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1、a-L-巖藻糖昔底物測定AFU的活的評估
元升生物科技技術(shù)研發(fā)部
1概述
a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase, AFU)的分類名為a-L-巖藻糖甘酶水解酶 (EC3. 2. 1. 51),催化巖藻糖甘鍵水解,參與含巖藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋 白和糖脂的分解代謝。AFU合成于細胞內(nèi),定位于溶酶體,是一種酸性水解酶, 它的本質(zhì)是糖蛋白。廣泛分布于人體肝、腎、胰、腦和胎盤等組織以及血清、尿
液、唾液和淚液中。AFU在人體內(nèi)呈多形性,在等電聚焦電泳中AFU可分出5? 9條區(qū)帶,血清中AFU除含有PI為4. 68和4. 84兩種主要成分以外,還可見 到5個次要成分。AFU具有3型同
2、工酶,即AFU1、AFU2和AFU3 ,是由1個 位于第一號染色體短臂(1p34)上基因位點的2個等位基因所表達,由于不同人 所表達的同工酶類型不同,所以正常人群 AFU活性也有所不同,大約有10%左 右的正常人血漿AFU呈低活性。測定a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase,AFU)對診 斷原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)M有重要臨床意義。它是PHC的特 異性標志物,可用于PHC的早期診斷.
2原理
底物CNP-AFU在血清樣本中a-L-巖藻糖甘酶酶作用下,生成產(chǎn)物 CPNP,而產(chǎn)物 CPNP的生成量與樣本中AFU的酶活性成正比,通過測定黃
3、色產(chǎn)物在 405nm波長 的生成速率,即可計算出樣本中AFU的活性。
3實驗方法
3.1 樣本 瑞安市人民醫(yī)院臨床新鮮血清樣品。
3.2 儀器和試劑CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生產(chǎn),批號
1213M05QH。進口底物購自美國sigm心司,批號1013c07QH;儀器為日立7080 全自動生化分析儀、抗壞血酸、膽紅素、人胎盤 a-L-巖藻糖甘酶均購自sigm宓 司,血紅蛋白標準品購自上海血液中心。
3.3 試劑配制方法按常法配制,所用原料均為分析純。
3.4 測定方法 HITACHI 7080自動分析儀參數(shù) 反應(yīng)類型:Rate-A法;反應(yīng)溫
度:37C;波長:(主)3
4、40/(次)405nm;樣本:25口 試齊1」250口 讀點時間6-12點< 4實驗結(jié)果
4.1 精密度評價 按NCCLS評價方案,取低、中、高三個不同濃度的 AFU樣本, 濃度分別為25U/L、68U/L、235U/L,上、下午雙份測定,連續(xù)測定 20d,再每 天測1次,共測20d,結(jié)果見表1
表1批內(nèi)和批問精密度測定結(jié)果(U/L)
樣本
標本
次數(shù)
批 內(nèi)
次數(shù)
批
間
x
SD
CV%
x
SD
CV%
1
低值
20
25
0.55
2.20
20
25
0.60
2.40
2
中值
20
68
0.7
5、8
1.15
20
68
1.02
1.5
3
高值
20
235
2.26
0.96
20
235
2.82
1.2
4.2 線性范圍評價 按NCCLS的評價方案,選用購自sigm/司人胎盤a-L-巖藻糖甘酶 為300U/L和20U/L的高低值酶樣本2份,然后2份樣本等量混合產(chǎn)生中間值160U/L,中 間值再與高低值等量混合,產(chǎn)生230U/L和90U/L的5個不同梯度值樣本,在儀器上以 低值到高值和高值到低值分別測定,求得兩次平均值,以 X作為理論值,Y作為測定
值進行回歸分析,其方程Y=0.9986X-0.3714尸0.9994。表明AFU活性在3
6、00U/L范圍內(nèi), 線性良好。
4.3 比對實驗 取AFU濃度從10?200U/L的不同病人新鮮血清標本50份,分別用本公
司合成底物配制的試劑與進口底物配制的試劑同時測定 AFU活性,所得數(shù)據(jù)均按
NCCLS文件統(tǒng)計,經(jīng)t檢驗得P>0.05, y=0.9813X-0.3746;r=0.9991表明本試劑與進口 試劑高度相關(guān)。
4.4 回收實驗 向250仙血清中加入50仙的生理鹽水作為基礎(chǔ)樣本,測得 AFU濃度為
20U/L ,向同體積的血清標本中分別加入 50仙濃度為25U/L和80U/L的AFU酶標準品, 使其終濃度分別為24.2U/L和33.3U/L的樣本,每一濃度作平
7、行管,測得其回收率為 98.5% ?102.4%.
4.5 干擾試驗 在高、低兩個濃度的混合血清樣本中分別加入不同濃度的膽紅素、血 紅蛋白、抗壞血酸(MtC),然合對AFU進行測定,結(jié)果表明三酰甘油0 5.0mmol/L、 Hb<2.5g/L> 膽紅素0 500pmdL、MtC 0 10g/L時經(jīng)配對差異比較,均無顯著干擾 (P<0.05)。而常用抗凝劑中EDTA.K2、草酸鈉對檢測無顯著干擾,但肝素明顯干擾AFU 的檢測,使AFU結(jié)果出現(xiàn)假性偏高,其干擾機理尚不清楚。
5結(jié)論
本公司合成的CNP-AFU底物法用于檢測AFU活性較為理想,該底物在酸性條件 下,樣本中的AFU將含呈色基團的
8、底物CNP-AFU的1, 4位糖昔鍵水解,使反應(yīng) 在405nm處產(chǎn)生最大吸光度,通過測定吸光度的變化,即可計算出樣本中 AFU的
活性。我們對公司合成的該底物用于檢測 AFU酶活進行其主要指標的評價,具結(jié) 果顯示批內(nèi) CV <2.2% ,批問 CV <2.4%。三酰甘油0 5.0mmol/L、Hb<2.5g/L> 膽紅素W 500pmOL、V讓C010g/L時對結(jié)果無顯著性干擾(P<0.05);經(jīng)與進口底 物配制的試劑比對其結(jié)果高度相關(guān),完全能滿足臨床檢測要求。
附產(chǎn)品檢測圖(HPLC):
9、
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