tǒng)，黏附素和外毒素等。 弗氏檸檬酸桿菌(citrobacter freundii)革蘭氏陰性，通常以周生鞭毛運動。兼性厭氧。有呼吸和發(fā)酵兩種類型的代謝。在普通肉胨瓊脂上的菌落一般直徑2～4m

21、m，光滑、低凸、濕潤、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。偶爾可見粘液或粗糙型。氧化酶陰性。接觸酶陽性?；苡袡C營養(yǎng)，能利用檸檬酸鹽作為惟一碳源。硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。沒有賴氨酸脫羧酶。不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶、明膠酶、和DNA酶。不分解藻朊酸鹽和果膠酸鹽。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。甲基紅試驗陽性。弗氏檸檬酸桿菌對河蟹的病原性、并導致其病理變化，藥物對該菌的敏感試驗及生產(chǎn)中藥物治療效果。從垂死的病蟹肝胰臟中分離得到可疑病菌，經(jīng)人工感染試驗證實此菌導致健康蟹發(fā)病死亡。該菌可導致河蟹的肝胰腺、鰓等發(fā)生病理變化，最終引起敗血癥而死亡[10]。 斑馬魚 (Danio rerio)是一種亞熱帶觀賞魚類，

22、具有個體小、產(chǎn)卵周期短、產(chǎn)卵量高、體外受精與發(fā)育等特點，同時由于其與人類基因組具有較高相似性，也具有較完整的獲得性和天然細胞免疫系統(tǒng)[3]，是國際標準化組織推薦的五大試驗魚種之一，試驗得出的數(shù)據(jù)可以在國際上被認可。斑馬魚作為遺傳學、發(fā)育生物學研究的模式生物已經(jīng)得到了較為廣泛的應用[4]。斑馬魚亦存在著較為完整的特異性免疫系統(tǒng)[5]，而且體本實驗以斑馬魚為實驗動物，為今后可以通過控制水體的微生物的組成來提高魚苗的成活率，或人為地添加某些定植力強的有益菌群，令其在魚苗腸道內(nèi)產(chǎn)生一定的定植抗力，從而為達到提高魚體抗病力的目的提供一定的科學參考。 1材料與方法 1.1主要試劑 磷酸二氫鈉產(chǎn)自于合

23、肥工業(yè)大學化學試劑廠，蛋白胨產(chǎn)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，牛肉浸膏來自于國藥集團化學試劑有限公司，氯化鈉來自無錫市亞盛化工有限公司，磷酸氫二鈉來自于合肥工業(yè)大學化學試劑廠，瓊脂粉來自于天津市福晨化學試劑廠。 1.2菌株與實驗動物 實驗所用的弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌由徐州師范大學生命科學學院微生物實驗室分離鑒定，保存。所用大腸桿菌菌株來自于禽類。試驗所用的斑馬魚為市場銷售的藍條紋斑馬魚，采用充分曝氣的清水飼養(yǎng),并在水循環(huán)和增氧條件下生活1周以適應環(huán)境。 1.3斑馬魚浸泡試驗 1.3.1平板計數(shù) 將弗氏檸檬酸桿菌，大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)24小時，吸光度在之間，400

24、0轉(zhuǎn)/min離心10min,收集菌體，PBS洗1次，再離心一次，在原液濃度基礎上稀釋10-1—10-88個梯度，取最低濃度的菌液涂基本培養(yǎng)基平板，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，計算平板上長出的菌落數(shù)即cfu；計算出菌液濃度。 1.3.2 OD值的測定 用分光光度計在600nm波長下測定菌液的吸光度，即OD值。每種菌共測定三個稀釋倍數(shù)，即稀釋2倍，稀釋4倍，稀釋10倍。 1.3.3斑馬魚創(chuàng)傷處理 用刀片在斑馬魚脊椎上輕輕劃一傷口，制造創(chuàng)傷，可增加浸泡時的感染幾率。

25、 1.3.4浸泡斑馬魚 斑馬魚浸泡實驗分為飼養(yǎng)溫度25℃、28℃兩組，對照組則浸泡等量0.65%氯化鈉溶液。用菌濃度108—1010 cfu弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌細菌進行感染試驗，每組3條，浸泡時間為10min或15min，各組分開飼養(yǎng)，定

26、時觀察斑馬魚的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察5-7d，記錄每條魚的死亡時間，計算致死率和半致死時間(LT50)。重復兩次實驗，取兩次實驗結(jié)果的平均值，以減少實驗誤差。 1.4 細菌分離與鑒定 將死亡斑馬魚在70%L酒精中浸泡1min后,無菌條件下剖開腹部,用接種環(huán)沾取腹腔液接種至基本培養(yǎng)基平板。在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜后,用長出的菌落與相對應的菌落進行比較分析。 2結(jié)果與分析 大腸桿菌菌液稀釋8個濃度梯度后，菌落數(shù)平均值為4,，即濃度為4109 cfu/ml 弗氏檸檬酸桿菌菌液稀釋8個濃度梯度后，菌落數(shù)平均值為10即濃度為10109 cfu/ml 2.1平板計數(shù)

27、 將原大腸桿菌菌液稀釋8個濃度梯度后涂平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，取平均值后為4，即原菌液濃度為4109 cfu/ml， 同樣弗氏檸檬酸桿菌：平均值10, 即原菌液濃度為10109 cfu/ml。 2.2菌液OD值 表1大腸桿菌在的OD值 Table 1 the bacteria concentration OD 濃度 2.0109 1.0109 2.0108 OD值 1.229 0.698 0.265

28、 大腸桿菌菌液的OD值隨濃度的降低而減小，濃度為2.0109 （稀釋2倍），OD值為1.229,濃度為2.0109（稀釋4倍），OD值為0.698,濃度為2.0108 （稀釋10倍），OD為0.265 表2弗氏檸檬酸桿菌的OD值 Table 2 the bacteria concentration OD 項目 5.0109 2.5109 1.0109 OD值 1.319 0.788 0.355 弗氏檸檬酸桿菌菌液的OD值隨濃度的降低而減小，濃度為5.0109 （稀釋2倍），OD值為1.319,濃度為2.5109（稀釋4倍），OD值為0.788,濃度為1.0109 （稀釋

29、10倍），OD為0.355。 2.3 致死情況 表3飼養(yǎng)溫度為25℃時，大腸桿菌對斑馬魚的致死率和時間 Table 2 Rearing temperature of 25 ℃, the mortality rate and time of immersion in zebrafish for E.coli 濃度 致死率 4.0108 (cfu/ml) 4.0109 (cfu/ml) 1.61010 (cfu/ml) 10min 66.7%（2/3） 66.7%（2/3） 100%(3/3) LT50 49h 20h 7min 大腸

30、桿菌在25℃時，濃度為4.0108 (cfu/ml)時，致死率為66.7%，半致死時間為49h，濃度為4.0109 (cfu/ml)時，致死率為66.7%，半致死時間為20h，濃度為1.61010(cfu/ml)時，致死率為100%，半致死時間為7min。 表4飼養(yǎng)溫度為28℃時，大腸桿菌對斑馬魚的致死率和時間 Table 3 Rearing temperature of 28 ℃, the mortality rate and time of immersion in zebrafish for E.coli 濃度 致死率 1.6109 (cfu/ml) 8.

31、0109 (cfu/ml) 10min 66.7%(2/3) 33.3（1/3） 15min 66.7%（2/3） 66.7（2/3） LT50 15h 9h 大腸桿菌在28℃時，浸泡15min，濃度為1.6109 (cfu/ml)時，致死率為66.7%，半致死時間為15h，濃度為8.0109 (cfu/ml)時，致死率為66.7%，半致死時間為9h。 表5弗氏檸檬酸桿菌的對斑馬魚的致死率和時間 Table 5 Rearing temperature, the mortality rate and time of immersion in zebrafish for

32、citrobacter freundii 濃度、溫度 15min 4.01010 (cfu/ml) 25℃ 2.01010(cfu/ml) 28℃ 致死率 66.7（2/3） 66.7（2/3） LT50 27h 20h 弗氏檸檬酸桿菌在25℃時，濃度為1.01010 (cfu/ml)時,致死率為66.7%，半致死時間為27h。在28℃時，濃度為2.01010 (cfu/ml)時，致死率為66.7%，半致死時間為20h。 大腸桿菌：當飼養(yǎng)溫度為25℃時，浸泡時間為10min,菌液濃度為4108cfu時，96h內(nèi)致死率為66.7%，半致死

33、時間49h；當濃度為4109cfu時，96h內(nèi)致死率為66.7%，半致死時間20h；濃度為1.61010 cfu，10min致死率100%，半致死時間為7min。在同一溫度下，隨著濃度的增大，半致死時間縮短；濃度為4108cfu，4109cfu時，致死率都為66.7%，但當濃度增大到1.61010 cfu時，在浸泡的10min內(nèi)，致死率為100%，致死率增大（見表3,4）。 而當飼養(yǎng)溫度上升為28℃時，浸泡時間為15min，菌液濃度為4109cfu，浸泡10min，96h內(nèi)致死率為66.7%，，半致死時間為15h；濃度為8109 cfu，96h內(nèi)致死率100%,半致死時間為9h。在28℃下，

34、濃度越高，致死率越高，半致死時間也縮短（見表3,4）。 弗氏檸檬酸桿菌：當飼養(yǎng)溫度為25℃時，浸泡時間為15min,菌液濃度為4.01010cfu時，96h致死率為66.7%，半致死時間27h；當飼養(yǎng)溫度為28℃時,濃度為2.01010 cfu，96h致死率66.7%，半致死時間20h。25℃時菌液濃度為28攝氏度時菌液濃度的2倍，但28℃時的半致死時間卻短于25℃時的。（見表5）。 綜上所述，菌濃度越高，斑馬魚越易被感染，菌濃度為8109cfu，是研究大腸桿菌感染斑馬魚免疫的最佳濃度，菌濃度為2.01010cfu是研究感染弗氏檸檬酸桿菌對斑馬魚免疫的最佳濃度，且斑馬魚感染后在28℃飼養(yǎng)比

35、在25℃現(xiàn)象更明顯。 2.4 斑馬魚的臨床及病理變化 弗氏檸檬酸桿菌感染后 正常對照組 大腸桿菌感染后 感染后死亡的斑馬魚傷口發(fā)紅，腮部泛紅，腹部膨脹，剖檢觀察到，肝臟呈現(xiàn)蒼白色，腹腔內(nèi)有較多積水，而空白對照組并無以上現(xiàn)象。 3.討論 本實驗中所使用的大腸桿菌來自于健康禽類，當飼養(yǎng)溫度為25℃時，浸泡時間為10min,菌液濃度為4108cfu時，致死率為66.7%（2/3），半致死時間49h，濃度為4109cfu，致死率為66.7%（2/3），半致死時間20h,濃度為1.61010 cfu，致死率100%（3/3），半致

36、死時間為7min。當飼養(yǎng)溫度為28℃時，菌液濃度為8109cfu，浸泡10min，致死率為66.7%（2/3），，半致死時間15h，濃度為4109 cfu，浸泡15min,致死率100%（3/3），半致死時間為9h。同一溫度下，菌液的濃度越高，半致死時間越短，致死率總體也是提高的。不同溫度，同一濃度下，28℃的半致死時間短于25℃時的。但對于25℃時，濃度為1.61010 cfu，在浸泡的10min內(nèi)，實驗魚全部死亡，半致死時間為7min，這種情況與菌液濃度過高有關，由于濃度過高，魚浸泡在其中，缺少氧氣，最終死亡，這與本實驗中感染死亡不同，此種情況斑馬魚不是由于斑馬魚被細菌感染而造成的死亡。

37、 本實驗中所使用的弗氏檸檬酸桿菌來自于魚類，浸泡15min，在25℃時，濃度為4.01010cfu時，死亡率為66.7%，半致死時間為27h，當溫度為28℃時，濃度為2.01010 cfu，死亡率為66.7%，半致死時間為20h。兩種條件下的致死率雖然相同，但致死時間卻不同，濃度為4.01010cfu的菌液半致死時間高于濃度為2.01010 cfu的菌液，因此半致死時間不僅與濃度有關，還與溫度有關，結(jié)合大腸桿菌的數(shù)據(jù)可以得出，28℃更利于菌在魚體內(nèi)的繁殖。 在攻毒方式上,Pressley M E等[7]用遲鈍愛德華氏菌(E. tarda)對斑馬魚采用了浸泡、皮膚損傷后浸泡和腹腔注射接種等途徑

38、,發(fā)現(xiàn)在皮膚未破損的情況下,浸泡法不能成功攻毒。Novoa B等[8]用病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)采用浸泡法攻毒,效果同樣不理想。本試驗同樣嘗試了這3種途徑,最終僅腹腔注射有效,表明SS2一般不能通過鰓與皮膚途徑直接感染斑馬魚,但某些細菌可感染受環(huán)境應激后的斑馬魚[9]。在飼養(yǎng)條件上,本研究發(fā)現(xiàn)魚群的生活溫度和細菌毒力密切相關,水溫處于25℃以下時,106cfu的細菌在腹腔接種攻毒后不能造成斑馬魚死亡,這可能是由于在較低溫度下細菌在魚體內(nèi)的繁殖緩慢,從而被魚的免疫系統(tǒng)有效清除所致[10]。 Jesse 等[6]探討了斑馬魚背肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射和浸泡等接種途徑對LD50 的影響。筆者

39、發(fā)現(xiàn)，背肌內(nèi)注射難以確保注射劑量，注射液體易回溢；此外拔鱗浸泡雖是魚類免疫常用的途徑，但由于斑馬魚體型較小，應激大，影響最終結(jié)果。相比而言，腹腔內(nèi)注射較易操作，且應激反應較小，注射后8 h 之內(nèi)不出現(xiàn)死亡，是最佳的接種途徑[11]。 斑馬魚在浸泡的10或15min內(nèi)死亡，是由于菌液濃度過高，魚在浸泡過程中缺氧而死，并非本實驗所研究的感染而死。因此，如果斑馬魚在浸泡過程中死亡率過高，此菌液濃度不能用于大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌對斑馬魚致病性的實驗研究。 致謝 本論文是在徐州師范大學生命科學學院微生物實驗室完成的。從選題，實驗設計，撰寫到成文都是在呂愛軍副教授的精心指導下完成的。呂老師知識淵博

40、，治學嚴謹，工作勤奮執(zhí)著，是我學習的楷模。衷心感謝他這幾個月來對我實驗上的指導和幫助。 同時也感謝碩士研究生鄭璐師姐在實驗過程中給予的幫助。 參考文獻 [1] 康白.與正常微生物群有關的新概念.中國微生態(tài)學雜志,1992,4(4):1-5 [2] 桂遠明,何幽峰,吳垠等.生態(tài)制品(Jy10、Jy31復合制劑)飼料添加劑對提高鯉抗病力的研究.中國微生態(tài)學雜志,1994,6(6):27-33 [3] 李華，邢殿樓，白國福，李向暉 弗氏檸檬酸桿菌對河蟹致病性的研究，水生生物學報，第25卷第3期2 0 01年5月 [4] Abhinanda B,Sarkar G K, Kumar S

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43、Im-munol,2005,29(6):501-513 [8] Novoa B,Romero A,Mulero V,et al. Zebrafish(Danio rerio)as a model for the study of vaccination against viral haemor-rhagic septicemia virus (VHSV)[J]. Vaccine,2006,24(31-32):5806-5816 [9] Neely M N, Pfeifer J D, Caparon M.Streptococcus-zebrafish model of bacterial p

44、athogenesis[J]. Infection and Immunity, 2002,70(7):3904-3914 [10] 陳陽,吳迪,陳雪燕,趙煥燦,扈鴻霞,Cheick A Diakite,方維煥*豬鏈球菌2型分離株對野生斑馬魚的致病性*動物醫(yī)學進展,2008,29(6):1-5 [11] 濮俊毅，黃新新，陸承平，2007用斑馬魚檢測豬鏈球菌2 型的致病力，中國農(nóng)業(yè)科學40(11):2655-2658 本科生畢業(yè)論文（設計）成績評定表 姓 名 院 系 生命科學學院 專 業(yè) 生物技術 年 級 06級 學 號 論 文 題 目 大腸桿菌

45、、弗氏檸檬酸桿菌感染斑馬魚研究 論 文 內(nèi) 容 提 要 以野生斑馬魚為實驗對象，采用大腸桿菌（Escherichia coli）、弗氏檸檬酸桿菌（citrobacter freundii）進行斑馬魚感染研究。分別以108-1010cfu濃度之間的細菌，在兩種種溫度（25℃，28℃）下進行感染試驗。結(jié)果表明，對于大腸桿菌大腸桿菌，在25℃時，用菌液濃度為4.0108的感染后，致死率為66.7%，半致死時間為48h；濃度為4.0109 時，致死率為66.7%，半致死時間為20h；1.61010時，致死率為100%，致死時間為7min

46、；在28℃，大腸桿菌濃度為4.0109 時，致死率為66.7%，半致死時間為15h；濃度為8.0109 時，斑馬魚的死亡率為66.7%，半致死時間為9h。而對于弗氏檸檬酸桿菌，在25℃時，菌液濃度為4.01010 時，致死率為66.7%，半致死時間為27h；濃度為2.01010 時，致死率為66.7%，半致死時間為20h。兩種菌對斑馬魚的致病性與培養(yǎng)溫度，菌液濃度有關。 指 導 教 師 意 見 評定成績： 指導教師 （簽名） 年 月 日 答 辯 小 組 意 見 論文答辯成績： 答辯組長： （簽名） 年 月 日 院系意見 綜合評定成績： （簽名） 年 月 日 注：答辯小組意見包括答辯中主要問題及回答的簡要情況、投票結(jié)果、論文評語、論文成績。