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1、2022-1-26PCT膠體金試紙制備及其原理程駿2016年6月3號2022-1-262022-1-26膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（gold solution）：是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12），外層雙層正離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。2022-1-26二、膠體金的特性1、膠體性質(zhì)、膠體性質(zhì) 金顆粒直徑多在1100nm，穩(wěn)定、均勻、呈單一分散的狀態(tài)懸浮在溶液中；膠體金對電解質(zhì)的敏感性，易使膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)被破壞，使單一分散

2、的膠體金顆粒聚集成大顆粒，從溶液中沉淀下來。某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)具有保護(hù)膠體金、增強(qiáng)膠體金穩(wěn)定性的作用。2022-1-262、呈色性、呈色性 微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。最小的膠體金（25nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（1020nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（3080nm）則是紫紅色的2022-1-263、光吸收性、光吸收性 膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個光吸收峰的波長（max）在510550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的max偏向長波長，反之，小顆粒膠體金的max則偏于短波長。 膠體金的這一特性被用來檢測所配制的膠體金溶液是

3、否符合生產(chǎn)所需。實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)需要的合格的膠體金溶液的最大吸收波長應(yīng)在522528nm處，且檢測最大吸光度處吸光值與456nm處吸光度值的比值，應(yīng)在1.6-1.8之間。膠體金粒徑（膠體金粒徑（nm）1%檸檬酸三鈉加入量（檸檬酸三鈉加入量（ml）膠體金特性膠體金特性呈色max162.00橙色51824.51.50橙紅522411.00紅色52571.50.70紫色5352022-1-26三、免疫膠體金技術(shù)介紹1、免疫膠體金技術(shù)簡介、免疫膠體金技術(shù)簡介 免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，英文縮寫

4、為：GICT。 膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。 膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。 根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。2022-1-262、免疫膠體金原理、免疫膠體金

5、原理 免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。 膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與

6、葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。 2022-1-263、常用的免疫膠體金檢測技術(shù)常用的免疫膠體金檢測技術(shù)（1）免疫膠體金光鏡染色法（2）斑點(diǎn)免疫金滲濾法（3）膠體金免疫層析法 將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)

7、果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。2022-1-26四、PCT相關(guān)介紹1、PCT簡介簡介PCT（降鈣素原，procalcitonin）是一種蛋白質(zhì)，當(dāng)嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時它在血漿中的水平升高。自身免疫、過敏和病毒感染時PCT不會升高。局部有限的細(xì)菌感染、輕微的感染和慢性炎癥不會導(dǎo)致其升高。細(xì)菌內(nèi)毒素在誘導(dǎo)過程中擔(dān)任了至關(guān)重要的作用。血清降鈣素(CT)的前肽物質(zhì)分子量：14.5 kDa由116個氨基酸組成的糖蛋白質(zhì)無激素活性2022-1-262、PCT的指征的指征 PCT是診斷和監(jiān)測細(xì)菌炎性疾病感染的一個參數(shù)。 PCT的測定可以預(yù)示為：作為一個急性的

8、參數(shù)來鑒別診斷細(xì)菌性和非細(xì)菌性感染和炎癥。 監(jiān)測有感染危險的患者（如外科術(shù)后和器官移植后免疫抑制期，多處創(chuàng)傷后）以及需要重癥監(jiān)護(hù)患者，用來探測細(xì)菌感染的全身影響或檢測膿毒性并發(fā)癥。2022-1-26正常情況CT 降鈣素降鈣素膿毒血癥及促炎癥細(xì)胞因子PCT降鈣素原降鈣素原2022-1-26膿毒癥診斷的生物標(biāo)志物An Informal Categorization of Biomarkers of Sepsis Marker Diagnosis Prognosis Monitoring Procalcitonin Interleukin 6 White cell count Endotoxin C

9、-reactive protein HLA-DR Protein C IL-10 HMG-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 無論是對膿毒癥的診斷、預(yù)后評估及治療監(jiān)測，PCT都體現(xiàn)出最優(yōu)異的性能2022-1-263、PCT在臨床中的意義在臨床中的意義PCT反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度隨著疾病的進(jìn)展水平持續(xù)升高在感染疾病嚴(yán)重程度的發(fā)展過程中，PCT隨著嚴(yán)重程度的不同（局部感染、膿毒血癥、嚴(yán)重膿毒血癥、膿毒性休克），呈現(xiàn)由低到高的濃度變化。2022-1-26五、PCT膠體金試紙制備1、膠體金制備原理（、膠體金制備原理（氯金酸法） 氯

10、金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。HAuCl4 還原劑Au原子2022-1-26試劑和濃度還原劑形成膠體金的大小1%氯金酸水溶液白磷的二乙醚溶液5nm顆粒，紅色溶膠1%氯金酸水溶液抗壞血酸水溶液12nm顆粒，紅色溶膠1%氯金酸水溶液檸檬酸三鈉水溶液15150nm顆粒，紅色溶膠不同還原劑產(chǎn)生的膠體金這里主要談?wù)勚苽?040nm金顆粒，因?yàn)檫@種大小的金粒最適于快速診斷測試使用。2022-1-26配置樣品墊處理液配置金標(biāo)墊處理液配置膠體金粘膜配置劃膜液樣品墊處理切割噴金內(nèi)包大卡組裝金標(biāo)墊處理標(biāo)記抗體劃膜

11、外包入庫現(xiàn)場抽檢取樣送檢2022-1-262、配液前的準(zhǔn)備工作以及注意事項、配液前的準(zhǔn)備工作以及注意事項（1）由于氯金酸對金屬的強(qiáng)腐蝕性，因此，一切接觸氯金酸的物體都應(yīng)該為非金屬材質(zhì)。包括：稱量匙，以及配置膠體金時，磁力攪拌器上的溫度傳感器，以及ph計上的溫度傳感器。（2）所使用的玻璃器皿必須是清洗干凈，并且經(jīng)過重鉻酸鉀和硫酸浸泡過的。浸泡前用超純水清洗干凈，用毛刷刷干凈，干燥后用重鉻酸鉀和硫酸溶液浸泡24 小時以上，用清水沖洗3-4次，干燥待用。此種方法可以不需要硅化處理。如若玻璃器皿不干凈（有其他金屬離子存在或者灰塵）都將會影響金顆粒的形成，以及大小不均勻或者渾濁。2022-1-26（3）

12、由于氯金酸的對光敏感性，因此配制膠體金的整個過程都需要避光，或者弱光，避免使用日光燈等照明設(shè)施。氯金酸長時間儲存在光下容易變成黑色，影響結(jié)果的觀察。（4）氯金酸吸濕性極強(qiáng)，因此綜合考慮，為了減少稱量誤差等因素，稱量時，天平室將抽濕機(jī)打開，使空氣濕度降至30左右，同時采取減量法稱量。一般情況下，拆開后盡量一次配置完。（5）配制好的1的氯金酸溶液儲存在4冰箱里，黑色塑料袋封住避光。2022-1-263、PCT膠體金試紙樣品墊處理液配置膠體金試紙樣品墊處理液配置Borax4.44gCasein0.233gPvP-102.33g膽酸1.167gS-164.66gEDTA0.7g先用30% k2CO3

13、溶液將PH調(diào)節(jié)到9.0然后定容至233.3ml4保存，有效期兩年注：Borax硼酸，Casein酪蛋白，PvP-10聚乙烯吡咯烷酮，S-16惰性蛋白，EDTA乙二胺四乙酸先將水加熱至60 左右，依次加入S-16，攪拌溶解，冷卻至室溫，加入Borax 、PvP-10和膽酸，因?yàn)镃asein和EDTA不是很穩(wěn)定，需要最后加入。在未加入k2CO3碳酸鉀調(diào)節(jié)PH前會有一些沉淀不溶解，PH升高后會溶解，不需要奇怪。2022-1-264、PCT膠體金試紙金標(biāo)墊處理液配置膠體金試紙金標(biāo)墊處理液配置Na2HPO48.83gBSA6.25gTriton-x1001.25gPVA6.25g先用1M的HCL調(diào)節(jié)PH

14、至7.4然后加純水定容至1250ml4保存，有效期兩年注：BSA牛血清白蛋白，Triton-x100聚乙二醇辛基苯基醚，PVA聚乙烯醇先將水加熱至60 左右，加入Na2HPO4和PVA，冷卻至室溫，最后加入BSA和Triton-x100，攪拌溶解。 2022-1-265、PCT膠體金試紙樣品墊和金標(biāo)墊處理膠體金試紙樣品墊和金標(biāo)墊處理 樣品墊和金標(biāo)墊的處理方式一樣，都是將切割好的樣品墊（玻纖膜-有些脆，需小心）和金標(biāo)墊（聚酯膜）浸泡在處理液中1小時，使其徹底濕潤。（半小時需用鑷子翻一次面） 然后將浸泡好的膜放入烘干機(jī)內(nèi)37 烘干20小時（此時要記錄浸泡的膜的張數(shù)，處理液的剩余量，干燥室內(nèi)的溫度和

15、濕度），烘干后取出膜放入裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)備用，整個過程要在烘干箱內(nèi)完成。2022-1-266、配置膠體金、配置膠體金準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備的試劑：1% 氯金酸，1%檸檬酸三鈉（現(xiàn)配現(xiàn)用），超純水步驟：步驟：1、取100ml超純水于磁力攪拌器上加熱至80-90；2、加入2ml氯金酸溶液繼續(xù)加熱至沸騰（保持沸騰10s）（注意：當(dāng)氯金酸溶液加入后不可以再用金屬溫度傳感器，以防止損壞傳感器，污染溶液）；3、快速加入（取1%檸檬酸三鈉溶液3ml，超純水定容到10ml）上述燒瓶中，同時攪拌迅速，使其充分接觸反應(yīng)，繼續(xù)加熱，直至溶液沸騰，將加熱溫度降至105-110 （待確認(rèn)）保持沸騰反應(yīng)10min；4、停止加

16、熱，將燒瓶移至避光處，自然冷卻至室溫。（注意：整個過程都是避光的）2022-1-265、檢測1：待膠體金溶液冷卻至室溫，肉眼觀察膠體金溶液的顏色是不是酒紅色，是否澄清，無漂浮物或者沉淀。 檢測2：用分光光度計檢測吸光度：檢測最大吸光度值是否在525nm附近，方法是可以用光譜掃描法找到最大吸光度值波長，也可以用多波長測量法檢測525nm及其附近波長的吸光度，比較大小。最大吸光度值在525nm+3nm處為合格. 檢測3：檢測最大吸光度處吸光值與456nm處吸光度值的比值，是否在1.6-1.8之間。2022-1-26影響膠體金穩(wěn)定的因素：影響膠體金穩(wěn)定的因素：1、操作環(huán)境和所用容器的清潔度2、配制溶

17、液所用的水（均需使用雙蒸水或三蒸去離子水配制，燒制膠體金最好用去離子水）3、還原劑的使用量4、不同的燒制方法5、膠體金的制備量6、還原劑的加入方式7、加熱容器的大小8、加熱的時間2022-1-267、標(biāo)記膠體金、標(biāo)記膠體金1.取檢驗(yàn)合格的膠體金溶液100ml,用碳酸鉀（0.2mol）調(diào)節(jié)PH至7.2-7.4（大約400ul）（先用試紙測量，再用酸度計測量）室溫攪拌15min；2.加入1mg PCT鼠抗人單抗（使抗體終濃度為10ug/ml）,室溫攪拌30min；3.加入2ml 10%BSA封閉抗體,室溫攪拌30min；4.裝入2罐離心管，812000rpm離心20min；5.棄上清液，留沉淀。2

18、022-1-26蛋白通常帶有多種電荷，當(dāng)?shù)鞍讕д姇r，能與膠體金所帶的負(fù)電荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通過疏水作用將蛋白結(jié)合至金顆粒表面；有些蛋白則可通過半胱氨酸的巰基與金顆粒共軛連接。2022-1-26pH等于或稍偏于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)呈電中性，此時蛋白質(zhì)分子于膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，輕易吸附于金顆粒表明在低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，兩者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合膠體金溶液PH與蛋白質(zhì)結(jié)合金顆粒的關(guān)系2022-1-26

19、8、標(biāo)記膠體金復(fù)溶標(biāo)記膠體金復(fù)溶取1.5ml金標(biāo)復(fù)溶液溶解沉淀，使終濃度濃縮50倍（100ml膠體金溶液），加入固體蔗糖0.1g（根據(jù)實(shí)際的殘留沉淀量來定，m=殘留沉淀V*0.2）,使終濃度達(dá)20%。溶解混勻（總體積2ml,4保存）。膠體金復(fù)溶液配置膠體金復(fù)溶液配置100ml100mlTris0.243gBSA1.0g蔗糖20g海藻糖5gNaN3 0.10.05g調(diào)節(jié)PH至8.0，定容至100ml4 保存，有效期7天注： NaN3是劇毒化學(xué)品，取用需謹(jǐn)慎小心。2022-1-269、噴金、噴金1、清洗噴金泵，清洗結(jié)束，排空清洗液，調(diào)整噴筆位置，若溶液量較多時可以循環(huán)溶液，放慢循環(huán)速度，使其中不殘

20、留氣泡，否則影響局部噴量，使批內(nèi)差增大，甚至不合格。2、若溶液量較少時采取倒吸的方式，倒吸時使速度慢，防止氣泡進(jìn)入，影響噴量。3、根據(jù)金標(biāo)墊的切割寬度為6mm,所以每條噴量寬度應(yīng)不大于6mm，根據(jù)1.7ul/cm的噴量，保證均勻性，同時調(diào)整噴條中線的距離，方便切割。（金標(biāo)墊大規(guī)格84*300mm，可以噴金七條）4、噴金結(jié)束要將噴條干燥15-17h,密封保存。同時清洗泵和噴筆，使泵中留有清洗液，便于浸泡。2022-1-2610、粘膜、粘膜將25mm寬的NC膜粘在PVC底板上，注意粘膜時，粘膜位置是否對齊。NC膜是否干凈，無毛刺，無霉變2022-1-2611、配置劃膜工作液、配置劃膜工作液1、3%

21、海藻糖溶液的配制：用已配好的PBS溶液做溶劑，配制3%海藻糖溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。例：5mlPBS做溶劑，加入0.1499g海藻糖配置成3%海藻糖溶液，用玻璃棒攪拌2、劃膜工作液的配制：a:檢測線-T線（鼠抗人單抗配制 1ml 0.7mg/ml）例： b:質(zhì)控線-C線（羊抗鼠多抗配制 1ml 0.9mg/ml）例：2022-1-2612、劃膜、劃膜1、清洗劃膜泵，清空清洗液，循環(huán)或者倒吸劃膜液，使不要有氣泡；2、按照劃膜機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以“252”泵速（對應(yīng)速度1ul/cm），將質(zhì)控線液和檢測線液均勻地劃在膜上，檢測線劃在距膜頂端15mm0.1mm處，質(zhì)控線劃在距膜頂端9mm0.1mm處，質(zhì)控線與

22、檢測線相距6mm0.1mm。（NC膜靠近吸水紙一端為頂端）3、劃膜后37度干燥17-20h，干燥后鋁箔袋封存。注意點(diǎn)：劃膜時注意兩劃膜線的距離是不是6mm，劃膜是否有不均勻或者段線的地方。劃膜量控制為1ul/cm。裝袋要在干燥箱中進(jìn)行。2022-1-2613、切割和組裝、切割和組裝1、各組分用切割機(jī)切割成以下大?。?金標(biāo)墊：6mm 300mm 樣品墊：19mm300mm 吸水墊：17mm300mm2、組裝大卡：金標(biāo)墊1片，搭上NC膜3-4mm ； 樣品墊1片，搭上金標(biāo)墊2mm； 吸水紙1片，搭上NC膜2mm。2022-1-2614、切條、切條1、組裝環(huán)境條件的控制在相對濕度30%以下，并所有組

23、件拆封后暴露于空氣中時間不超過2小時。2、按照切條工序作業(yè)指導(dǎo)書使用切條機(jī)，將組裝好的降鈣素原（PCT）檢測試劑條切割成寬度為3.42mm0.1mm試條，切條過程中應(yīng)于前、后及過程中每30分鐘對切條的寬度檢查一次。17mm19mm6mm10mm6mm9mm2022-1-2615、內(nèi)包、內(nèi)包1、檢測卡的裝配、檢測卡的裝配（1）按照不同規(guī)格的要求，需要進(jìn)行檢測卡裝配的試紙條先把切好的試紙條裝配到完好的PVC卡中，再用壓卡機(jī)進(jìn)行壓卡，裝條時應(yīng)注意檢查條有無劃痕污漬，寬度是否符合要求；（2）PVC卡外觀應(yīng)清潔，平整，無變形，底面配套性好，壓卡應(yīng)注意調(diào)節(jié)松緊度，避免將卡壓破或變形。2、裝袋、裝袋將壓好的

24、檢測卡裝入鋁箔袋中，一個鋁箔袋中應(yīng)有一個檢測卡，一包干燥劑，一個滴管，印上生產(chǎn)批號，生產(chǎn)日期和有效期。2022-1-2616、外包、外包將內(nèi)包好的鋁箔袋裝入包裝盒中，封膜包裝。2022-1-2617、入庫、入庫2022-1-2618、生產(chǎn)中的一些質(zhì)控點(diǎn)、生產(chǎn)中的一些質(zhì)控點(diǎn)1、NC膜檢測：外觀顏色：潔白，光澤，膜表面，邊緣 膜寬度：25+1mm 膜厚度：185+19um;235+40 跑水性能：4cm的時間有135s和90s，偏差為+-1s,國產(chǎn)120+-40s 蛋白承載量試驗(yàn)： 與pvc板的對比度試驗(yàn)：顏色2、定量產(chǎn)品抗體包被硝酸纖維素膜檢測： 外觀檢查：平整、潔凈、無破損 物理檢查：c、t線

25、 性能檢查：質(zhì)控品檢查 批內(nèi)差：1.7ng/ml檢查2022-1-263、（現(xiàn)場抽檢項）膠體金溶液檢測：外觀，最大吸收峰值，吸光度比值（最大吸收值與456nm處吸光度比值）4、（現(xiàn)場抽檢項）標(biāo)記膠體金溶液檢測：物理檢查，OD值5、（現(xiàn)場抽檢項）噴金條檢測 物理檢查：表面干燥，顏色紫紅色，均勻，金條之間無融合現(xiàn)象，斷點(diǎn)有標(biāo)記6、（現(xiàn)場抽檢項）劃膜條檢測 物理檢查：表面干燥，顏色均勻，T、C線間距穩(wěn)定在6mm，斷點(diǎn)有標(biāo)記7、（取樣送檢項）定量PCT大卡組裝檢測：外觀，膜條寬度，液體移行速度，最低檢測線，陰性特異性，陽性特異性，線性范圍，準(zhǔn)確度，批內(nèi)差8、（取樣送檢項）半成品檢測：不同規(guī)格的試劑制備

26、完成后，以PCT質(zhì)控品、PCT 陽性和陰性血清樣本進(jìn)行檢測，觀察試劑的性能。9、（取樣送檢項）定量PCT成品檢測2022-1-2619、相關(guān)知識、相關(guān)知識1、膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(m和s) m: 指的是膜孔徑 換算情況大致為：8m=135s；6m=180s 2、不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)的影響 通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。 135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. NC（硝酸纖維）膜的選擇（硝酸纖

27、維）膜的選擇2022-1-26膠體金免疫層析試紙模式膠體金免疫層析試紙模式1、雙抗體夾心模式：疫病抗原檢測判定檢測線 質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色2022-1-262、競爭模式：小分子物質(zhì)檢測判定檢測線 質(zhì)控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色2022-1-263、SPA/蛋白G模式：疫病抗體檢測判定檢測線 質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色2022-1-26膠體金調(diào)整正確的膠體金調(diào)整正確的pH值值 膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時

28、可用0.1M K2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1M HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可。2022-1-26Frens標(biāo)準(zhǔn)方法：（1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加熱煮沸，隨即快速加入1%檸檬酸三鈉溶液0.5mL；（2）約過25s沸騰的溶液變?yōu)榈{(lán)色，大約再過70s，藍(lán)色突然轉(zhuǎn)變?yōu)榱良t色；（3）繼續(xù)煮沸約5分鐘后結(jié)束反應(yīng)；（4）冷卻后用0.1M K2CO3溶液調(diào)至所需PH值；（5）此后再延長反應(yīng)時間或另加入額外的檸檬酸三鈉都不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該法制備得到的金顆粒直徑約為41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金顆粒，該方

29、法依然可行，唯一不同的是需要改變加入還原劑的量。另外，采用此標(biāo)準(zhǔn)方法所需反應(yīng)時間最短。附注：有研究者已經(jīng)注意到影響膠體金質(zhì)量及其穩(wěn)定性的幾種因素，制備過程中器具若全部使用干凈的玻璃器皿，溶液一律用0.2um濾膜過濾后使用，水用玻璃三蒸水，推薦使用超純水，采取這些措施后制得的膠體金很穩(wěn)定。這些措施表明即使很微量的污物都會對膠體金制備帶來不良影響。雖然經(jīng)常可見推薦使用硅化玻璃器皿的說法，其實(shí)使用普通玻璃器皿同樣也能制出高質(zhì)量高穩(wěn)定性的膠體金。2022-1-2630nm膠體金顆粒制備（參考彭伏虎膠體金試紙條檢測H9亞型禽流感病毒的研究和胡仁建HPV型免疫膠體金診斷試紙條的制備）取0.01%HAuCl4溶液200ml倒入500mL平底燒瓶中，加熱煮沸，快速加入3.6mL事先預(yù)熱至37 的1%檸檬酸三鈉溶液，再加熱15min，自然冷卻至室溫并補(bǔ)水至200ml，用0.1mol/L的K2CO3溶液調(diào)PH至8.2.2022-1-26待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb(單克隆抗體)時，調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA（蛋白A）時，調(diào)至5.96.2；標(biāo)記ConA（刀豆蛋白）時，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時，調(diào)至9102022-1-26THANKSTHANKS