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激光掃描共聚焦顯微鏡 LaserScanningConfocalMicroscope LSCM 采用激光作為光源 在傳統光學顯微鏡基礎上 使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針 采用共軛聚焦原理和裝置 從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像 在亞細胞水平上觀察生理信號及細胞形態(tài)的變化 并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套集觀察 分析和輸出為一體系統 它把光學成像的分辨率提高了30 40 成為形態(tài)學 分子生物學 神經科學 藥理學 遺傳學等領域中新一代的研究工具 LSCM的發(fā)展1957年提出了共聚焦顯微鏡技術的某些基本原理 并獲得了美國的專利 1967年成功的應用共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫面 1970年牛津和阿姆斯特丹同時向科學界推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡 1984年Bio Rad公司推出了世界第一臺共聚焦顯微鏡品 1987年White和Amos在英國 自然 雜志發(fā)表了 共聚焦顯微鏡時代的到來 一文 標志著LSCM已成為進行科學研究的重要工具 隨后Zeiss Leica Meridian等多家公司相繼開發(fā)出不同型號的共聚焦顯微鏡 隨著技術的不斷發(fā)展和完善 產品的性能也不斷改進和更新 應用的范圍也越來越廣泛 HippocampusneuronsexpressingGFP LSCM與普通熒光顯微鏡的圖像質量比較 熒光顯微鏡 LSCM 顯微鏡成像清晰度的決定因素 1 分辨率2 球差3 色差 1 分辨率 指顯微鏡能將近鄰的兩個質點分辨清楚的能力 通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點間的距離來表示 人眼及各類顯微鏡的分辨率 人眼分辨率 0 20mm光學顯微鏡分辨率 0 25mm共焦顯微鏡分辨率 0 18mm電子顯微鏡分辨率 0 20nm 2 球差 由主軸上某一物點向光學系統發(fā)出的單色圓錐形光束 經該光學系列折射后 不能聚焦成一點 使成像模糊不清 形成一彌散光斑 俗稱模糊圈 則此光學系統的成像誤差稱為球差 3 色差 由白色物點向光學系統發(fā)出一束白光 經該光學系列折射后 組成該束白光的紅 橙 黃 綠 青 藍 紫等各色光 不能會聚于同一點 即白色物點不能結成白色像點 而結成一彩色像斑的成像誤差 稱為色差 LSCM的重要組件 激光光源自動顯微鏡掃描模塊 包括共聚焦光路通道和針孔 掃描鏡 檢測器 數字信號處理器計算機以及圖象輸出設備 顯示器 彩色打印機 等 激光器顯微鏡 物鏡載物臺計算機系統 圖像分析與控制系統 激光掃描共聚焦顯微鏡vs熒光顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡 熒光顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器 激光器 Ar激光器 458nm 476nm 488nm 514nmHeNe 543nm 633nm固體激光器 UV 405nm 激光器的特點 1 方向性好 激光基本延直線傳播2 單色性好 10 8nm3 高亮度 激光方向性好 其在空間上的能量分布是高度集中的 4 偏振性 激光為平面偏振光 光纖耦合 顯微鏡 LeicaDMIRBE倒置熒光顯微鏡 物鏡 LSCM物鏡的重要參數NA 數值孔徑又叫做鏡口率 簡寫為N A 是物鏡的主要技術參數 是判斷物鏡性能高低的重要標志 N A n sina 2n 物體與物鏡間媒質的折射率a 2 物鏡孔徑角的一半溴萘折射率1 66 香柏油1 515 玻璃1 52 水的為1 3 空氣為1 香柏油與玻璃折射率相似 故光折射少 透光率高 成像清楚 N A 越大 放大倍數越大 分辨率越高 N A 越大 視場寬度與工作距離越小 4x 20 x 10 x 40 x 60 x 100 x 載物臺 計算機系統 圖像分析與控制系統 分析軟件 控制軟件 激光共聚焦顯微鏡原理 圖1 共聚焦顯微鏡簡化原理圖用于激發(fā)熒光的激光束 Laser 透過入射小孔 lightsourcepinhole 被二向色鏡 Dichroicmirror 反射 通過顯微物鏡 Objectivelens 匯聚后入射于待觀察的標本 specimen 內部焦點 focalpoint 處 激光照射所產生的熒光 fluorescencelight 和少量反射激光一起 被物鏡重新收集后送往二向色鏡 其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長 直接通過二向色鏡并透過出射小孔 Detectionpinhole 到達光電探測器 Detector 通常是光電倍增管 PMT 或是雪崩光電二極管 APD 變成電信號后送入計算機 而由于二向色鏡的分光作用 殘余的激光則被二向色鏡反射 不會被探測到 共軛 圖2 探測針孔的作用示意圖 解釋了出射小孔所起到的作用 只有焦平面上的點所發(fā)出的光才能透過出射小孔 焦平面以外的點所發(fā)出的光線在出射小孔平面是離焦的 絕大部分無法通過中心的小孔 因此 焦平面上的觀察目標點呈現亮色 而非觀察點則作為背景呈現黑色 反差增加 圖像清晰 在成像過程中 出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點 focalpoint 是一一對應的關系 共軛conjugate 因而被稱為共聚焦 con focal 顯微技術 普通光學顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別 LSCM掃描圖像方式 單一光學切片掃描 singleopticalsection x y 時程活細胞掃描 timelapselivecellimaging x y t 三維掃描及重構 3 Dreconstruction x y z 四維掃描 4 Dimaging x y z t Z X Y XY平面 單一光學切片掃描 singleopticalsection x y Opticalsectionscollectedsimultaneouslyatthreedifferentexcitationwavelengths 488 568 and647nanometers Thespecimenisthefruitflythirdinstarwingimaginaldisk X Y XY平面 時程活細胞掃描 timelapselivecellimaging x y t X Y XY平面 time Time lapseimagingofalivingfruitflyembryoinjectedwithcalciumgreenispresentedinFigure2 Theseriesofimagesshowsthechangeindistributionofthefluorescentprobeovertime 0s 10s 20s 30s 三維掃描及重構 3 Dreconstruction x y z Peripheralnervoussystemofafruitflyembryo Z X Y XY平面 三維掃描及重構 3 Dreconstruction x y z 一種高分辨率的顯微成像技術 1用激光做光源 激光單色性好 光源波長相同 從根本上消除了色差 2采用共聚焦技術在物鏡的焦平面上放置了一個帶有小孔的擋板 將焦平面以外的雜散光擋住 消除了球差 并進一步消除了色差 顯微圖象的清晰度和細節(jié)分辨能力 3采用點掃描技術將樣品分成無數個點 用十分細小的激光束逐點逐行掃描成像 再通過電腦組合成一個整體 傳統的光鏡在場光源下一次成像 標本上每一點都會受到相鄰點的衍射光和散射光的干擾 這兩種圖像的清晰度和精密度是無法相比的 4用計算機采集和處理光信號 并利用光電倍增管放大信號 它代替了人眼和照相機進行觀察 攝像 得到的圖像是數字化的 可以在電腦中進行處理 進一步提高圖像的清晰度 5觀察活細胞 活組織 在不損傷細胞的前提下 對活組織 活細胞進行觀察和測量 這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程 如脫水 脫蠟 染色等 而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究 這種功能對于細胞培養(yǎng) 轉基因研究尤為重要 這可以說是 最大的優(yōu)勢 6生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針 對于要檢測的成分不僅可以定位到細胞水平 還可以定位到亞細胞水平和分子水平 7動態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時間進行連續(xù)掃描 就可分析細胞結構 內含 和標記等動力學變化 目前在這方面做得最多的是使用 觀察心肌或平滑肌細胞內游離鈣 鈉 鉀離子濃度或 的動態(tài)變化 8定量測量 首先應用專一的熒光探針對樣品進行染色 樣品的熒光強度和所測成分的含量呈正比 如果其余條件固定 通過對比各組樣品之間的熒光強度值 可得出特定成分的含量比 應用范圍細胞生物學 細胞結構 細胞骨架 細胞膜結構 流動性 受體 細胞器結構和分布變化生物化學 酶 核酸 FISH 熒光原位雜交 受體分析藥理學 藥物對細胞的作用及其動力學生理學 膜受體 離子通道 細胞內離子含量 分布動態(tài)神經生物學 神經細胞結構 神經遞質的成分 運輸和傳遞 遞質受體 離子內外流 神經組織結構 細胞分布微生物學和寄生蟲學 細菌 寄生蟲形態(tài)結構病理學及臨床應用 活檢標本診斷 腫瘤診斷 自身免疫性疾病診斷 HIV等遺傳學和組胚學 細胞生長 分化 成熟變化 細胞的三維結構 染色體分析 基因表達 基因診斷 LSCM在生物學上的應用 熒光組織化學動態(tài)熒光測量 細胞內鈣測量 細胞內pH測量 細胞膜流動性測量 膜電位測定 細胞間隙連接的細胞間通訊 熒光探針的選擇 合適的熒光探針是有效地進行實驗并獲取理想實驗結果的保障 1 現有儀器所采用的激光器 2 熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性 3 熒光的定性或定量定性 單波長激發(fā)探針定量 雙波長激發(fā)比率探針 4 熒光探針的特異性和毒性 5 熒光探針適用的pH 不同的熒光探針在不同標本的效果常有差異 故除綜合考慮以上因素以外 有條件者應進行染料的篩選 以找出最適的熒光探針 許多熒光探針是疏水性的 很難或不能進入細胞 需使熒光探針與AM 乙酰羥甲基酯 結合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質膜進入細胞 在細胞內熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解 去掉AM后的熒光探針不僅可與細胞內的靶結構或靶分子結合且不易透出質膜 從而能有效的發(fā)揮作用 常見應用及其熒光探針 1 細胞內游離鈣共聚焦激光掃描顯微鏡常用的有Fluo 3 Fluo 4 Rhod 1 Rhod 2 Indo 1 Fura 2等 前四者為單波長熒光探針 利用其單波長激發(fā)特點可直接測量細胞內Ca2 動態(tài)變化 為鈣定性探針 后兩者為雙波長激發(fā)探針 利用其雙波長激發(fā)特點和比率技術 能定量細胞內鈣 為鈣定量探針 Fura 2 激發(fā)峰為340 380nm 發(fā)射波長在505 520nm之間 Fura 2可以和鈣離子結合 結合鈣離子后在330 350nm激發(fā)光下可以產生較強的熒光 而在380nm激發(fā)光下則會導致熒光減弱 這樣就可以使用340nm和380nm這兩個熒光的比值來檢測細胞內的鈣離子濃度 可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異 熒光探針的滲漏 細胞厚度差異等一些誤差因素 2 DNA和RNA核酸的熒光探針AO 吖啶橙 與DNA結合 發(fā)射波長525nm 顯綠色 與RNA結合 發(fā)射波長650nm 顯紅色 PI 既可標記DNA又可標記RNA 如為獲得單獨的DNA或RNA分布 染色前可用RNA酶或DNA酶處理細胞 PI不能進入完整的細胞膜 故不能標記活細胞內的DNA和RNA DAPI 與雙鏈DNA結合熒光增強20倍 與單鏈DNA結合無熒光增強 熒光強度比Hoechst低 光穩(wěn)定性強于Hoechst 3 膜電位共聚焦激光掃描顯微鏡則可利用熒光探針在細胞膜內外分布的差異測出膜電位 不但可以觀察細胞膜電位的變化結果 更重要的是可以用于連續(xù)監(jiān)測膜電位的迅速變化 DiBAC4 3 帶負電荷慢反應染料 本身無熒光 當進入細胞與胞漿內的蛋白質結合后才發(fā)出熒光 測量時要求細胞浸在熒光染料中 當細胞內熒光強度增加即膜電位 反之 即膜電位降低 Rhodamine123 主要用于線粒體膜電位測量 是一種親脂性陽離子熒光探針 當線粒體膜內側負電荷增多時 熒光強度增加 與DiBAC4 3 的表示形式相反 4 細胞內活性氧基 活性氧 activeoxygenspecies 可影響細胞代謝 與蛋白質 核酸 脂類等發(fā)生反應 有些反應是有害的 因此測量活性氧在毒理學研究中有一定的意義 常用熒光探針有Dichlorodihydrofluoresceindiacetate 2 7 二氯二氫熒光素乙酰乙酸 H2DCFDA 其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進入細胞后能被存在的過氧化物 過氧化氫等氧化分解為二氯熒光黃 dichlorofluorescein DCF 而產生熒光 5 細胞間通訊 熒光光漂白恢復 fluorescencerecoveryafterphotobleading FRAP 技術可用于檢測細胞縫隙連接通訊 該方法的原理是一個細胞內的熒光分子被激光漂白或淬滅 失去發(fā)光能力 而臨近未被漂白細胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中 熒光可以逐漸恢復 由于光漂白過程是不可逆的 因此可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細胞其熒光恢復過程的變化量來判斷細胞縫隙連接的通訊功能 6 細胞膜流動性 熒光光漂白恢復 FRAP 技術 利用NBD C6 HPC標記膜磷脂 然后用高強度的激光束照射活細胞膜表面的某一區(qū)域 1 2 m 使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白 再用較弱的激光束照射該區(qū)域 可檢測到細胞膜上其他地方未被漂白的熒光探針流動到漂白區(qū)域時的熒光重新分布情況 熒光恢復的速率和程度可提供有關的信息 7 細胞亞微結構 細胞器探針 共聚焦激光掃描顯微鏡可獲得較高分辨率的細胞內線粒體 高爾基復合體 內質網 溶酶體等細胞器圖像 同時還可動態(tài)觀察活細胞狀態(tài)下細胞器的形態(tài)學變化情況 此外還可通過光學切片即斷層掃描技術進行三維重建 顯示細胞器的空間關系及其變化 適用于線粒體的熒光探針較多 如Mitotracker DASPMI DASPEI JC 1 羅丹明123等 高爾基復合體常用的熒光探針有NBD?；拾贝?ceramide BODIPY酰基鞘氨醇 內質網主要用Dil DiOC6 3 溶酶體的熒光探針有DAMP neutralred 8 pH值正常細胞胞漿內的pH一般在6 8 7 4的范圍 而某些細胞器如溶酶體的pH則在4 5 6 0之間 根據檢測對象pH的不同將熒光探針分為用于偏中性和酸性兩類 常用于偏中性pH即細胞胞漿pH檢測的熒光探針有SNARF類 SNARF 1 SNARF calcein SNAFL類 SNAFL 1 SNAFL calcein BCECF等 這些探針均為疏水性探針 須使用其AM形式 FITC dextran則適用于pH范圍4 6之間 如溶酶體pH的檢測 該探針也不能透過質膜 但可通過細胞胞飲作用進入溶酶體 因此應選擇分子量稍小的Dextran 葡聚糖 9 標記抗體 配體等常用的熒光探針共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可用免疫熒光分析固定的細胞或組織切片 還可用于分析活細胞 得到特異性抗體或其他熒光免疫探針識別靶分子的表達 定位 分布變化等信息 10 F 肌動蛋白熒光探針 鬼筆環(huán)肽 特異性地與F 肌動蛋白熒光探針結合 納摩爾濃度下也可標記 11 檢測酶活性的熒光探針共聚焦激光掃描顯微鏡在檢測活細胞酶活性動態(tài)變化方面有著無可比擬的優(yōu)勢 通過對細胞施予不同的處理因素可檢測細胞內相應的酶被激活或滅活的動態(tài)變化過程 有的酶熒光探針是自身就可發(fā)出熒光 有的是與酶結合后發(fā)出熒光 有的則是被酶分解后發(fā)出熒光 實例1測定爪蟾卵母細胞內鈣變化 手術分離卵母細胞膠原酶消化中和消化液 停止消化18 C靜止細胞4小時 以備后用 Xenopusoocytes 卵母細胞微注射 Calciumgreen 用細胞內液稀釋Calciumgreen導入微注射器以20nL oocyte注射卵母細胞18 C避光放置40分鐘共聚焦顯微鏡觀察 IP3引起的卵母細胞內鈣升高 實例2Fluo 4測定HEK293細胞內鈣變化 前一天HEK293消化傳代Fluo 4AM孵育液的配制Fluo 4AM5uM 20 F127避光孵育HEK細胞15分鐘DMEM 10 FBS沖洗細胞2次在細胞外液中避光靜置30分鐘移入共聚焦顯微鏡載物臺 進行觀察 實例3細胞膜磷脂PIP2的動態(tài)測定 HEK293cellsexpressingPLC PH GFP PLC PH GFP H1receptorLipofactAMINE2000 混合20分鐘 混合物孵育細胞4 6小時 洗掉轉染液 加入正常培養(yǎng)液 培養(yǎng)24h LSCM觀察 Control Histamine washout 實例3細胞膜磷脂PIP2的動態(tài)測定 HEK293cellsexpressingPLC PH GFP A