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. 1 緒論 1-1何謂發(fā)酵？生物化學(xué)和工業(yè)上的發(fā)酵有何不同？ 生物化學(xué)意義上的發(fā)酵是指細胞在無氧條件下，分解葡萄糖或有機物產(chǎn)生能量的過程。 工業(yè)意義上的發(fā)酵是泛指利用培養(yǎng)細胞（包括動物、植物和微生物）獲得產(chǎn)物的任何有氧或無氧的過程。 1-2何謂發(fā)酵工程？其主要內(nèi)容是什么？請簡述其與生物技術(shù)的關(guān)系。 發(fā)酵工程是利用生物體為工業(yè)化生產(chǎn)服務(wù)的一門工程技術(shù)，即利用生物體的生命活動產(chǎn)生的酶，對無機或有機原料進行酶加工（生物反應(yīng)過程），獲得產(chǎn)品的工程化技術(shù)。 它是研究生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的一門學(xué)科，其主體包括生物反應(yīng)工程和產(chǎn)品提取、精制的下游工程。主要研究內(nèi)容： 1）優(yōu)良菌種的選育； 2）合適的生物反應(yīng)工程包括生物反應(yīng)過程的優(yōu)化、反應(yīng)器的選擇和下游工程 生物技術(shù)是應(yīng)用自然科學(xué)和工程學(xué)的原理，依靠生物催化劑（酶或細胞）的作用將物料進行加工以提供產(chǎn)品或為社會服務(wù)的技術(shù)。它包括基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、生化工程等五大工程。生物技術(shù)的核心是基因工程，但又離不開發(fā)酵工程。發(fā)酵工程是基因工程和酶工程的表達，即大部分生物工程的產(chǎn)品均要通過發(fā)酵工程來完成。所以說，發(fā)酵工程在生物工程中是最關(guān)鍵的過程?，F(xiàn)代發(fā)酵工程處于生物技術(shù)的中心地位，絕大多數(shù)生物技術(shù)的目標都是通過發(fā)酵工程來實現(xiàn)的。因此生物技術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域往往就是發(fā)酵工程的 研究對象。 1-3請簡述發(fā)酵工程的發(fā)展史。 1）基因工程出現(xiàn)之前的時代（1982年前）； 1859年發(fā)現(xiàn)發(fā)酵原理、設(shè)計了便于滅菌的密閉式發(fā)酵罐； 1929,1940年發(fā)現(xiàn)和分離出青霉素，青霉素發(fā)酵、將通氣攪拌引入發(fā)酵工業(yè)； 1956年谷氨酸等氨基酸、核苷酸等發(fā)酵成功、代謝控制育種理論的建立； 60年代采用烷烴、乙酸、天然氣等為原料的石油發(fā)酵； 2）基因工程出現(xiàn)后的時代（1982年后）。 80 年代隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們可定向選育高產(chǎn)菌株； 1991年綜述代謝工程，在對細胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上開始運用基因工程技術(shù)改造細胞代謝途徑，以改進細胞性能或提高產(chǎn)物生產(chǎn)能力。 組學(xué)的發(fā)展…… 系統(tǒng)工程和合成生物學(xué)…… 1-4 何謂初級代謝和次生代謝？舉例說明初級代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物 。 初級代謝：微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動的物質(zhì)和能量的過程稱為初級代謝。常見的初級代謝產(chǎn)物有：乙醇、氨基酸、呈味核苷酸、有機酸、多羥基化合物、多糖（黃原膠、結(jié)冷膠）、糖類和維生素。 次生代謝：是相對于初級代謝而言的一個概念。它是指微生物在一定的生長時期，以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對微生物的生命活動無必要功能的物質(zhì)的過程。次生代謝產(chǎn)物大都是分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。根據(jù)其作用，可將其分為抗生素、激素、生物堿、酶和毒素。 3 滅菌 3-1 滅菌的方法有哪幾種？ 化學(xué)藥劑滅菌（過氧乙酸、次氯酸鈉、二氧化氯、甲醛、過氧乙酸、環(huán)氧乙烷……） 射線滅菌（紫外線、高能電磁波、放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子） 干熱滅菌（160C，1h；主要由于氧化作用而死亡：微波加熱滅菌、烘箱加熱滅菌） 濕熱滅菌（120C，30min；利用飽和蒸汽滅菌） 過濾除菌（空氣除菌、料液的過濾除菌） 3-2 何謂空消和實消？各自操作如何？ 空消：培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌時，發(fā)酵罐需在培養(yǎng)基滅菌前直接通蒸汽進行空罐滅菌（進汽→關(guān)閥升壓→保壓30min→降壓后通入無菌空氣→冷卻）； 實消：實罐滅菌，即分批滅菌，將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其它裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用裝置一起進行滅菌。 3-3 連續(xù)滅菌流程有哪幾種？各自的特點是什么？ 連消塔—噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程：由連消泵、連消塔、維持罐和噴淋冷卻器組成 薄板換熱器連續(xù)滅菌流程：由3個薄板換熱器、維持管組成，節(jié)約了蒸汽和冷卻水 噴射加熱連續(xù)滅菌流程：由噴射加熱器、維持管、膨脹閥和真空冷卻器組成 3-4 簡述發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標準。 1.?連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣 ，VVM=0.1-2.0 ； 2.?空氣的壓力一般為0.2-0.4 Mpa; 3.?進入過濾器前空氣的相對濕度≤70% ； 4.?進入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高10-30C; 5.?過濾后空氣的無菌程度為10 -3。 3-5 空氣過濾除菌流程一般包括哪幾部分？各自的作用是什么？ 粗過濾器【去除大顆粒塵埃，粗過濾器分為布袋過濾器、油浴洗滌和水霧除塵器3種】→空氣壓縮機【供給能量】→貯罐【緩沖排氣壓力，穩(wěn)定氣壓】→油水分離器【去除壓縮空氣中的大顆粒油水霧】→空氣冷卻器【冷卻壓縮空氣，使其析出水汽】→水分離器【分離壓縮空氣的水汽】→加熱器【除水后相對濕度一般為100%，加熱以降至50-60%】→總過濾器【除菌，給全廠提供無菌空氣】→分過濾器【進一步除菌，保證各發(fā)酵罐空氣無菌】 3-6 某生物制藥廠采用空氣冷卻流程一制備無菌空氣，當?shù)乜諝庀鄬穸?0%?？諝膺M入總過濾器時的狀態(tài)是：相對濕度60%、壓力0.4MPa，溫度35C。通過計算確定，當?shù)貧鉁刈罡卟荒芨哂诙嗌伲浚?0、12、15、20、35C的飽和水蒸汽壓力分別為1228、1418、1705、2339、5615Pa） P1=0.1MPa，P2=0.4MPa， ?1= ?2 ，4Pb1=Pb2 ， 根據(jù)飽和蒸氣壓數(shù)據(jù)，得t < 12C 3-7 深層過濾除菌的機理是什么？請簡述其各自的作用機制。 深層過濾介質(zhì)的孔隙大于微生物。利用顆粒的慣性沖擊、布朗運動、顆粒與介質(zhì)的靜電引力、重力沉降等作用將細菌攔截在介質(zhì)中進行除菌。一般認為慣性、攔截和布朗運動的作用較大，而重力和靜電引力的作用較小。 慣性沖擊作用：當灰塵顆粒隨氣流前進遇到過濾介質(zhì)時，氣流受阻而改變方向，而顆粒因慣性作用仍沿直線向前運動，與纖維碰撞摩擦而吸附在纖維表面，以此攔截顆粒。 攔截滯留作用：在空氣流速較小時，微粒的流動與空氣流線相似，受纖維所阻時，改變方向，繞過纖維前進，并在纖維的周邊形成一層邊界滯流區(qū)。而滯流區(qū)的空氣流速更慢，進到滯流區(qū)的微粒慢慢靠近和接觸纖維，從而被粘附滯留。 布朗運動：在很小氣速和較小的纖維間隙時，則布朗擴散作用大大增加了微粒與纖維的接觸機會，從而將微粒截留住。 重力沉降作用：重力沉降作用是一個穩(wěn)定的分離作用。當微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就很容易沉降。大顆粒比小顆粒更易沉降；對小顆粒來說，只有氣速很慢時才起作用。一般它與攔截作用相配合，即在纖維的邊界滯流區(qū)內(nèi)，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。 靜電作用：干空氣與非導(dǎo)體的物質(zhì)（如過濾介質(zhì)纖維）間的相對運動摩擦，會產(chǎn)生誘導(dǎo)電荷。懸浮在空氣中的微生物微粒大多帶有不同的電荷，如枯草桿菌孢子20 % 帶正電荷，15 % 帶負電荷。這些帶電的微粒就會受異性電荷的物體吸引而沉降。 3-8 空氣過濾除菌的設(shè)備主要有哪些？各自的作用是什么？ 粗過濾器【去除大顆粒塵埃，粗過濾器分為布袋過濾器、油浴洗滌和水霧除塵器3種】→空氣壓縮機【供給能量】→貯罐【緩沖排氣壓力，穩(wěn)定氣壓】→油水分離器【去除壓縮空氣中的大顆粒油水霧】→空氣冷卻器【冷卻壓縮空氣，使其析出水汽】→水分離器【分離壓縮空氣的水汽】→加熱器【除水后相對濕度一般為100%，加熱以降至50-60%】→總過濾器【除菌，給全廠提供無菌空氣】→分過濾器【進一步除菌，保證各發(fā)酵罐空氣無菌】 4 發(fā)酵技術(shù) 4-1 發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)有哪些？各種技術(shù)的特點是什么？ 分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵 分批發(fā)酵：發(fā)酵液體積恒定，發(fā)酵液中物質(zhì)濃度隨時間而變化； 分批補料發(fā)酵：在分批發(fā)酵過程中，間隙或連續(xù)的補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術(shù)。由于只有料液的輸入，沒有輸出，因此，發(fā)酵液的體積在不斷增加； 半連續(xù)發(fā)酵：補料分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上加上間歇放掉部分發(fā)酵液（行業(yè)中稱為帶放）； 連續(xù)發(fā)酵：補料的同時放走發(fā)酵液，發(fā)酵液體積不變。 4-2 ?請簡述分批培養(yǎng)過程微生物細胞的典型生長曲線及其每個階段的特點 。 停滯期：剛接種后的一段時間內(nèi)，因菌種對新的生長環(huán)境有一適應(yīng)過程，細胞數(shù)目和菌量不變的過程 加速期：通常很短，比生長速率可在短時間內(nèi)從最小升到最大值。 對數(shù)期：細胞已完全適應(yīng)其周圍環(huán)境后，便進入恒定的對數(shù)或指數(shù)生長期。 減速期：隨著養(yǎng)分的減少，有害代謝物的積累，生長不可能再無限制地繼續(xù)。這時雖然細胞量仍舊在增加，但其比生長速率不斷下降，細胞在代謝與形態(tài)方面逐漸蛻化。 平衡期：實際上是一種生長和死亡的動態(tài)平衡，【比生長速率】 =α【比死亡速率】，凈生長速率等于零。由于此時菌體的次級代謝十分活躍，許多次級代謝產(chǎn)物在此時大量合成，菌的形態(tài)也發(fā)生較大的變化（如菌體分化，染色變淺，形成空胞等）。 死亡期：當養(yǎng)分耗竭，對生長有害代謝物在發(fā)酵液中大量積累便進入死亡期。這時α＞，生長呈負增長。工業(yè)發(fā)酵一般不會等到菌體開始自溶時才結(jié)束培養(yǎng)。發(fā)酵周期的長短不僅取決于前面五期的長短還取決于X0（初始濃度）。 4-3 簡述微生物產(chǎn)物合成與細胞生長之間的關(guān)系及其工藝控制策略 。 生長耦聯(lián)型：微生物的生長、碳水化合物的降解代謝和產(chǎn)物的形成幾乎是平行進行的，營養(yǎng)期和分化期彼此不分開，也即代謝產(chǎn)物的生成和細胞的生長是同步的和完全耦聯(lián)的【策略：延長發(fā)酵周期有利于產(chǎn)物合成】； 非生長耦聯(lián)型：產(chǎn)物一般不是直接或間接來自微生物的產(chǎn)能降解代謝，而是通過兩用代謝途徑合成的，所以產(chǎn)物的生產(chǎn)與細胞生長無直接關(guān)系【策略：如次生代謝產(chǎn)物，則以縮短菌體的對數(shù)生長期，并迅速獲得足夠量的菌體細胞后延長生產(chǎn)期，以提高產(chǎn)量】； 混合生長耦聯(lián)型：產(chǎn)物間接的與微生物的初級產(chǎn)能代謝途徑相關(guān)，這類反應(yīng)產(chǎn)物的生產(chǎn)與細胞的生長僅有間接關(guān)系【策略：根據(jù)其耦聯(lián)程度而靈活調(diào)節(jié)】。 4-4 名詞解釋： 比生長速率：指單位菌體（每克菌體）單位時間內(nèi)（一小時）增加的菌體量 基質(zhì)比消耗速率：指每克菌體在一小時內(nèi)消耗營養(yǎng)物質(zhì)的量，它表示細胞對營養(yǎng)物質(zhì)利用的速率或效率。 產(chǎn)物比生成速率：指每克菌體在一個小時內(nèi)合成產(chǎn)物的量，它表示細胞合成產(chǎn)物的速度或能力。 對基質(zhì)的細胞得率系數(shù)【YG】：指每消耗1g（或mol）基質(zhì)所產(chǎn)生的菌體重。 對基質(zhì)的產(chǎn)物得率系數(shù)【YP】：指每消耗1g（或mol）基質(zhì)所合成的產(chǎn)物質(zhì)量。 基質(zhì)消耗速率方程：。 X是當前菌濃度，m是細菌維持生命活動的消耗系數(shù) Luedeking-Piret方程：基本形式為，是描述產(chǎn)物形成動力學(xué)中混合生長耦聯(lián)型的模型。 5 發(fā)酵工藝 5-1 培養(yǎng)基的種類有哪些？前體、促進劑和抑制劑有何不同？何謂碳分解代謝物阻遏、快速利用氮源、生理酸性和堿性氮源？ 培養(yǎng)基按純度分為合成培養(yǎng)基【成分完全已知】和復(fù)合培養(yǎng)基【一些成分不完全明確】；按狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基；按用途分孢子培養(yǎng)基【繁殖孢子用】、種子培養(yǎng)基【培育種子（用于生產(chǎn)的初始菌）用】、發(fā)酵培養(yǎng)基【生產(chǎn)用】。 前體是指加入后能直接在生物合成中結(jié)合到產(chǎn)物分子中而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻有較大提高的物質(zhì)【如VB12的氯化鈷】。 促進劑是指既不是營養(yǎng)物又不是前體但能提高產(chǎn)量的物質(zhì)【如促進分散的表面活性劑】。 抑制劑是指在發(fā)酵過程中加入某些物質(zhì)會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而使所需產(chǎn)物或正常代謝的中間產(chǎn)物得以積累【甘油發(fā)酵中添加亞硫酸氫鈉】。 碳分解代謝物阻遏是指微生物在混合碳源發(fā)酵時優(yōu)先利用速效碳源（通常為葡萄糖），且該碳源的代謝產(chǎn)物會抑制其它非速效碳源代謝相關(guān)的基因表達和蛋白活性，從而影響非速效碳源利用的現(xiàn)象。 快速利用氮源即無機氮源，包括氨水、硝酸鹽、銨鹽。 無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性氮源，代謝后產(chǎn)生堿性物質(zhì)的無機氮源（NO3-）稱為生理堿性氮源 5-2 最適pH與微生物生長和產(chǎn)物形成的相互關(guān)系有哪幾種？如何確定某一微生物發(fā)酵的生長和產(chǎn)物形成的最佳pH？又如何控制其pH？ 最適pH與微生物生長和產(chǎn)物形成的相互關(guān)系有： 、QP都有一個相同的較寬的最適pH范圍； (或QP)的最適pH范圍一個很窄、一個很寬； 和QP對pH都很敏感，但最適pH又相同； 和QP對pH都很敏感，但最適pH卻不相同。 【：菌體生長；QP：產(chǎn)物合成】 菌體生長和產(chǎn)物合成的最適pH 根據(jù)實驗來確定 。 發(fā)酵過程pH的控制方法 ： 1）流加酸：HCl； 2）補加氨水或尿素： 3）碳酸鈣：中和產(chǎn)生CO2 4）補料控制pH 5-3 何謂呼吸強度、耗氧速率、臨界溶氧濃度？ 呼吸強度：表示微生物的相對需氧量，指單位重量干菌體在單位時間內(nèi)消耗的氧量； 耗氧速率：是指單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)細胞攝取（或消耗）氧的量，也稱攝氧速率； 臨界溶氧濃度：各種細胞對溶解氧濃度有一個最低要求，即發(fā)酵過程不需要使溶氧濃度達到或接近飽和值，只是超過此一氧濃度即可。此時溶氧濃度就稱為“臨界溶氧濃度”。 5-4 氧傳遞速率方程是什么？氧傳遞阻力主要是什么？影響氧傳遞的因素有哪些？請簡述攪拌與通風(fēng)影響溶氧的的機制。請舉出幾種氧載體。 主要傳遞阻力是氣液相間氧傳遞過程； 影響氧傳遞的因素有溶氧系數(shù)(KLa)和傳遞推動力(C*-CL )； 攪拌能夠顯著提高溶氧系數(shù)，具體表現(xiàn)為： 1)?攪拌能把大的空氣氣泡打成微小氣泡，a和氣液的接觸時間增大； 2)?攪拌使液體作渦流運動，延長了氣泡的運動路線，即增加了氣液的接觸時間； 3)?攪拌使發(fā)酵液呈湍流運動，從而減少氣泡周圍液膜的厚度，減少液膜阻力； 4)?攪拌使菌體分散，避免結(jié)團，有利于固液傳遞中的接觸面積的增加，使推動力均一。 氧載體包括：液態(tài)烷烴、正十二烷、正十六烷、全氟化碳、油酸、硅油、豆油。 5-5 發(fā)酵過程中泡沫是如何形成的？如何控制泡沫？常用的消泡劑有哪些？請具體寫出幾個代表性消泡劑。 在微生物深層培養(yǎng)過程中由于通氣和攪拌、代謝氣體的逸出以及培養(yǎng)基中糖、蛋白質(zhì)、代謝物等穩(wěn)定泡沫的表面活性物質(zhì)的存在，使發(fā)酵液中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫。 控制泡沫有兩種方法： 機械消泡：在攪拌軸上方安裝消沫漿，泡沫借旋風(fēng)離心場而消泡。 化學(xué)消泡：利用消泡劑以降低液膜的機械強度或降低液膜的表面粘度進行消泡。 6 生物反應(yīng)器 6-1 何謂生物反應(yīng)器？一個良好的生物反應(yīng)器應(yīng)具備什么條件？ 生物反應(yīng)器指提供適宜細胞生長和產(chǎn)物形成的各種條件，促進細胞的新陳代謝，在低消耗下獲得高產(chǎn)量的一種反應(yīng)設(shè)備。 一個優(yōu)良的生物反應(yīng)器應(yīng)具備的條件： 1)?結(jié)構(gòu)簡單； 2)?不易染菌； 3)?良好的液體混合性能； 4)?較高的傳質(zhì)傳熱速率； 5)?單位時間單位體積的生產(chǎn)能力高； 6)?同時還應(yīng)具有配套而又可靠的檢測和控制儀表。 6-2 常見的通風(fēng)發(fā)酵罐有哪些？分別描述它們各自的結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)缺點。 1.通用式發(fā)酵罐【既有機械攪拌裝置，又有壓縮空氣分布裝置】{技術(shù)成熟，通用性好，性能穩(wěn)定；結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能耗大，造價高} 2.機械攪拌式自吸式發(fā)酵罐【利用機械攪拌的高速旋轉(zhuǎn)而吸入空氣】{省去了壓縮機；吸程短，易染菌，剪切損傷大} 3.氣升式發(fā)酵罐【是指利用空氣的提升作用而使發(fā)酵液循環(huán)，沒有機械攪拌】{結(jié)構(gòu)簡單，造價低，避免染菌，能耗低，供氧好，無攪拌剪切；不適宜高粘度或固含量大的發(fā)酵} 4.噴射自吸式發(fā)酵罐【利用噴射吸氣裝置吸入空氣而進行氣液混合】{三相混合與分散良好，溶氧速率高，能耗低，無需提供壓縮空氣；較易染菌} 6-3 通用式發(fā)酵罐與氣升式發(fā)酵罐有何區(qū)別？ 兩者的主要區(qū)別在于： 1)?氣升罐功率消耗比通用式罐低； 2)?總功率相同時，氣升罐的氧傳遞速率比通用式罐高； 3)?氣升罐比通用式罐結(jié)構(gòu)簡單，且沒有機械軸封； 4)?氣升罐對細胞的剪切作用比通用式罐要小得多。 6-4 厭氧菌培養(yǎng)的特點是什么？酒精發(fā)酵罐為什么沒有機械攪拌裝置？ 厭氧菌的氧化與有機物的還原耦合，因而形成較少的ATP，其細胞得率比需氧菌少許多。 酒精發(fā)酵罐屬于厭氧發(fā)酵罐，發(fā)酵過程不需要供氧，且產(chǎn)生的CO2氣體可以起到類似氣升式罐一般的混合效果，因此沒有機械攪拌裝置。 6-5 什么是固體發(fā)酵？其有何優(yōu)缺點？請簡述影響固體發(fā)酵的因素。幾種固體發(fā)酵罐有何共同特點？ 所謂固體發(fā)酵是指，在濕含量低于90% 或不含或很少自由水的固體或含固體顆粒培養(yǎng)基中的發(fā)酵。 優(yōu)點：產(chǎn)率高；抗污染強；裝料系數(shù)大；部分微生物生長更好；可以以加工業(yè)殘渣為原料，降低生產(chǎn)成本；提取產(chǎn)物所需的溶劑少；發(fā)酵廢物的處理簡單，可直接干燥作為動物飼料。 缺點：物料攪拌難，混合不均，控制不易；傳熱性質(zhì)差，溫度控制難；發(fā)酵參數(shù)難以檢測；不太適合細菌生長；研究不透徹，目前往往依靠經(jīng)驗。 影響固體發(fā)酵的因素主要有合適菌株的篩選、最適基質(zhì)的確定和控制參數(shù)的優(yōu)化。 共同特點是都嚴格控制了固體發(fā)酵中氧的傳遞、溫度和基質(zhì)的濕含量。 7 基因工程菌的培養(yǎng) 7-1 影響工程菌不穩(wěn)定的因素有哪些？ 培養(yǎng)基的組成：質(zhì)粒在豐富培養(yǎng)基比在低限培養(yǎng)基中更加不穩(wěn)定。合成培養(yǎng)基往往有利于宿主細胞的生長，但不利于外源基因的表達； 培養(yǎng)溫度：通常低溫有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳； 菌體的比生長速率：如果宿主菌的比生長速率比工程菌的大，質(zhì)粒將嚴重丟失； 控制基因的過量表達：外源基因表達水平越高，重組質(zhì)粒就越不穩(wěn)定。 7-2 何謂高密度培養(yǎng)？重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵和核心是什么？其培養(yǎng)技術(shù)有哪幾種？ 高密度培養(yǎng)是指提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量）的一種培養(yǎng)技術(shù)，通常指分批補料發(fā)酵技術(shù)。 關(guān)鍵是補料策略，即根據(jù)工程菌的生長特點及產(chǎn)物的表達方式采取合理的營養(yǎng)流加方案，合理流加碳源降低‘葡萄糖效應(yīng)’ 常見的流加技術(shù)：恒速流加、變速流加、指數(shù)流加、反饋流加。 7-3 請簡述畢赤酵母作為外源蛋白表達系統(tǒng)的原理。何謂“三段法”？重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)時應(yīng)注意哪些問題？ 畢赤酵母為甲醇利用型酵母，能以甲醇為唯一碳源和能源生長。甲醇利用途徑的第一個酶為醇氧化酶（AOX）。生長在限量甲醇中的細胞能誘導(dǎo)出大量該酶，而生長在甘油、葡萄糖或乙醇中的細胞卻不能產(chǎn)生該酶。因此，可利用醇氧化酶基因（AOX1）作為強啟動子來構(gòu)建表達系統(tǒng)而高效表達外源蛋白。 三段法：第一階段，在甘油或葡萄糖為碳源的合成培養(yǎng)基中進行工程菌的分批培養(yǎng)，以積累菌體細胞；第二階段，在限制生長速率下流加甘油或葡萄糖的流加補料培養(yǎng)，以進一步提高菌體量；第三階段，即誘導(dǎo)階段，開始較低速度流加甲醇，以誘導(dǎo)外源蛋白的表達。 【該工藝的主要優(yōu)點是：1）提高細胞存活力；2）縮短誘導(dǎo)時間；3）提高重組蛋白的生產(chǎn)速率。但是過量甘油的流加，又將抑制甲醇利用途徑，導(dǎo)致外源蛋白的表達水平降低】 重組畢赤酵母的大規(guī)模培養(yǎng)的高密度培養(yǎng)時要注意控制代謝副產(chǎn)物乙醇的量，同時還要注意控制甲醇的流加量，它們都將抑制細胞的生長，后者還將影響表達水平。 8 動植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng) 8-1 動植物細胞與微生物細胞的區(qū)別是什么？ 8-2 動物細胞的培養(yǎng)方法有哪些？ 8-3 何謂灌注培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)？動物細胞在微載體表面的生長機制是什么？ 灌注培養(yǎng)：指細胞接種后進行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷地加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將培養(yǎng)液連續(xù)不斷地取出，但細胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細胞處于不斷的營養(yǎng)狀態(tài)中?！炯毎芏雀撸脮r間長，浪費少，避免代謝總產(chǎn)物和有毒代謝副產(chǎn)物的抑制作用】 微載體培養(yǎng)技術(shù)就是將動物細胞吸附在微載體表面而進行的一種懸浮培養(yǎng)技術(shù)?！疚⑤d體是指直徑在60～250m，能適用于貼壁細胞生長的微珠。微載體一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成】 錨地依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷粘附和貼壁、生長、擴展成單層三個階段。 粘附和貼壁：經(jīng)過數(shù)小時的低速攪拌增加細胞與微載體的接觸，細胞通過靜電作用和范德華力貼附在微載體上。 生長：選擇最適的生長條件可使生長迅速。 擴展成單層：與微載體表面有關(guān)。微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。 8-4 微生物、動植物細胞培養(yǎng)用的機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的主要區(qū)別是什么？ 動植物細胞發(fā)酵罐中將通用式發(fā)酵罐中對細胞剪切損傷較大的攪拌器和通氣裝置改為對細胞損傷較小的。 攪拌軸中空通氣，預(yù)先將氣液混合，并通過籠網(wǎng)消泡，再將無泡的有氧氣混合的培養(yǎng)液供入發(fā)酵罐?！倦m然深層通氣，但不產(chǎn)生氣泡，細胞不與氣泡接觸，避免了氣泡損傷※；?攪拌剪切力小，混合性能良好】【進行氣液交換的液體量有限，導(dǎo)致溶氧系數(shù)??；結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以放大，易產(chǎn)生死角，不宜長期連續(xù)使用】 {動植物細胞發(fā)酵培養(yǎng)其實也適宜用大氣泡的氣升式發(fā)酵罐，無剪切損傷，氣泡損傷小} 9 發(fā)酵動力學(xué) 研究內(nèi)容 ①細胞生長和死亡動力學(xué)； ②基質(zhì)消耗動力學(xué)； ③氧消耗動力學(xué)； ④CO2生成動力學(xué)； ⑤產(chǎn)物合成和降解動力學(xué)； ⑥代謝熱生成動力學(xué)。 9-1 名詞解釋：細胞得率系數(shù)、產(chǎn)物得率系數(shù)、理論得率系數(shù)、比生長速率、比生成速率、比消耗速率、維持系數(shù)。 細胞得率系數(shù)： 產(chǎn)物得率系數(shù)： 理論得率系數(shù)：在所有所消耗基質(zhì)都用于生產(chǎn)產(chǎn)物而不用于細胞生長的情況下，生成產(chǎn)物量和消耗基質(zhì)量的比值。 比生長速率：指單位時間內(nèi)（1h）單位質(zhì)量的菌體（1g）所增加的菌體量。 比生成速率：指每克菌體在一個小時內(nèi)合成產(chǎn)物的量。 維持系數(shù)：每克菌體在一小時內(nèi)維持其最基本的代謝所需消耗的培養(yǎng)基量。 9-2 常見細胞生長動力學(xué)和產(chǎn)物形成模型有哪幾種？ 細胞生長動力學(xué)：Monod方程，Haldane方程，Logistic方程 產(chǎn)物形成模型：Luedeking-Piret方程 9-3 常見細胞生長動力學(xué)模型（Monod方程和Logistic方程）、產(chǎn)物形成動力學(xué)模型（Luedeking-Piret方程）和基質(zhì)消耗的普遍動力學(xué)模型 Monod方程：不存在除了單一基質(zhì)量之外的其它限制細胞生長的條件【Ks半飽和常數(shù)】 Logistic方程【Xm細胞最大濃度】： 基質(zhì)消耗的普遍動力學(xué)模型 10 優(yōu)化和放大 10-1 生物過程的研究一般可分為哪幾個階段？ 10-2 生物過程優(yōu)化的方法有哪些？ 單次單因子法 統(tǒng)計法{Plackett-Burman法、響應(yīng)面法} 改進單純形法 10-3 某產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 為葡萄糖50、蛋白胨10 、酵母膏10、KH2PO4 2、MgSO4 1， 請設(shè)計Plackett-Burman 的實驗方案？ 10-4 根據(jù)文獻報道，在機械攪拌通氣發(fā)酵罐中，黑曲霉葡萄糖氧化酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝為pH 5.5-6.0，攪拌轉(zhuǎn)速500 rpm，氣液比1.0-1.5 vvm，現(xiàn)在某研究人員為了確定自己篩選獲得黑曲霉菌種在5 L機械攪拌通氣發(fā)酵罐中，葡萄糖氧化酶的最佳發(fā)酵工藝，請為其設(shè)計改進單純形法的最初4組實驗方案。在完成這4組實驗后，若第2組產(chǎn)葡萄糖氧化酶最差，請問第5組實驗方案如何？ 序號 pH 轉(zhuǎn)速（rpm） vvm 酶活 a 5.5 500 1 b 5.5 500 1.5 x c 6 500 1 d 6 500 1.5 e (a+b+c)*2/3-b (a+b+c)*2/3-b (a+b+c)*2/3-b 精選word范本！