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基因工程 1.(2017全國Ⅲ卷)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成,編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成,如圖1所示。 圖1 圖2 回答下列問題。 (1)現(xiàn)要通過基因工程的方法獲得蛋白乙,若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA),則所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙,原因是 　。 (2)某同學在用PCR技術獲取DNA片段B或D的過程中,在PCR反應體系中加入了DNA聚合酶、引物等,還加入了序列甲作為　　　　,加入了　　　　作為合成DNA的原料。 (3)現(xiàn)通過基因工程的方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白,要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用,某同學做了如下實驗:將一定量的含T淋巴細胞的培養(yǎng)液平均分成四組,其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一組作為對照,培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細胞濃度,結果如圖2。 ①由圖2 可知:當細胞濃度達到a時,添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加,此時若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖,可采用的方法是　　　　　　　　　　　　　　　。細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　。 ②僅根據圖1、圖2可知,上述甲、乙、丙三種蛋白中,若缺少　　(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段,會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。 答案 (1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG,轉錄出的mRNA無起始密碼子 (2)模板　dNTP (3)①進行細胞傳代培養(yǎng)　維持培養(yǎng)液的pH?、贑 解析 (1)由基因乙的堿基序列可知,由該序列轉錄出的mRNA無起始密碼子,所以在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列后,所構建的表達載體轉入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙。(2)PCR反應體系中除了加入DNA聚合酶、引物等,還應加入序列甲作為模板,加入四種脫氧核苷酸(dNTP)作為合成DNA的原料。(3)當細胞濃度達到a時,T淋巴細胞的濃度不再增加,是因為出現(xiàn)了接觸抑制現(xiàn)象,所以可以進行細胞傳代培養(yǎng),使T淋巴細胞繼續(xù)增殖;細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是維持培養(yǎng)液中的pH。根據圖2可知,甲、乙兩組的T淋巴細胞數(shù)量多,丙組的T淋巴細胞數(shù)量少,根據圖1比較可知,丙組T淋巴細胞少的原因是蛋白丙缺少C片段所編碼的肽段。 2.科學家從某細菌中提取抗鹽基因,轉入煙草并培育成轉基因抗鹽煙草。下圖是轉基因抗鹽煙草的培育過程,含目的基因的DNA和質粒上的箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請分析回答下列問題。 (1)在該過程中,研究人員首先獲取了抗鹽基因(目的基因),并采用　　　　　　　　　　技術對目的基因進行擴增,該技術需要的條件是　　　　、酶、原料、模板,該技術必須用　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　酶;然后構建基因表達載體,基因表達載體中除了具有目的基因、啟動子和終止子之外,還需具有　　　　　　　　。 (2)用圖中的質粒和目的基因構建重組質粒,不能使用SmaⅠ酶切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。圖中①②過程為防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,應選用　　　　　　　　　　　　　酶對外源DNA、質粒進行切割。 (3)為確定轉基因抗鹽煙草是否培育成功,既要用放射性同位素標記的　　　　　　　　　　　作探針進行分子雜交檢測,又要在個體水平上鑒定,后者具體過程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案 (1)PCR(聚合酶鏈式反應)　引物　耐熱的DNA聚合酶或熱穩(wěn)定性的DNA聚合　標記基因 (2)SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因　BamHⅠ和HindⅢ (3)抗鹽基因(或目的基因)　將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中,觀察該煙草植株的生長狀態(tài) 解析 (1)依題意可知,抗鹽基因屬于目的基因,可采用PCR(聚合酶鏈式反應)技術擴增目的基因,該技術需要的條件是引物、酶、原料、模板,利用PCR技術擴增目的基因時,每次循環(huán)都是在90~95 ℃時進行變性、在55~60 ℃時進行復性、在70~75 ℃時延伸,所以該技術需要用熱穩(wěn)定DNA聚合酶(或Taq DNA聚合酶)。基因表達載體由目的基因、啟動子、終止子、標記基因等組成。(2)題圖顯示,質粒上的M抗生素抗性基因和目的基因中都含有Sma Ⅰ 酶的識別和酶切位點,若使用Sma Ⅰ 酶切割,會破壞質粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因,因此不能使用Sma Ⅰ 酶切割。抗鹽基因(或目的基因)的兩側都有EcoR Ⅰ 酶的識別和酶切位點,因此用EcoR Ⅰ 酶切割目的基因會出現(xiàn)自身環(huán)化;BamH Ⅰ和Hind Ⅲ識別和酶切位點分別位于目的基因的兩側,而且質粒中也有相應的酶切位點,因此用BamH Ⅰ 和HindⅢ同時進行酶切,才能完整地切下該抗鹽基因,同時保證目的基因與質粒的連接方式的唯一性,防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化。(3)檢測目的基因是否導入受體細胞,在分子水平上進行檢測時,要用放射性同位素標記的抗鹽基因(或目的基因)作探針進行分子雜交檢測;在個體水平上進行鑒定時,可將培養(yǎng)的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中,觀察該植株的生長狀態(tài)。 3.將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因導入棉花細胞中,可獲得抗棉鈴蟲的轉基因棉,其過程如下圖所示。 注質粒中“Bt”代表“Bt基因”,“KmR”代表“卡那霉素抗性基因”。農桿菌中Ti質粒上只有T-DNA片段能轉移到植物細胞中。 (1)過程①需用同種　　　　　　　　　　　　　　　　酶對含Bt基因的DNA和Ti質粒進行酶切。為將過程②獲得的含重組質粒的農桿菌篩選出來,應使用　　　　　培養(yǎng)基。 (2)過程③中將棉花細胞與農桿菌混合后共同培養(yǎng),旨在讓　　　　　　　　　進入棉花細胞;除盡農桿菌后,還須轉接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)若過程④僅獲得大量的根,則應在培養(yǎng)基中增加　　　　　　　　　　　　以獲得芽;部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)檢驗轉基因棉的抗蟲性狀,常用方法是　　　　　　　　　　　。種植轉基因抗蟲棉能減少　　　　　的使用,以減輕環(huán)境污染。 答案 (1)限制性核酸內切　選擇 (2)T-DNA　篩選獲得含T-DNA片段的植物細胞 (3)細胞分裂素濃度　芽頂端合成的生長素向基部運輸,促進根的分化 (4)投放棉鈴蟲　農藥 解析 (1)目的基因與質粒構建基因表達載體時需要用同種限制性核酸內切酶對二者進行切割。要篩選出含重組質粒的農桿菌應使用選擇培養(yǎng)基。(2)為將目的基因導入受體細胞,應先將重組質粒導入農桿菌,再用農桿菌感染棉花細胞,從而將T-DNA整合至棉花細胞染色體的DNA上;除盡農桿菌后,因重組質粒中含有卡那霉素抗性基因,在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)可篩選獲得含T-DNA 片段的植物細胞。(3)愈傷組織培養(yǎng)過程中,生長素能促進根的分化,細胞分裂素能促進芽的分化,在培養(yǎng)過程中芽頂端合成的生長素也可促進根的分化。(4)在個體水平檢測抗蟲棉的抗蟲性狀,可投放棉鈴蟲,觀察棉鈴蟲的生存情況。種植轉基因抗蟲棉能減少農藥的使用,從而減輕環(huán)境污染。 4.人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值,原來只能從人血漿中提取。下圖是以基因工程技術獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。 (1)為獲取HSA基因,首先需采集人的血液,提取　　　　　　合成總cDNA,然后以cDNA為模板,使用PCR技術擴增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結合模板的位置及擴增方向,請用箭頭在方框內標出另一條引物的位置及擴增方向。 (2)啟動子通常具有物種及組織特異性,構建在水稻胚乳細胞內特異表達rHSA的載體,需要選擇的啟動子是　　　　(填寫字母,單選)。 A.人血細胞啟動子　　　　B.水稻胚乳細胞啟動子 C.大腸桿菌啟動子 D.農桿菌啟動子 (3)利用農桿菌轉化水稻受體細胞的過程中,需添加酚類物質,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)人體合成的初始HSA多肽,需要經過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結構才有活性。與途徑Ⅱ相比,選擇途徑Ⅰ獲取rHSA的優(yōu)勢是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值,須確認rHSA與　　　　　　的生物學功能一致。 答案 (1)總RNA(或mRNA) (2)B (3)吸引農桿菌移向水稻受體細胞,有利于目的基因成功轉化 (4)水稻是真核生物,具有膜系統(tǒng),能對初始rHSA多肽進行高效加工 (5)HSA 解析 (1)目的基因的獲取途徑之一是逆轉錄法,即以RNA為模板合成目的基因,故需要提取相關的RNA。PCR技術利用的是DNA復制的原理,由于DNA分子的兩條鏈是反向平行的,而DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸,故另一條子鏈的擴增方向相反。(2)啟動子通常具有物種及組織特異性,要構建在水稻胚乳細胞內特異表達rHSA的載體,需選擇水稻胚乳細胞啟動子。(3)利用農桿菌轉化水稻受體細胞時,由于酚類物質能夠吸引農桿菌移向水稻受體細胞,有利于目的基因成功轉化,故需添加酚類物質。(4)由于真核細胞中具有膜系統(tǒng),途徑Ⅰ中的水稻胚乳細胞能對初始rHSA多肽進行加工,使rHSA具有生物學活性。(5)由題意知,要制備有醫(yī)用價值的rHSA,需要rHSA 與HSA的生物學功能一致。 5.(2018江蘇卷)為生產具有特定性能的α-淀粉酶,研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656個堿基對),利用基因工程大量制備α-淀粉酶,實驗流程見下圖。請回答下列問題。 (1)利用PCR技術擴增α-淀粉酶基因前,需先獲得細菌的　　　　　　　。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接,需在引物的　　　　　　端加上限制性酶切位點,且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點,主要目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)進行擴增時,反應的溫度和時間需根據具體情況進行設定,下列選項中　　　　　　的設定與引物有關,　　　　　　的設定與擴增片段的長度有關。(填序號) ①變性溫度?、趶托詼囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r間?、輳托詴r間　⑥延伸時間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列: 5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3 圖中虛線框內mRNA片段包含　　　　　個密碼子,如虛線框后的序列未知,預測虛線框后的第一個密碼子最多有　　　種。 (5)獲得工程菌表達的α-淀粉酶后,為探究影響酶活性的因素,以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性,結果如下: 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 50 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L Gly-NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對 活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據上述實驗結果,初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為 　　　　　　　　。 答案 (1)基因組DNA　(2)5　使DNA片段能定向插入表達載體,減少自連　(3)②?、蕖?4)8　13　(5)pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl 解析 (1)從海洋細菌中利用PCR技術擴增α-淀粉酶基因,首先要獲得細菌的基因組DNA,再利用引物來獲取α-淀粉酶基因。(2)由于PCR技術合成子鏈的方向是5→3,引物是與子鏈連接的DNA單鏈或RNA鏈,所以應在引物的5端加上限制性酶切位點。為保證DNA片段能定向插入表達載體中,避免DNA片段和載體自身環(huán)化以及DNA片段和表達載體任意拼接,常在兩條引物上設計不同的限制性酶切位點。(3)引物與模板鏈結合屬于復性,所以復性溫度的設定與引物有關,擴增片段屬于延伸,擴增片段的長度與延伸的時間有關。(4)密碼子是指mRNA上3個相連的堿基,虛線框內有24個堿基,共構成8個密碼子。虛線框后第一個密碼子的第一個堿基是U,共可構成的密碼子種類有44=16(種),又因圖中堿基序列僅是編碼α-淀粉酶的mRNA的一部分,此密碼子不可能是終止密碼子(3種,UAA、UAG、UGA),所以虛線框后的第一個密碼子共有13種。(5)根據表格數(shù)據可知,α-淀粉酶活性最高時的條件是pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl。 6.大豆花葉病毒(RNA病毒)是世界性大豆病害,是造成大豆減產的重要原因。某科研小組制備了大豆花葉病毒的空衣殼蛋白(CP蛋白),生產過程大致如下,請回答問題。 (1)圖中的①是指　　　　　。 (2)過程Ⅱ中應用的酶是　　　　　　　　　　　　。此過程中先要在大豆花葉病毒的基因文庫中查找　　　　　　　　　　　　　　　　的核苷酸序列,以便合成特異性引物。 (3)在上述生產流程中,　　　(填序號)是基因工程生產CP衣殼蛋白的核心步驟。為檢測樣液中是否含有有效成分,在過程Ⅶ中可使用　　　　　　　　　　　　　進行檢測。 答案 (1)RNA　 (2)Taq DNA聚合酶　CP蛋白基因(控制CP蛋白合成的RNA片段) (3)Ⅲ　CP蛋白的抗體 解析 (1)因為通過Ⅰ獲得的是cDNA,所以①是RNA,過程Ⅰ是逆轉錄。(2)過程Ⅱ是PCR擴增,在該技術中需要用到耐高溫的Taq DNA聚合酶。在該過程中,需要先知道目的基因,即CP蛋白基因的核苷酸序列,才能合成特異性引物。(3)在基因工程中基因表達載體的構建是核心,即步驟Ⅲ是核心步驟。為了檢測樣液中是否含有有效成分,在過程Ⅶ中可以用抗原—抗體雜交,即使用CP蛋白的抗體進行檢測。如果出現(xiàn)了雜交帶,則說明含有有效成分。