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1、蛋白質工程的研究進展與應用 摘要：蛋白質是生命活動的主要承擔者，是參與生物生長，發(fā)育，代謝，繁殖的重要生物大分子。隨著生物化學及分子生物學的發(fā)展，蛋白質工程被廣泛研究，通過物理，化學，分子生物學等手段對現(xiàn)有的蛋白質進行改造、修飾從而優(yōu)化其性質，或合成自然界中不存在的具有新功能的蛋白質，可更好地滿足人們的需要。蛋白質工程技術已在藥物研發(fā)，農業(yè)生產等領域廣泛應用，并取得了顯著成效，本文綜述了蛋白質工程的原理，方法，研究進展及應用，并展望其發(fā)展前景。旨在強調其在生物科學領域深遠的研究意義及重要的應用價值。 關鍵詞：蛋白質工程，分子生物學，定點突變，定向演化 Research progr

2、ess and application of protein engineering Abstract: Protein is the main undertaker of life activities and an important biological macromolecule involved in biological growth, development, metabolism and reproduction. With the development of biochemistry and molecular biology, protein engineering

3、 has been widely studied. It can better meet the needs of people through physical, chemical, molecular biology and other means to modify and modify the existing proteins to optimize their properties, or to synthesize proteins with new functions that do not exist in nature. Protein engineering techno

4、logy has been widely used in drug research and development, agricultural production and other fields, and achieved remarkable results. In this paper, the principle, method, research progress and application of protein engineering were reviewed, and its development prospect was prospected. The purpos

5、e was to emphasize its profound research significance and important application value in the field of biological science. Keywords: Protein engineering; molecular biology; site-directed mutation; directed evolution 引言 蛋白質工程是以蛋白質的分子結構與生物功能的關系為基礎，利用物理，化學及分子生物學等手段進行基因修飾或基因合成，從而獲得經改造后功能更加完善的蛋白質，或自然

6、中原本不存在的新功能的蛋白質。蛋白質工程操作基于基因工程技術，故被廣泛稱為第二代基因工程。該技術的發(fā)展依賴于基因組測序的順利進展及對蛋白質的化學組成、空間結構及生物功能關系研究的理論突破。蛋白質工程的基本研究策略是：在現(xiàn)有蛋白質結構與功能信息的基礎上，從預期蛋白質的功能出發(fā)，對蛋白質進行修飾，改造及分子設計，從而表達人類需要的功能蛋白質分子，既實現(xiàn)了蛋白質工程的目標。 1 蛋白質工程原理 蛋白質工程技術的核心操作即為對蛋白質分子進行改造，這種改造可以在蛋白質水平上進行，也可以在基因水平上進行。在蛋白質水平上對其進行改造，涉及到了對蛋白質分子的加工和修飾等操作，如：磷酸化，糖基化，泛素化等

7、，需用到生物化學原理及方法，但由于該類修飾結果較為局限，缺乏特異性，且反應條件難以掌控等弊端，限制它的發(fā)展。而在基因水平對蛋白質分子進行改造操作簡便，且針對性強，結果多樣，在現(xiàn)代其他分子生物學技術的輔助下，具有廣闊的發(fā)展前景。通過嚴格的分子設計，利用基因工程手段，將蛋白質分子定向改造成為具有預期性能的蛋白質，可分為兩類改造，一類是現(xiàn)有的天然蛋白質進行改造，另一類是完全重新設計新的蛋白質分子。改造天然白質分子可以分為對少數(shù)幾個氨基酸殘基進行替換（小改），對蛋白質分子的一小段多肽或結構域進行改造或替換即分子剪裁（中改），以及局部重建（大改），在蛋白質工程研究及應用中，“小改”及“中改”較為常見。而

8、設計全新的蛋白質分子，需要有完備的蛋白質分子結構及功能的數(shù)據(jù)庫，并且對它們有著十分全面的了解，該技術研究現(xiàn)在處于不成熟階段，通過深入的基礎研究，可有廣闊的發(fā)展空間。 蛋白質工程的主要技術科分為理性分子設計和非理性分子設計。理性分子設計主要是利用定點誘變技術，在已知DNA序列的特定位點改變核苷酸或核苷酸片段，從而有針對性的獲得預期特性的蛋白質分子。非理性分子設計，又稱定向演化，這種方法通過人為制造進化條件，體外改造目的基因，并進行定向篩選，從而獲得預期性能的蛋白質分子。 2 蛋白質工程技術分類 2.1 定點突變技術 定點突變（site-directed mutagenesis）技術是

9、根據(jù)已知蛋白質分子結構和功能，利用分子生物學等手段，使特定位點的基因突變，從而有針對性的改變分子的活性基團，核苷酸及DNA片段，從而改造蛋白質分子，使其獲得預期性質與功能[1-2]。該技術為蛋白質工程常用的操作手段，具有特異性強，重復性好，及操作簡便等優(yōu)點。在生物醫(yī)藥的開發(fā)以及工業(yè)酶制劑的生產等領域均有廣泛的應用，其主要作用為調節(jié)蛋白質分子的活性，穩(wěn)定性；改善酶蛋白質的催化能力，專一性，親和力及作用條件等，且定點突變是研究蛋白質分子序列，結構與功能關系及作用機制的重要手段。其在生物醫(yī)療，藥物開發(fā)等領域的應用實例有很多。L-天冬酰胺酶是治療急性粒細胞型白血病的靜脈注射或靜滴藥品，但其在臨床使用中

10、常會引起過敏反應，限制了它的廣泛應用。吳梧桐[3]利用生物信息學技術對該酶蛋白的結構分析并預測，確定了決定抗原表位的氨基酸序列，采用定點突變技術對該區(qū)域進行改造，并重組表達，獲得了免疫原性低且酶活性高的蛋白質工程酶蛋白，完善了該類藥物的應用。納豆激酶是一種具有溶解纖維蛋白活性的絲氨酸蛋白酶，其被廣泛用于治療心血管疾病類藥物的開發(fā)，但其在應用中存在極易被氧化，且穩(wěn)定性差等缺點，Weng[4]等，在對該酶序列及結構研究的基礎上，對其進行定點突變，使納豆激酶中原本暴露的222位蛋氨酸殘基變?yōu)殡[蔽的構像，從而提高酶的抗氧化活性，有利于應用中藥物的穩(wěn)定效用。利用定點突變對蛋白質序列，結構與功能的基礎研究

11、，也有許多成功的例子，亮氨酸氨肽酶（LAP）是一種肽鏈端解酶，其作用于肽鏈可使氨基末端氨基酸逐個游離，廣泛用于醫(yī)藥及食品等領域中，Chi[5]等，通過計算機模擬以及定點突變等技術，成功分析出了Ala348和Gly350這兩個緊靠協(xié)調配體的氨基酸殘基，是該酶維持其催化活性所必須的結構，此外，通過定點突變技術對該酶的催化機制也有所解析。定點突變技術在使用過程中逐步優(yōu)化創(chuàng)新，以提高其效率及準確性，Carapito[6]等發(fā)明了一種包含六個廣泛適用自動液態(tài)處理系統(tǒng)環(huán)節(jié)的方法，該方法可自動快捷且高通量地實現(xiàn)定點突變，蛋白質純化及鑒定等流程，可快速高效地獲得目的產物，使蛋白質工程技術獲得了新的突破。定點突

12、變技術的應用雖然取得了一些成功，但由于其應用需對蛋白質序列及結構有詳細的了解，且對于一般蛋白質僅改變一個或幾個氨基酸，很難使其三維高級結構發(fā)生較大變化，從而蛋白質功能也不會發(fā)生很大改變[7-8]，導致定點突變技術發(fā)展受限，所以在定點突變技術的基礎上通過對其本身的操作及方法進行優(yōu)化，并與其他技術聯(lián)合使用，可提升它的利用價值及應用效率，使其得到更好的發(fā)展。 2.2 定向演化技術 定向演化又稱非理性蛋白質進化，體外分子定向進化。這種技術利用進化的原理，在實驗室中模擬自然進化（隨機突變，DNA重組，自然選擇等）的條件，通過分子生物學技術（易錯PCR，DNA改組等）對待改造蛋白的基因進行誘變處理，

13、增加其多樣性，并結合高通量篩選及壓力選擇等方法，定向篩選出性質及功能符合需求的蛋白質，經過多輪選擇，即可獲得具預期特征的新型蛋白質。與定向誘變技術相比該方法不需要已知蛋白質結構，功能位點及工作機理等特征，且可獲得的蛋白質類型多樣，是一種很有發(fā)展前景的蛋白質工程技術。該技術主要用于優(yōu)化蛋白質的性質，如提高蛋白質的穩(wěn)定性，提高酶的催化活性，改變酶的作用底物及作用環(huán)境等，此外定向演化技術還可以為蛋白質演化的研究提供寶貴的數(shù)據(jù)。2018年，F(xiàn)rances Arnoldy因在蛋白質定向演化領域做出了杰出貢獻而獲得了諾貝爾化學獎，Arnold研究組成功的通過易錯PCR誘變并篩選獲得了改造的枯草桿菌蛋白酶，

14、使其可在高濃度的DMF環(huán)境中有效地發(fā)揮催化作用[9]，從而高效地合成某些高分子化合物，在工業(yè)上產生了巨大的經濟價值。該團隊還獲得了逆轉底物對映體選擇的海因酶，該酶可以L-對映體（L-5-（2-甲硫基乙基）-海因（L-MTEH))為底物合成L-甲硫氨酸[10]，在工業(yè)上具有重要的意義，該成果的取得，是利用了定向演化與定向誘變結合的技術，通過易錯PCR對相關功能位點進行粗篩，獲得關鍵序列后，再以飽和突變的方式定向的獲得目的蛋白，為開創(chuàng)性的研究思路，在該領域的其他研究具有啟發(fā)作用。此外，Arnold研究組通過DNA改組技術改造了類胡蘿卜素合成通路上的酶，從而獲得了新型的類胡蘿卜素，并首次鑒定出了能直

15、接通過環(huán)化3，4-脫氫番茄紅素合成紅酵母烯的酶[11]，該研究對腫瘤及慢性病的治療具有深遠意義。定向演化的主要技術有兩種，它們有各自的優(yōu)缺點，在蛋白質工程的研究中具不同的適應情況。 2.2.1 易錯PCR 易錯PCR是利用PCR反應中所用到的Taq酶不具有3’-5’的外切酶活性，即無糾錯活性，從而通過制造適當?shù)臈l件，使DNA在擴增時出現(xiàn)堿基錯配，導致基因突變。該反應通過改變PCR反應的原條件如改變四種dNTP的比例，用dITP替代dNTP，及在反應體系中增加鎂離子濃度，加入錳離子等，使PCR反應以較低的比率引入隨機突變，再經過篩選，并進行連續(xù)易錯PCR，可獲得有益突變積累的目的蛋白質[1

16、2-14]。應用易錯PCR成功獲得性能良好的蛋白質的例子有很多，如對D-氨基酸工業(yè)化生產具有重要意義的耐熱突變酶N-氨甲酰基-D-氨基酸氨基水解酶（DCase），D-氨基酸為許多抗生素，多肽類激素的合成原料，工業(yè)上常用DCase合成，而該酶由于熱穩(wěn)定性差，需經多次固定化酶的作用才能穩(wěn)定生效，因而增加了其生產成本并破壞了其產品質量。Yu[15]等通過易錯PCR技術誘變該酶基因，并經過篩選獲得耐熱性提高了7℃的DCase突變體，該蛋白質工程酶的獲得可為D-氨基酸的合成節(jié)省很大的成本。此外，有研究組利用易錯PCR鑒定出了新的抗原決定簇，為相應蛋白類疫苗的開發(fā)提供了新的參考，Tsai[16]等，通過易

17、錯PCR獲得突變文庫并結合負性篩選方法，鑒定出了蟑螂變應原Per al抗原決定簇，該抗原決定簇的獲得方式較為創(chuàng)新，對免疫學的發(fā)展具有一定價值。 2.2.2 DNA改組 DNA改組（DNA shuffling)也稱有性PCR，該技術主要操作為，將一組同源但有差異的蛋白質編碼基因，利用脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNAase Ⅰ）或超聲波技術隨機斷裂成DNA小片段，通過小片段之間隨機出現(xiàn)的重疊，使這些片段在無外加引物的條件下PCR擴增，由于擴增模板隨機，幾輪PCR過后便獲得具有不同系譜間基因重組的DNA片段，最終組裝成完整的DNA序列，從而通過模擬自然演化獲得重組的DNA分子[17-18]。該技術改

18、善了其他方法隨機性較大的弊端，將相關性片段的有益突變重組，廣泛用于蛋白質性質的優(yōu)化及酶特性的改良[19]，通過該技術已成功優(yōu)化了β-葡萄糖苷酶，β-內酰胺酶，脂肪酶，綠色熒光蛋白等，并在應用中獲得了顯著成效。在免疫學領域，Locher[20]等，采用了DNA改組的方法對腦炎α-病毒，HIV-1，登革熱病毒，惡性瘧原蟲，乙型肝炎病毒的不同血清性的編碼抗原決定簇的基因進行重組，從而獲得了新型嵌合體疫苗，該疫苗具有交叉保護性，相比于針對特定血清型的疫苗具有更大的實用潛力。該技術在實踐中不斷發(fā)展，又衍生出了外顯子改組技術（exon shuffling），家族改組技術（family shuffling）

19、，交錯延伸重組法[21]（staggered extension process,StEP），RPR法[22]（Random-Priming Recombination DNA Shuffling）,過渡模板隨機嵌合技術（random chimeragenesis on transient templates，ACHITT），基因組改組技術[23]（whole-Genome shuffling），以及體外異源雜交和體內修復[24]，非同源重組（Nonhomologous Recombination）技術等，這些技術不同程度的優(yōu)化了DNA改組技術，且有不同的適用范圍及條件，這些技術的革新也使蛋白

20、質工程獲得了巨大的發(fā)展。 3 轉運RNA介導蛋白質工程 轉運RNA介導的蛋白質工程（tRNA-mediated protein engineering），也稱為定點非氨基酸替代法（site-directed non-natural amino acid replacement,SNAAR），該技術痛過生物化學等方法把轉運RNA攜帶的天然氨基酸換為人工設計或改造的非天然氨基酸，并在特定位點摻入，選擇性的對目的蛋白的編碼基因改良，隨后合成非天然蛋白質[25]。目前利用轉運RNA介導，已實現(xiàn)將幾十種非天然氨基酸摻入到蛋白質中，并在蛋白質結構與功能的探究，鑒別等方面有一定應用，具有很大的發(fā)展?jié)摿?/p>

21、[26]。 4 總結與展望 蛋白質工程作為多學科融合的研究領域，越來越廣泛的被科研人員所關注，已在基礎研究，技術革新，應用實踐等取得了較大的突破。蛋白質工程結合了多種新興的技術，改變目的蛋白質的特性，具有理性，高效性，經濟性，創(chuàng)新性等優(yōu)點，具有深遠的研究價值。蛋白質工程已廣泛應用于生物藥物研發(fā)，工業(yè)酶制劑優(yōu)化等領域。未來蛋白質工程的發(fā)展方向會在蛋白質結構與功能的精細研究，以及蛋白質改造技術的優(yōu)化升級等方面，創(chuàng)造出新結構，新功能，新特性的蛋白質，為生命科學領域提供新的發(fā)展動力與創(chuàng)新機遇。  [參考文獻] [1] 張新國，陳文潔，曾艷龍 等.蛋白質工程技術及其在生物藥

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