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1,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),2,1.動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)與培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn) 進(jìn)化程度高 結(jié)構(gòu)、形態(tài)、成分復(fù)雜 細(xì)胞間連接形式多樣 生長(zhǎng)相對(duì)緩慢 功能全面,3,1.1 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征,Hepatocytes,4,體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,（一）貼附型成纖維細(xì)胞型上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞 （二）懸浮型 （三）半貼壁型,5,（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞 貼附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式 結(jié)果: 基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長(zhǎng)。 培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于貼附型細(xì)胞 貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有貼附于固相表面才能生存的細(xì)胞,6,細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式：存在差異 體內(nèi)：貼附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外 形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同 貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料 按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型,7,1、成纖維細(xì)胞型：,8,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的 來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中有卵圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起,9,2、上皮型細(xì)胞：,10,名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同 來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, 如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),11,3、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 4、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,12,（二）懸浮型：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng) 來源：自血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞 特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn)：純化不方便，不能通過離心將死、活細(xì)胞分離,13,14,,無菌無毒害的環(huán)境,1,,支持生長(zhǎng)增殖的營養(yǎng),2,,其它類似體內(nèi)的環(huán)境,3,,維持細(xì)胞性狀,4,1.2 細(xì)胞培養(yǎng)總原則,15,(一) 細(xì)胞培養(yǎng)無菌無毒環(huán)境,實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合理 常用設(shè)施及設(shè)備 培養(yǎng)器皿：透明度好、無毒、利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。,16,17,細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù),工作環(huán)境及表面的處理細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞的處理,18,(二) 細(xì)胞的營養(yǎng),培養(yǎng)基：合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。血清：血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營養(yǎng)成分 。其它成分（條件培養(yǎng)基）,19,合成培養(yǎng)基的主要成分,氨基酸 碳水化合物 無機(jī)鹽 維生素 其它輔助物質(zhì),培養(yǎng)基種類,RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型） DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型） DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型） McCoys 5A M199 F12,20,血清,牛血清、馬血清、人血清 （1）儲(chǔ)存于-20℃ — - 70℃ 低溫冰箱中 （2）一般廠商提供的血清為無菌 （3）熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清，目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement）滅活 （4）血清中的沉淀物絮狀物，可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。,21,其它常用液體試劑,Hank’s D-Hank’s PBS NaHCO3（ 7.5% ） 胰酶溶液（0.25%）,22,(三) 其它類似體內(nèi)的環(huán)境,溫度 氣體 滲透壓 氫離子濃度(PH) 其他,23,(四)合理的計(jì)劃，維持細(xì)胞性狀,,,盡早凍存原代細(xì)胞，復(fù)蘇后狀態(tài)恢復(fù)的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細(xì)胞 需要做實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞要選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 防止細(xì)胞污染，如遇污染，及時(shí)處理,24,一、細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì) 胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能 因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常見的有革蘭氏陽性菌。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改 變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下 發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后 細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓 脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。,25,二、真菌污染 真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié) 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔 子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的 小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下 可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基 中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊 和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶 用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相 混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒 性作用而使細(xì)胞脫落死亡。,26,三、支原體污染 支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微 生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除 它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā) 現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對(duì)青霉素 有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。 電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子 密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。 培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生 長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì) 胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理， 還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。,27,四、病毒污染采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在 病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原 代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗 是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病 毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn) 化，形成異倍體的細(xì)胞系。,28,五、非同種細(xì)胞污染 由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒 有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一 種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞 的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的， 而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā) 生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底 而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。,29,常用的排除微生物污染的方法,抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)物，有時(shí)可能奏效。 加溫除菌：根據(jù)支原體不耐熱的特點(diǎn)，可將受支原體污染的細(xì)胞至于41攝氏度作用5～10h（最長(zhǎng)可達(dá)18h），以殺滅支原體。 動(dòng)物體內(nèi)接種：受污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔內(nèi)，利用動(dòng)物的免疫功能消滅污染的微生物，而腫瘤細(xì)胞卻能在動(dòng)物體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間后從體內(nèi)取出腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng) 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：巨噬細(xì)胞在體外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用這一特點(diǎn)，可將少量的污染細(xì)胞與足夠量的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，從而消除污染。,30,1.3 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程,幼齡動(dòng)物,取動(dòng)物器官 和組織,剪碎組織,胰蛋白酶處理,細(xì)胞培養(yǎng),單個(gè)細(xì)胞,31,如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；,遺傳物質(zhì)改變,遺傳物質(zhì)未改變,32,原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。,有關(guān)概念,33,細(xì)胞的原代培養(yǎng),將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng) 各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì) 胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以 生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。,34,組織塊直接培養(yǎng)法（機(jī)械法）,1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時(shí)間不能過長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。 2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。 3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1-2mm），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中 4、將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面 5、翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng),35,胰酶消化法,1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時(shí)間不能過長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。 2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。 3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。 4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次. 5、加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細(xì)胞。 6、靜置，使未分散的組織塊下沉。 7、吸取上層細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。,36,（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期 在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。,37,1．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)） 特點(diǎn)：1一4周、細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)、可見細(xì)胞分裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上與體內(nèi)原組織相似性、多呈二倍體核型 細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。,38,2．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。,39,3．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。 在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。,40,細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖 能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連 續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二 期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核 型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法 誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì) 胞永生性和惡性性非同一性狀。,41,（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,所謂細(xì)胞“一代”一詞，系指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代或倍增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：,?,潛伏期 指數(shù)生長(zhǎng)期 停滯期,42,1．潛伏期：,43,過程: 游離:懸浮,胞質(zhì)回縮, 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形 吸附:貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁 潛伏期:可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無增殖, 少 見分裂相,44,影響因素：潛伏期的長(zhǎng)短與：細(xì)胞種類 接種的細(xì)胞密度 培養(yǎng)條件,45,1.細(xì)胞類型 傳代培養(yǎng)的細(xì)胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞6-24h;原代24-96h或更長(zhǎng) 單個(gè)細(xì)胞快,細(xì)胞大團(tuán)慢,組織塊慢 連續(xù)細(xì)胞系與發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(6-24h)比有限細(xì)胞系與正常二倍體細(xì)胞的短 來源：胚胎組織:短,2天可見細(xì)胞生長(zhǎng)，成體:長(zhǎng),46,2.細(xì)胞密度 密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會(huì)較長(zhǎng) 3.培養(yǎng)條件 培養(yǎng)液、pH底物、污染,有毒,47,2．指數(shù)增生期：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。,48,特點(diǎn)： 是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞群體均一是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞,接觸抑制 密度抑制,49,3．停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡,50,特點(diǎn) (1)細(xì)胞數(shù)量： 細(xì)胞達(dá)飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。 (2)細(xì)胞活動(dòng)小 (3)生長(zhǎng)組分下降 (4)及時(shí)傳代：細(xì)胞已中毒，即使傳代，也會(huì)影響下一代細(xì)胞的功能狀況,51,潛伏期,指數(shù)生長(zhǎng)期,停滯期,52,細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定,培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。,53,細(xì)胞計(jì)數(shù)原理,,54,細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟,1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 3、靜置3分鐘。 4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000 注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。,55,請(qǐng)計(jì)算一下~~~~~~~~~~~~,細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)需要效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為20：1 且靶細(xì)胞需要1x104/TEST。 現(xiàn)有效應(yīng)細(xì)胞10ml，取100ul效應(yīng)細(xì)胞加入900ul PBS中，混勻后記數(shù)，細(xì)胞濃度為2x104/ml。 靶細(xì)胞也有10ml，經(jīng)記數(shù)，細(xì)胞濃度為1x105/ml。效應(yīng)細(xì)胞共有多少？靶細(xì)胞共有多少？ 以現(xiàn)有的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，能做幾個(gè)TEST？,56,細(xì)胞活力測(cè)定步驟,1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。 2、加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘。 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。 4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。 死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。 活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。,57,哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存,主要目的： （1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。 （2）降低人力和物力 （3）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。 （4）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)變 （5）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變,58,冷凍保存要點(diǎn),（1）冷凍過程要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1 到 -3℃速度降溫，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存 （2）凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無微生物污染。 （3）細(xì)胞濃度控制在：1×106－1×107/ml。 （4）使用高濃度血清（30%） （5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（DMSO、甘油） 細(xì)胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑（5- 10%，培養(yǎng)基（60%），血清（30%）。,59,細(xì)胞凍存實(shí)用程序,收集細(xì)胞 凍存液重懸分裝入凍存管106-107/mL 4 ℃ 40min -20 ℃ 30-60 min -30 ℃ 30min -80 ℃ 過夜 液氮罐保存并記錄,60,冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇,（1）快速解凍 （2）解凍操作過程動(dòng)作要輕 特別注意： 解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷 冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染,61,解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法:,從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴中快速解凍。 將1－2ml 凍存細(xì)胞液加入到25ml 新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，輕輕混勻。 用80g 離心2－3 分鐘（800-1000rpm 5min），棄上清液。 用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。 接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度不低于3×105/ml。24-48h 后換液。,62,1.4 體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,細(xì)胞系 細(xì)胞株 二倍體細(xì)胞 遺傳缺陷細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞,63,（一）細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。 如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系 已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系。,64,（二）細(xì)胞株 從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株,65,（三）二倍體細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75％或80％以上）的細(xì)胞群，稱二倍體細(xì)胞。 如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。 為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或2～5代即大量?jī)龃孀鳛樵N。,66,（四）遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,67,（五）腫瘤細(xì)胞系或株 這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,68,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌） CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary） 宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立 NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／毫升。,69,細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用,ATCC入庫細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下： http://www.atcc.org 培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等 凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱 細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性 培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量,70,細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性 核 型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無 無污染檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等 物種檢測(cè)：檢測(cè)同工酶，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè) 免疫檢測(cè)：一兩種血清學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測(cè)者姓名,71,72,73,74,75,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡:是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺，由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過程。細(xì)胞程序性死亡 （programmed cell death，PCD）: 指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。,76,細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別,——————————————————,壞死 凋亡,1.性質(zhì) 病理性，非特異性 ,非遺傳性 生理性或病理性，特異性遺傳性 2.誘導(dǎo)因素 強(qiáng)烈刺激（極端環(huán)境），隨機(jī)發(fā)生 較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生 3.生化特點(diǎn) 被動(dòng)過程，無新蛋白合成， 主動(dòng)過程，有新蛋白合成，不耗能 耗能 4.形態(tài)變化 細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、 胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整細(xì)胞腫脹 細(xì)胞皺縮，核固縮 5.DNA電泳 彌散性降解，電泳呈均一 DNA片段化（180-200bp），DNA片狀 電泳呈“梯”狀條帶 6.炎癥反應(yīng) 溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng) 溶酶體相對(duì)完整，局部無炎癥反應(yīng) 7.凋亡小體 無 有 8.基因調(diào)控 無 有,77,78,常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè) 磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè) DNA片斷化檢測(cè) TUNEL法 Caspase-3活性的檢測(cè) 凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析,79,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè),80,磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）,磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中.Annexin-V是一種分子量為35～36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。 碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。 因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋 亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來,81,Annexin V-FITC Fluorescence,PI Fluorescence,Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium,82,83,線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè),線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。 線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。,84,DNA片斷化檢測(cè),細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化 特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃 縮，染色質(zhì)DNA在核小 體單位之間的連接處斷 裂，形成50～300kbp長(zhǎng) 的DNA大片段，或 180～200bp整數(shù)倍的寡 核苷酸片段，在凝膠電 泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖 譜（DNA ladder）。,85,TUNEL法,細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂 而產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，可在脫氧核糖核 苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖 核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生 物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3‘-末端，從而 可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖 核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。,86,87,2.干細(xì)胞,88,什么是干細(xì)胞?干細(xì)胞是具有無限期產(chǎn)生各種分化細(xì)胞能力的細(xì)胞。它是各種干細(xì)胞的統(tǒng)稱。通常認(rèn)為干細(xì)胞有幾個(gè)主要特征：它們是未分化的，但具有分化成各種特定細(xì)胞的能力； 它們可無限地分裂產(chǎn)生大量后裔; 其子細(xì)胞有兩種命運(yùn)，保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。,89,干細(xì)胞分類,全能干細(xì)胞, 如受精卵 多能干細(xì)胞，如囊胚中的內(nèi)囊細(xì)胞 專能干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞,90,如何得到多能干細(xì)胞,91,干細(xì)胞培養(yǎng)過程,92,干細(xì)胞來源： (1)從發(fā)育良好的囊胚中分離內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞?ES細(xì)胞 (2) 從5-9周的胚胎生殖腺中分離出人的EG細(xì)胞（embryonic germinate cells） (3)惡性胚胎腫瘤或畸胎瘤細(xì)胞（embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治療性克?。后w細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（SCNT）去核卵細(xì)胞 + 體細(xì)胞核 ?克隆 ?囊胚 ?分離內(nèi)細(xì)胞群 ?ES細(xì)胞,93,干細(xì)胞的分離酶消化后培養(yǎng) 免疫方法去除滋養(yǎng)層細(xì)胞 流式細(xì)胞儀分離法,94,培養(yǎng)條件： (1) 特殊的培養(yǎng)液：用DMEM培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要，還要加非必須氨基酸；β-巰基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞。 (3) 必須加入LIF，抑制細(xì)胞分化。,95,干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的常用方法 （1）加入誘導(dǎo)細(xì)胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）將ES細(xì)胞與特定的細(xì)胞共培養(yǎng) （3）將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ES細(xì) 胞內(nèi),96,鑒定干細(xì)胞的常用方法： （1）細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu) （2）細(xì)胞功能 （3）細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志 （4）細(xì)胞內(nèi)特異基因的表達(dá),97,胚胎干細(xì)胞具有以下特點(diǎn)： (1) 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性高 (2) 端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三個(gè)胚層的細(xì)胞，將胚胎干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤 (6) 可誘導(dǎo)分化為各種成體干細(xì)胞,98,2002年3月，美國麻省理工學(xué)院的科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細(xì)胞培育出毛細(xì)血管，證明了胚胎干細(xì)胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。 目前已有報(bào)導(dǎo)ES細(xì)胞能在適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞等.,99,100,