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2019-2020年高考生物一輪復(fù)習(xí)第35講基因工程培優(yōu)學(xué)案 [考綱明細(xì)]　1.基因工程的誕生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技術(shù)(含PCR技術(shù))(Ⅱ)　3.基因工程的應(yīng)用(Ⅱ)　4.蛋白質(zhì)工程(Ⅰ)　實驗：DNA的粗提取與鑒定 板塊一　知識自主梳理 一、基因工程的概念及基本工具 1．基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。 2．DNA重組技術(shù)的基本工具 (1)限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱：限制酶) ①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。 ②作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 ③結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。 例：如下圖所示，EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是—GAATTC—，切割位點在G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是—CCCGGG—，切割位點在G和C之間；說明限制酶具有專一性。 ④本質(zhì)：蛋白質(zhì)。 (2)DNA連接酶 ①作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成新的DNA分子。 ②類型 ③DNA連接酶和限制酶的關(guān)系 (3)載體 ①載體的作用：攜帶外源DNA片段進入受體細(xì)胞。 ②常用載體：質(zhì)粒。其他載體：λ噬菌體衍生物、動植物病毒等。 ③質(zhì)粒 a．概念：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 b．特點：能自我復(fù)制；有一個至多個限制酶切位點；有特殊標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 二、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的獲取 (1)從基因文庫中獲取 ①前提條件：目的基因序列未知。 ②基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，可分為基因組文庫和部分基因文庫(如cDNA文庫)。 ③構(gòu)建過程 (2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因 ①PCR含義：是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。 ②PCR原理：DNA雙鏈復(fù)制。 ③前提條件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。 ④要求 模板：目的基因兩條鏈。 原料：四種脫氧核苷酸。 酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)。 引物：人工合成的兩條DNA片段(引物1，引物2)。 ⑤PCR反應(yīng)過程 ⑥方式：指數(shù)形式擴增(2n，n為擴增循環(huán)的次數(shù))。 ⑦結(jié)果：短時間內(nèi)大量擴增目的基因。 (3)人工合成 ①前提條件：核苷酸序列已知，基因比較小。 ②方法 a．反轉(zhuǎn)錄法：目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因) b．化學(xué)合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因 2．基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心 (1)操作目的 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 (2)組成 (3)構(gòu)建過程 3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 (1)目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 ①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：最常用的方法。 a．受體細(xì)胞：植物體細(xì)胞或受精卵。 b．操作過程：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA上―→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌―→導(dǎo)入植物細(xì)胞―→TDNA上的目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上―→目的基因表達。 ②基因槍法：適用于單子葉植物，成本較高。 ③花粉管通道法：將目的基因通過花粉管通道導(dǎo)入受體細(xì)胞，十分簡便經(jīng)濟。 (2)目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 ①方法：顯微注射技術(shù)。 ②受體細(xì)胞：動物的受精卵。 ③操作過程：將含有目的基因的表達載體提純―→取卵(受精卵)―→顯微注射―→受精卵經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)―→獲得具有新性狀的動物。 (3)目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 ①轉(zhuǎn)化方法 a．用Ca2＋處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞)。 b．感受態(tài)細(xì)胞吸收重組表達載體DNA分子。 ②受體細(xì)胞：原核細(xì)胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。 ③原核生物的特點：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等。 4．目的基因的檢測與鑒定 (1)不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。 (2)在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時，用的探針都是放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。 三、基因工程的應(yīng)用 1．轉(zhuǎn)基因植物 植物基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力(如抗除草劑、抗蟲、抗病、抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方面。 2．轉(zhuǎn)基因動物 動物基因工程在動物品種改良、建立生物反應(yīng)器、器官移植等方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。 3．基因工程藥物 (1)來源：轉(zhuǎn)基因的工程菌。 (2)成果：細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素等。 (3)作用：用來預(yù)防和治療人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風(fēng)濕等疾病。 4．基因治療 (1)方法：把正常基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能。 (2)效果：治療遺傳病的最有效的手段。 (3)分類：體內(nèi)基因治療和體外基因治療。 四、蛋白質(zhì)工程 1．概念：蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。 2．設(shè)計流程：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)?！?　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ◆　深入思考 1．用限制酶切割DNA分子時需注意哪些問題？ 提示　①獲取目的基因和切割載體時，經(jīng)常使用同一種限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。②獲取一個目的基因需限制酶切割兩次，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端。③限制酶切割位點的選擇，必須保證標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測。 2．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，能否穩(wěn)定遺傳？為什么？ 提示　一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致目的基因丟失，無法穩(wěn)定遺傳。 ◆　自查診斷 1．限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶。(　　) 答案　 2．設(shè)計擴增目的基因的引物時不必考慮表達載體的序列。(　　) 答案　 3．抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達。(　　) 答案　√ 4．應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其完全表達。(　　) 答案　 5．蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對蛋白質(zhì)分子直接進行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)。(　　) 答案　  板塊二　考點題型突破 考點1 基因工程的操作工具 題型一　限制性核酸內(nèi)切酶及DNA連接酶等酶的作用　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1．如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，下面選項中能依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用順序的是(　　) A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③② 答案　C 解析　限制酶可在特定位點對DNA分子進行切割；DNA聚合酶在DNA分子復(fù)制時將單個脫氧核苷酸連接成脫氧核苷酸鏈；DNA連接酶連接DNA片段；解旋酶的作用是將DNA雙鏈解開螺旋，為復(fù)制或轉(zhuǎn)錄提供模板。 2．下列關(guān)于限制酶和DNA連接酶的理解正確的是(　　) A．它們的功能都是起催化作用 B．DNA連接酶可以替代解旋酶 C．在基因工程操作中至少需要三種酶工具 D．一種限制酶既可以切出黏性末端也可以切出平末端 答案　A 解析　酶的功能就是具有催化作用，酶具有專一性，一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，因此只能切出一種DNA片段末端。 技法提升 　DNA相關(guān)六種酶的比較 題型二　載體的作用及特點 3．下列關(guān)于載體的敘述中，錯誤的是(　　) A．載體與目的基因結(jié)合后，實質(zhì)上就是一個重組DNA分子 B．對某種限制酶而言，載體最好只有一個切點，但還要有其他多種酶的切點 C．目前常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒 D．載體具有某些標(biāo)記基因，便于對其進行切割 答案　D 解析　標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。 4．限制性核酸內(nèi)切酶MunⅠ和限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ的識別序列及切割位點分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中箭頭所指部位為限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是(　　) 答案　A 解析　由圖可知，質(zhì)粒B上無標(biāo)記基因，不適合作為載體；質(zhì)粒C和D的標(biāo)記基因上都有限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點不適合作為載體。質(zhì)粒A上MunⅠ的切割點不在標(biāo)記基因上且兩種限制酶切割后形成的黏性末端相同，所以質(zhì)粒A適于作為目的基因的載體。 考點2 基因工程的基本操作程序 題型一　PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 1．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，其簡要過程如下圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是(　　) A．PCR技術(shù)是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù) B．反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板 C．PCR體系中需添加從受體細(xì)胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶 D．應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變 答案　C 解析　PCR技術(shù)是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，A正確；PCR技術(shù)需要模板DNA，且反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，B正確；PCR的原理是DNA的復(fù)制，但變性時不需要解旋酶，C錯誤；應(yīng)用PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)可以檢測基因突變，D正確。 2．PCR技術(shù)是分子生物學(xué)實驗室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA的半保留復(fù)制，在試管中進行DNA的人工復(fù)制(如圖所示)，在很短的時間內(nèi)，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)PCR的全稱是________，94 ℃高溫使DNA雙鏈打開，這一步是打開________鍵，稱為________。而這一過程在細(xì)胞內(nèi)是通過________酶實現(xiàn)的。 (2)當(dāng)溫度降低時，引物與模板________端結(jié)合，在________的作用下，引物沿模板延伸，此過程中原料是________，遵循的原則是________。 (3)PCR技術(shù)的必要條件除模板、原料、ATP、酶以外，至少還需要三個條件，即液體環(huán)境、適宜的________和________，前者由PCR儀自動調(diào)控，后者則靠________來維持。 (4)DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是__________________。引物的實質(zhì)是________，若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖溶液中至少加入________個引物。 答案　(1)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 氫 變性 解旋 (2)3′ 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 四種脫氧核苷酸　堿基互補配對 (3)溫度 pH 緩沖液 (4)DNA的復(fù)制不能從頭開始，DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈 單鏈RNA或者單鏈DNA分子 211－2 解析　打開DNA雙鏈需破壞堿基對間的氫鍵；引物的游離端為5′端，即合成DNA時從新鏈的5′→3′端延伸，故引物需與模板的3′端結(jié)合；PCR所用液體環(huán)境需保障適宜的溫度和pH，其pH可借助緩沖液維持；DNA復(fù)制不能從頭開始，故必須提供引物。在DNA分子擴增時，需要2種引物，由于新合成的鏈都需要引物作為復(fù)制的起點，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA鏈的數(shù)目，即2210－2＝211－2。 技法提升 1.PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的異同點 2．正確理解PCR技術(shù) (1)DNA單鏈有方向性，DNA母鏈的3′端對應(yīng)著子鏈的5′端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹? (2)PCR過程中無解旋酶，破壞氫鍵需要升高溫度，但此時的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵，因此，熱變性后產(chǎn)生的是DNA單鏈，并不是脫氧核苷酸。 (3)復(fù)性只是引物與DNA單鏈的結(jié)合，并未形成子鏈DNA，子鏈DNA是在延伸階段形成的。 題型二　目的基因的獲取 3．下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是(　　) ①從基因文庫中獲取目的基因?、诶肞CR技術(shù)擴增目的基因?、鄯崔D(zhuǎn)錄法獲得cDNA?、芡ㄟ^DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成目的基因 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ 答案　D 解析　可依據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等從基因文庫中獲取目的基因，故①不需要模板；②利用PCR技術(shù)擴增目的基因需要DNA的兩條鏈作為模板；③反轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA需要mRNA作為模板；④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成目的基因時，不需要模板。 4．基因工程又稱為DNA重組技術(shù)，回答相關(guān)問題： Ⅰ.(1)在基因工程中，獲取目的基因主要有兩大途徑，即________和從________中分離。 (2)利用某植物的成熟葉片為材料，同時構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫，兩個文庫相比，cDNA文庫中含有的基因數(shù)目比基因組文庫中的少，其原因是______________________________________。 (3)在基因表達載體中，啟動子是________聚合酶識別并結(jié)合的部位。若采用原核生物作為基因表達載體的受體細(xì)胞，最常用的原核生物是________。 Ⅱ.將外源生長激素基因?qū)刖d羊體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因綿羊的生長速度比一般綿羊提高30%，體型增大50%。外源生長激素基因除可以從基因組文庫中獲取外，還可通過以下途徑合成：一是利用從供體動物的________細(xì)胞中提取的mRNA，在________酶催化下合成；二是通過分析生長激素的________序列推測基因的結(jié)構(gòu)，進而人工合成。這兩種途徑合成的生長激素基因________(填“相同”或“不同”)，原因是____________________________________。 答案?、?(1)人工合成　已有物種　(2)cDNA文庫中只含有葉片細(xì)胞已轉(zhuǎn)錄(或已表達)的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因　(3)RNA　大腸桿菌(或細(xì)菌) Ⅱ.垂體　逆轉(zhuǎn)錄　氨基酸　不同　一種氨基酸可能不只由一種密碼子決定(密碼子的簡并性) 解析?、?(1)獲取目的基因的途徑，一是人工合成，二是從自然界已有物種中分離。 (2)基因組文庫中含有該植物的所有基因，而cDNA文庫中只含有已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的基因。 (3)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；最常用的原核生物受體細(xì)胞是大腸桿菌。 Ⅱ.生長激素是垂體合成分泌的，故只有在垂體細(xì)胞中才能提取到生長激素基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA，再在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下合成生長激素基因。也可以通過分析生長激素的氨基酸序列，推測出其mRNA中的堿基序列，進而推測出生長激素基因中的堿基序列，最后用化學(xué)方法人工合成。因為決定氨基酸的密碼子具有簡并性，因而這兩種方法合成的生長激素基因結(jié)構(gòu)可能不同。 技法提升 　獲取目的基因的方法選擇 (1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構(gòu)建基因文庫的方法，即通過受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中獲取目的基因。 (2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學(xué)方法直接人工合成。 (3)如果知道要擴增的目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，可以通過PCR技術(shù)擴增目的基因。 題型三　基因表達載體的構(gòu)建 5．在基因表達載體的構(gòu)建中，下列說法不正確的是(　　) ①一個表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子 ②有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA ③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止 ④所有基因表達載體的構(gòu)建是完全相同的 A．②③ B．①② C．①④ D．③④ 答案　C 解析　一個表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等，故①錯誤；啟動子能啟動轉(zhuǎn)錄過程，即有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，故②正確；終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止，故③正確；不同的基因表達載體構(gòu)建方法不同，故④錯誤。綜上所述，C符合題意。 6．下圖是利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性核酸內(nèi)切酶。下列有關(guān)說法中正確的是(　　) A．圖示過程是基因工程的核心步驟，所需的限制性核酸內(nèi)切酶均來自原核生物 B．圖示中構(gòu)建基因表達載體時，需要用到一種限制性核酸內(nèi)切酶 C．一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的核糖核苷酸序列 D．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來 答案　D 解析　圖示表示基因表達載體的構(gòu)建過程，這是基因工程的核心步驟，所需的限制性核酸內(nèi)切酶一般來自原核生物，A錯誤；此表達載體構(gòu)建時需要用到EcoRⅠ、PstⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶，B錯誤；限制酶具有特異性，即一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列并在特定的位點切割，C錯誤；抗卡那霉素基因作為標(biāo)記基因，主要作用是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，D正確。 7．若要利用某目的基因(見圖甲)和P1噬菌體載體(見圖乙)構(gòu)建重組DNA(見圖丙)，限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓ AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是(　　) A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 答案　D 解析　解答本題的關(guān)鍵是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體，構(gòu)建的重組DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移動方向才一定與圖丙相同。 技法提升 1.基因表達載體構(gòu)建時限制酶的選擇 (1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類 ①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)。 (2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類 ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。 ②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細(xì)胞后將不能自主復(fù)制。 2．基因表達載體中啟動子、終止子的來源 (1)如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，目的基因中已含有啟動子、終止子，在構(gòu)建基因表達載體時，不需要在質(zhì)粒上接上特定的啟動子、終止子。 (2)如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構(gòu)建基因表達載體時，需要在與質(zhì)粒結(jié)合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。 題型四　目的基因的導(dǎo)入與檢測 8．下面為利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是(　　) A．②的構(gòu)建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶參與 B．③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上 C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異 答案　D 解析　構(gòu)建重組質(zhì)粒需要用到限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶，A錯誤；含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒的TDNA整合到受體細(xì)胞的染色體上，而不是重組Ti質(zhì)粒整合到受體細(xì)胞的染色體上，B錯誤；導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因表達后，轉(zhuǎn)基因植株方能表現(xiàn)出相應(yīng)性狀，若目的基因在受體細(xì)胞中不表達，轉(zhuǎn)基因植株不能表現(xiàn)出相應(yīng)性狀，C錯誤；⑤表現(xiàn)出抗蟲性狀則表明該植株細(xì)胞發(fā)生了基因重組，基因重組是可遺傳變異，D正確。 9．[xx吉林松原期末]為達到相應(yīng)目的，必須通過分子檢測的是(　　) A．?dāng)y帶鏈霉素抗性基因受體菌的篩選 B．產(chǎn)生抗人白細(xì)胞介素－8抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選 C．轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定 D．21三體綜合征的診斷 答案　B 解析　攜帶鏈霉素抗性基因受體菌的篩選，可用含鏈霉素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，能存活的即含有相應(yīng)的抗性基因，A錯誤；產(chǎn)生抗人白細(xì)胞介素－8抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選，細(xì)胞水平的篩選只能選出雜交瘤細(xì)胞，如篩選出產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，必須用抗原抗體雜交法從分子水平上進一步檢測，B正確；轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定，用抗蟲接種實驗檢測即可，C錯誤；21三體綜合征的診斷，可用顯微鏡鏡檢觀察檢測，D錯誤。 10．[xx威海模擬]科學(xué)家將人的生長激素基因與某種細(xì)菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子進行重組，并成功地在該細(xì)菌中得以表達(如下圖)。請據(jù)圖分析回答： (1)細(xì)菌是理想的受體細(xì)胞，這是因為它__________________。 (2)質(zhì)粒A與目的基因結(jié)合時，首先需要用________酶將質(zhì)粒切開“缺口”，然后用________酶將質(zhì)粒與目的基因“縫合”起來。 (3)若將細(xì)菌B先接種在含有________的培養(yǎng)基上能生長，說明該細(xì)菌中已經(jīng)導(dǎo)入外源質(zhì)粒，但不能說明外源質(zhì)粒是否成功插入目的基因；若將細(xì)菌B再重新接種在含有________的培養(yǎng)基上不能生長，則說明細(xì)菌B中已經(jīng)導(dǎo)入了插入目的基因的重組質(zhì)粒。 答案　(1)繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少 (2)限制性核酸內(nèi)切　DNA連接 (3)氨芐青霉素　四環(huán)素 解析　(1)細(xì)菌具有繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等優(yōu)點，因此是基因工程中的理想的受體細(xì)胞。 (2)構(gòu)建基因表達載體時，需先用限制酶分別切割目的基因和載體，再用DNA連接酶將兩者連接起來。 (3)質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒中都有完整的抗氨芐青霉素基因，因此細(xì)菌有氨芐青霉素抗性說明該細(xì)菌中已經(jīng)導(dǎo)入外源質(zhì)粒，但不能說明外源質(zhì)粒是否成功插入目的基因；重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因內(nèi)插入了目的基因，不能表達，因此細(xì)菌對四環(huán)素?zé)o抗性則說明細(xì)菌B中已經(jīng)導(dǎo)入了插入目的基因的重組質(zhì)粒。 技法提升 　如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞 (1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素的載體時，如果插入某種抗生素基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素基因內(nèi)部，則四環(huán)素基因失活。 (2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌。 (3)篩選方法：將含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。 考點3 基因工程的應(yīng)用及蛋白質(zhì)工程 題型一　基因工程的應(yīng)用 1．以下有關(guān)基因工程應(yīng)用的說法正確的是(　　) A．用基因工程培育的抗蟲植物也能抗病毒 B．基因工程在畜牧業(yè)上的應(yīng)用主要是培育體型巨大的動物 C．基因工程可用來培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良和抗逆性強的作物 D．科學(xué)家將必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)導(dǎo)入植物中，或者改變這些氨基酸的合成途徑中某種關(guān)鍵酶的活性，以提高氨基酸的含量 答案　C 解析　基因工程培育的抗蟲棉只能抗某種蟲害，不能抗病毒，A錯誤；基因工程用于畜牧業(yè)主要是為了改良動物品種，改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，B錯誤；想要提高植物的氨基酸含量，應(yīng)將必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)胫参镏?，D錯誤。 2．有一種單基因遺傳病——α1抗胰蛋白缺乏癥，患者會出現(xiàn)肺氣腫及其他疾病。注射α1抗胰蛋白酶可治療該病。圖甲表示獲取人α1抗胰蛋白酶基因的兩種方法，圖乙表示獲取α1抗胰蛋白酶的方法。據(jù)圖回答： (1)圖甲表示的是基因工程中的________步驟。完成a過程的酶的作用特點是___________________________________________。 (2)c過程需要的原料是________，遺傳信息的傳遞方向是________。 (3)圖乙中的d表示________。 (4)GEP(綠色熒光蛋白)基因的作用是__________________。 答案　(1)目的基因的獲取　識別特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子 (2)四種脫氧核苷酸　RNA→DNA (3)基因表達載體 (4)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 解析　(1)圖甲中方法1是用限制酶切割獲得目的基因，方法2是用逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因。限制酶的作用特點是識別特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子。 (2)逆轉(zhuǎn)錄是以mRNA為模板合成DNA，所以原料是四種脫氧核苷酸，遺傳信息是從RNA到DNA。 (3)d表示基因表達載體。 (4)標(biāo)記基因的作用是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞。 3．肺細(xì)胞中的let7基因表達減弱，癌基因RAS表達增強，會引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將let7基因?qū)敕伟┘?xì)胞實現(xiàn)表達，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如下圖1。 請回答： (1)進行過程①時，需用________酶切開載體以插入let7基因。載體應(yīng)有RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動let7基因轉(zhuǎn)錄，該部位稱為________。 (2)進行過程②時，需用________酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞，以利于傳代培養(yǎng)。 (3)研究發(fā)現(xiàn)，let7基因能影響癌基因RAS的表達，其影響機理如圖2。據(jù)圖分析，可從細(xì)胞中提取________進行分子雜交，以直接檢測let7基因是否轉(zhuǎn)錄。肺癌細(xì)胞增殖受到抑制，可能是由于細(xì)胞中________(RAS mRNA/RAS蛋白)含量減少引起的。 答案　(1)限制性核酸內(nèi)切(或限制)　啟動子　(2)胰蛋白　(3)RNA　RAS蛋白 解析　(1)過程①為基因表達載體的構(gòu)建，該過程涉及的工具酶為限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，需用限制酶切開載體以插入let7基因。完整的基因表達載體包括啟動子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因等，而啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點。 (2)進行過程②時，用胰蛋白酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞，以利于細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。 (3)從圖中可以看出，RAS mRNA和let7基因轉(zhuǎn)錄的miRNA配對形成雜交分子，從而抑制了癌基因RAS的表達，故可以提取RNA進行分子雜交，以直接檢測let7基因是否轉(zhuǎn)錄。 技法提升 　有關(guān)基因工程應(yīng)用的四個易錯點 (1)動物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個體。 (2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無毒性，進入昆蟲消化道被分解成多肽后產(chǎn)生毒性。 (3)青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過基因工程產(chǎn)生的。 (4)并非所有個體都可作為乳腺生物反應(yīng)器。操作成功的應(yīng)該是雌性個體，個體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應(yīng)該考慮的因素。 題型二　蛋白質(zhì)工程 4．科研人員利用相關(guān)技術(shù)改變了胰島素B鏈的第9位氨基酸，從而避免了胰島素結(jié)合成無活性的二聚體形式。下列相關(guān)敘述中，不正確的是(　　) A．胰島素的本質(zhì)是蛋白質(zhì)不宜口服使用 B．可通過測定DNA的序列確定突變是否成功 C．對胰島素結(jié)構(gòu)的改造屬于蛋白質(zhì)工程 D．該過程的操作對象是胰島素分子 答案　D 解析　胰島素的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。只能注射，不宜口服使用，A正確；可通過測定DNA的序列確定突變是否成功，B正確；對胰島素結(jié)構(gòu)的改造屬于蛋白質(zhì)工程，C正確；蛋白質(zhì)工程的操作對象是基因，D錯誤。 5．現(xiàn)代生物技術(shù)并不是各自獨立的，而是相互聯(lián)系、相互滲透的。下圖表示利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)某種動物蛋白的流程示意圖，請分析回答下列問題： (1)該生產(chǎn)流程中應(yīng)用到的現(xiàn)代生物技術(shù)有________________________、________________________(寫出其中兩種)。 (2)圖中A、B分別表示_________________________________、 ____________________。 (3)為提高培育成功率，進行②過程之前，對早期胚胎的處理是取其部分細(xì)胞用目的基因探針進行____________________________ _______________檢測基因表達載體是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，對受體動物的處理是用____________________進行同期發(fā)情處理。 (4)蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)，原因是___________________________________________________。 答案　(1)蛋白質(zhì)工程　基因工程　胚胎移植技術(shù)(任寫兩種) (2)推測應(yīng)有的氨基酸序列　基因表達載體 (3)DNA(核酸)分子雜交　激素 (4)改造后的基因能夠遺傳(且改造基因易于操作) 解析　(1)由圖分析可知，該生產(chǎn)流程中應(yīng)用到的現(xiàn)代生物技術(shù)有蛋白質(zhì)工程、基因工程、胚胎移植技術(shù)等。 (2)圖中A、B分別表示推測應(yīng)有的氨基酸序列、基因表達載體。 (3)為提高培育成功率，進行②過程之前，對早期胚胎的處理是取其部分細(xì)胞用目的基因探針進行DNA分子雜交，對受體動物的處理是用激素進行同期發(fā)情處理。 (4)由于改造后的基因能夠遺傳(且改造基因易于操作)，因此蛋白質(zhì)工程中，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質(zhì)。 技法提升 　蛋白質(zhì)工程與基因工程的比較 實驗十六 DNA的粗提取與鑒定 1．DNA粗提取和鑒定的原理 (1)提取思路：利用DNA和其他物質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異，提取DNA。 (2)DNA的性質(zhì)(提取和鑒定原理)： ①DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同 ②DNA不溶于酒精； ③對酶、高溫和洗滌劑的耐受性強； ④DNA＋二苯胺試劑藍色。 2．DNA粗提取和鑒定的操作流程 1．[xx揚州江都中學(xué)段考]下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　) A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水 B．向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水是為了釋放出DNA C．向濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNA D．用菜花替代雞血做實驗，其實驗操作步驟相同 答案　D 解析　DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水，A正確；向雞血細(xì)胞液中加蒸餾水是為了讓雞血細(xì)胞吸水漲破，從而釋放出DNA，B正確；向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了降低DNA的溶解度，進而析出DNA，C正確；用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟不完全相同，如植物細(xì)胞有細(xì)胞壁，破碎細(xì)胞時需要研磨并加入食鹽和洗滌劑，D錯誤。 2．下列關(guān)于“DNA的粗提取和鑒定”實驗依據(jù)原理的敘述，錯誤的是(　　) A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質(zhì)能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質(zhì)分離 B．利用高溫能使蛋白質(zhì)變性，卻對DNA沒有影響的特性，可將DNA與蛋白質(zhì)分離 C．利用二苯胺與DNA沸水浴呈現(xiàn)藍色可用于DNA的鑒定 D．在DNA濾液中加入嫩肉粉，通過木瓜蛋白酶的作用，可將DNA與蛋白質(zhì)分離 答案　B 解析　高溫能使蛋白質(zhì)、DNA變性，蛋白質(zhì)在60～80 ℃發(fā)生變性，而DNA在80 ℃以上才變性。 技法提升 　DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4” 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 板塊三　方向真題體驗 1．[xx全國卷Ⅰ]真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內(nèi)含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}： (1)某同學(xué)從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是_________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________。 (2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用__________作為載體，其原因是 ________________________________________________。 (3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有______________________________(答出兩點即可)等優(yōu)點。 (4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質(zhì)是__________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導(dǎo)，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是______________________________________________________。 答案　(1)基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A (2)噬菌體　噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶 (3)繁殖快、容易培養(yǎng) (4)蛋白A的抗體 (5)DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體 解析　(1)人是真核生物，從人的基因組文庫中獲得的基因A有內(nèi)含子，而受體細(xì)胞大腸桿菌是原核生物，原核生物基因中沒有內(nèi)含子，相應(yīng)的就沒有切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制，故無法表達出蛋白A。 (2)噬菌體是專一性侵染細(xì)菌的病毒，以細(xì)菌為宿主細(xì)胞，而昆蟲病毒侵染的是昆蟲，以昆蟲為宿主細(xì)胞。家蠶屬于昆蟲，故應(yīng)選用昆蟲病毒作為載體。 (3)與家蠶相比，大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，故要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。 (4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用抗原—抗體雜交法。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中，S型細(xì)菌的DNA可以使R型細(xì)菌發(fā)生轉(zhuǎn)化，說明可調(diào)控多糖莢膜產(chǎn)生的基因整合到了R型細(xì)菌的DNA分子中并成功得以表達。也就是說DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體并進行表達，這就為基因工程理論的建立提供了啟示。 2．[xx全國卷Ⅱ]幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}： (1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是________________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是___________________________________。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_________________________________________________________。 (3)若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達，需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是______________________________________(答出兩點即可)。 (4)當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是________________________。 (5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是___________________________________________________。 答案　(1)嫩葉組織細(xì)胞易破碎　防止RNA降解 (2)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA (3)目的基因無復(fù)制原點；目的基因無表達所需啟動子 (4)磷酸二酯鍵 (5)目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常 解析　(1)與老葉相比，嫩葉組織細(xì)胞易破碎，容易提取到幾丁質(zhì)酶的mRNA。提取RNA時，提取液中添加RNA酶抑制劑可防止RNA被RNA酶催化降解。 (2)以mRNA為模板，按照堿基互補配對原則，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，通過逆轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄)可以獲得cDNA。 (3)因該目的基因是通過逆轉(zhuǎn)錄形成的，無表達所需的啟動子，也無在受體細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制所需的復(fù)制原點等，所以在受體細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在和表達，也不能遺傳下去。 (4)構(gòu)建基因表達載體時，DNA連接酶能催化目的基因和質(zhì)粒載體這兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 (5)轉(zhuǎn)基因植株的基因組中含有幾丁質(zhì)酶基因，但該植株抗真菌的能力并沒有提高，可能是由于轉(zhuǎn)錄或翻譯異常，即幾丁質(zhì)酶基因未能正常表達。 3．[xx全國卷Ⅰ] 某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有________________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________；并且____________和________________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________。 在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自______________。 答案　(1)能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素 (3)受體細(xì)胞 解析　(1)作為運載體的質(zhì)粒上應(yīng)有一個至多個限制酶切割位點，在細(xì)胞中能夠自我復(fù)制，且含有特殊的標(biāo)記基因。 (2)未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌中均未導(dǎo)入質(zhì)粒載體，而質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此這樣的大腸桿菌在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中不能生長。含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，二者在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中都能生長，因此無法區(qū)分二者。根據(jù)題圖，用BamHⅠ切割質(zhì)粒后將四環(huán)素抗性基因破壞，因此可將經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選出的菌落置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上再次篩選，能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生存的是含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌，不能生存的是含有插入目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。 (3)噬菌體為病毒，經(jīng)改造后作為載體時，其DNA復(fù)制所需原料來自受體細(xì)胞。 4．[xx全國卷Ⅲ]圖a中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖b為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： (1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是____________。 (2)若某人利用圖b所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖c所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達的原因是______________________________________________________。 (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________。 答案　(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄 (3)Ecoli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶 解析　(1)由于限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端，所以經(jīng)BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與上述表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。 (2)啟動子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。終止子也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。在基因表達載體中，啟動子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能表達。而圖甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者目的基因均不能轉(zhuǎn)錄，所以都不能表達目的基因的產(chǎn)物。 (3)常見DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4DNA連接酶。 5．[xx全國卷Ⅱ]已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(P)，該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}： (1)從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對蛋白質(zhì)的________進行改造。 (2)以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內(nèi)容包括________的復(fù)制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：________________________________________。 (3)蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過________________________和________________________，進而確定相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對蛋白質(zhì)的生物________進行鑒定。 答案　(1)氨基酸序列(或結(jié)構(gòu))(其他答案合理也可)　(2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質(zhì))　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯) (3)設(shè)計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)　推測氨基酸序列　功能 解析　(1)由題干信息可知，改造蛋白質(zhì)的功能可通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)。 (2)依據(jù)蛋白質(zhì)工程的定義及題中信息可知，獲得P1基因的途徑有修飾現(xiàn)有(P)基因或合成新(P1)基因。中心法則的全部內(nèi)容包括DNA的復(fù)制、RNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄和翻譯。 (3)蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列。通過蛋白質(zhì)工程合成的蛋白質(zhì)還需要進行生物活性的鑒定即功能鑒定，看是否達到人們的需求。 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 限時規(guī)范特訓(xùn) 一、選擇題 1．下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，正確的是(　　) A．切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均特異性地識別6個核苷酸序列 B．PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng) C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因 D．抗蟲基因即使成功地插入到植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達 答案　D 解析　切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶可特異性識別4、5、6或8個核苷酸序列，A錯誤；PCR技術(shù)采用不同的溫度是為了變性、復(fù)性和延伸，B錯誤；載體質(zhì)粒通常含抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，便于篩選重組質(zhì)粒，C錯誤；抗蟲基因即使成功插入到受體細(xì)胞的染色體上，也不一定能表達，需進一步檢測鑒定，D正確。 2．基因工程技術(shù)也稱為DNA重組技術(shù)，其實施必須具備的四個必要條件是(　　) A．目的基因　限制酶　載體　受體細(xì)胞 B．重組DNA　RNA聚合酶　限制酶　連接酶 C．工具酶　目的基因　載體　受體細(xì)胞 D．模板DNA　mRNA　質(zhì)粒　受體細(xì)胞 答案　C 解析　目的基因、限制酶、運載體、受體細(xì)胞是基因工程必需具備的條件，此外還需要DNA連接酶，A錯誤；重組DNA是由目的基因和質(zhì)粒重組形成的，RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄需要的酶，基因工程技術(shù)不需要該種酶，B錯誤；限制酶和DNA連接酶屬于工具酶，另外運載體、目的基因和受體細(xì)胞是基因工程中必需具備的條件，C正確；mRNA是基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，基因工程中不需要提供該物質(zhì)，質(zhì)粒是運載體中的一種，除了質(zhì)粒還有動植物病毒和噬菌體衍生物，因此質(zhì)粒不是基因工程中必需的，D錯誤。 3．下圖表示轉(zhuǎn)基因動、植物的成功培育過程，有關(guān)敘述錯誤的是(　　) A．目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞A前，受體細(xì)胞要用Ca2＋處理，使其處于感受態(tài) B．①過程用到的生物技術(shù)包括動物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎移植 C．過程②要用到植物組織培養(yǎng)技術(shù) D．可通過標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞A、B進行篩選 答案　A 解析　受體細(xì)胞A一般為動物的受精卵，使用顯微注射法，不需要用氯化鈣處理，當(dāng)受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞時，才需要用氯化鈣處理以增加細(xì)胞膜的通透性，A錯誤；由于受體細(xì)胞A一般為動物的受精卵，所以培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因羊需要用到動物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎移植等技術(shù)，B正確；過程②需要將植物細(xì)胞培育成植株，所以要用到植物組織培養(yǎng)技術(shù)，C正確；標(biāo)記基因的作用是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來，因此通過標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞A、B進行篩選，D正確。 4．下列有關(guān)人胰島素基因表達載體的敘述，正確的是(　　) A．表達載體中的胰島素基因可通過人肝細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得 B．表達載體的復(fù)制和胰島素基因的表達均啟動于復(fù)