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1.2 基因工程的基本操作程序,原理：基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。（既是概念，又是原理）,基因重組,1,,,,,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測與鑒定,2,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指______________________,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,2、獲取目的基因的常用方法有哪些?,（3）人工合成,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,3,(一)從基因文庫中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫,1.基因文庫,4,,基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系,,怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,5,① 概念：PCR全稱為_______________，是一項 在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù),③條件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.,②原理：__________,④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）,⑤結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,已知基因的核苷酸序列,四種脫氧核苷酸,一對引物,耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增,(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,6,⑥過程：,a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_____斷裂，形成___________,b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。,c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從 引物處延伸，合成與模板互補(bǔ) 的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,7,8,（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因,DNA合成儀,蛋白質(zhì)的氨基酸順序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,,,,推測,推測,合成,當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。,9,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心,目的：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,10,2、表達(dá)載體的組成 啟動子 終止子 目的基因 標(biāo)記基因等,,11,,質(zhì)粒,,目的基因,,限制酶,,12,,質(zhì)粒,DNA分子,,限制酶處理,,,一個切口 兩個黏性末端,兩個切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,,—— 核心,同一種,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3.過程:,13,,,14,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 （1）農(nóng)桿菌特點： （2）原理、過程,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,雙子葉植物,15,,,,,16,2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 （1）方法：顯微注射法 （2）程序：,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,,,,,,17,18,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,（1）原核生物特點：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 （2）方法：Ca2+處理,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,,,,19,(四)目的基因的檢測與鑒定,——檢查是否成功,檢測— (分子 水平),鑒定—— （個體水平）,,①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因 復(fù)制,②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定,方法——,方法——,方法——,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,病原體感染法 (接種實驗法),,,,20,（二）個體水平,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。,21,22,,,,23,,,24,思考與探究,1、不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用， 還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須 構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1）生物之間進(jìn)行基因交流，需使用啟動子和終止子才能比較有 利于基因的表達(dá)。如通過CDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子， 只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中，此目的基因無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 （2）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記。 （3）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控 元件，如增強(qiáng)子等。 （4）有時需要目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往 要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的 融合基因），如綠色熒光白基因等。,25,思考與探究,2、農(nóng)桿菌中不同的菌株侵染能力有差別，在基因工程中需要加以 選擇使用。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，是需要加 上酚類化合物，（也就是說單子葉植物不能合成酚類化合物） 對于單子葉植物不同的種類，農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有 很大差異。 如果想將一個抗病基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點 ?要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可在 侵染單子葉植物； ?要加趨化和誘導(dǎo)的物，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向 植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)性） 的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,26,思考與探究,3、有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和 高爾基體復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體復(fù)合體存在于真 核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生 產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,4、基本操作如下。 （1）從小鼠中克隆出β－珠蛋白基因的編碼序列（CDNA） （2）將 CDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另入加上 抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。 （3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán) 素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸菌中，大腸 桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌 菌落，則表明β－珠蛋白基因已進(jìn)入其中。 （4）培養(yǎng)進(jìn)入了β－珠蛋白基因的大腸桿菌收集菌體，破碎后從中 提取β－珠蛋白。,27,1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,練習(xí),28,2）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,練習(xí),29,3）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,練習(xí),30,4）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D、目的基因的檢測和表達(dá),C,練習(xí),31,