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2019-2020年高中生物人教版選修1教學案：專題五 課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段(含答案) 1．DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因 此，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 2．PCR反應需要DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶等條件。 3．PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合。 4．PCR每次循環(huán)都包括變性、復性和延伸三步。 5．DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這 段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。 一、PCR技術的原理 1．細胞內DNA復制的條件[填表] 原料 4種脫氧核苷酸 模板 2條DNA的母鏈 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸 2．PCR擴增的原理及條件 (1)概念：PCR即多聚酶鏈式反應，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。 (2)原理： ①子鏈的合成：DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物，DNA合成的方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 ②雙螺旋的打開：DNA的熱變性原理，即： 雙鏈DNA單鏈DNA。 (3)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶、一定的緩沖溶液以及能自動調控溫度的設備。 二、PCR的反應過程 三、PCR技術的實驗操作 1.實驗用具 (1)PCR儀：該儀器能自動調控溫度，實現(xiàn)DNA的擴增。如果沒有PCR儀，可用3個恒溫水浴鍋代替，操作時按程序在3個水浴鍋中來回轉移PCR反應的微量離心管。 (2)微量離心管：總容積為0.5 mL，實際上是進行PCR反應的場所。 (3)微量移液器：用于向微量離心管中轉移PCR配方中的液體。 2.注意事項 (1)為避免外源DNA等因素的污染，實驗中使用的一些用具在使用前必須進行高壓滅菌。 (2)所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存。 (3)在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。 四、DNA含量的測定 1.原理：利用DNA在260_nm的紫外線波段的吸收峰曲線來測定相應含量。 2.計算公式 DNA含量(μg/mL)＝50(260_nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)。 1．PCR技術控制DNA的解聚與結合是利用了DNA的(　　) A．特異性　　　　　　　 B．穩(wěn)定性 C．熱變性 D．多樣性 解析：選C　DNA分子在80～100 ℃的溫度范圍內變性，雙鏈解開成單鏈；當溫度緩慢降低時，又能重新結合形成雙鏈。 2．標準的PCR過程一般分為變性、復性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是(　　) A．92 ℃、55 ℃、72 ℃ B．72 ℃、55 ℃、92 ℃ C．55 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、55 ℃、72 ℃ 解析：選A　當溫度上升到90 ℃以上(90～96 ℃)時，雙鏈DNA解聚為單鏈，稱之為變性；當溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；當溫度上升到72 ℃左右(70～75 ℃)時，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。 3．PCR實驗中用到微量離心管、緩沖液和蒸餾水，使用前必須進行的關鍵步驟是(　　) A．反復洗滌 B．用酒精擦洗 C．高壓滅菌 D．在－20 ℃保存 解析：選C　在PCR實驗中，為了避免外源DNA等因素的污染，微量離心管、槍頭、緩沖液和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌。同時也不能忽視其他操作步驟，如 緩沖液和酶應該分裝成小份，并且在－20 ℃保存。 1．生物體內的DNA復制與PCR反應的比較 體內DNA復制 PCR反應 不 同 點 解旋 在解旋酶的作用下，邊解旋邊復制 加熱至90 ℃以上時，雙鏈全部解開 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 引物 一小段RNA RNA或單鏈DNA分子片段 合成子鏈 一條子鏈連續(xù)合成，另一條子鏈不連續(xù)合成 兩條子鏈都是連續(xù)合成 溫度 體內溫和條件 高溫 相同點 ①都需提供DNA復制的模板②都需要四種脫氧核苷酸原料③都需要分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物④子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端 2．PCR的反應過程 (1)變性：當溫度上升到90 ℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，如圖。 (2)復性：當系統(tǒng)溫度下降至50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合，如圖。 (3)延伸：當系統(tǒng)溫度上升至72 ℃左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如圖。 3．PCR反應的結果 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸。這樣，DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)形式擴增。 [題組沖關] 1．PCR過程與細胞內的DNA復制過程相比，主要有兩點不同，它們是(　　) ①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA ②PCR過程不需要DNA聚合酶 ③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的 ④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進行復制 A．③④　　　　　　　　　 B．①② C．①③ D．②④ 解析：選C　PCR過程與細胞內的DNA復制過程相比較，主要有兩點不同：①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長度通常為20～30個核苷酸； ②PCR過程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的。 2．在進行DNA親子鑒定時，需大量的DNA。PCR技術可以使樣品DNA擴增，獲得大量DNA克隆分子。該技術的原理是利用DNA的半保留復制，在試管中進行DNA的人工復制(如圖，圖中黑色長條是引物)。在很短的時間內將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需的遺傳物質不再受限于活的生物體。 (1)PCR需要模板DNA、引物、______________________________________________和 ____________________等條件，其中的引物實質上是一種_________________。 (2)圖中的變性、延伸分別是指______________________________________________、 ________________________。 (3)某樣品DNA分子中共含3 000個堿基對，堿基數(shù)量滿足：(A＋T)/(G＋C)＝1/2，若經5次循環(huán)，至少需要向試管中加入______個腺嘌呤脫氧核苷酸。(不考慮引物所對應的片段) (4)若下圖為第一輪循環(huán)產生的產物。請繪出以a鏈和b鏈為模板經PCR擴增的產物。 解析：(1)PCR技術中除需要模板DNA、引物、四種脫氧核苷酸外，還需要耐熱的DNA聚合酶等條件，其中的引物是一種單鏈DNA分子或RNA分子。(2)變性的實質是DNA雙鏈解旋；延伸是以DNA單鏈為模板，按堿基互補配對原則合成子鏈的過程。(3)由(A＋T)/(G＋C)＝1/2可知A∶T∶G∶C＝1∶1∶2∶2，所以A的比例為1/6，在一個DNA分子中的數(shù)量為3 0002(1/6)＝1 000(個)，5次循環(huán)形成的DNA數(shù)為32個，所以需要利用原料合成的DNA數(shù)相當于32－1＝31(個)，至少需腺嘌呤脫氧核苷酸數(shù)為311 000＝31 000(個)。(4)畫圖的關鍵是注意引物A、B的位置和所對應的模板鏈。 答案：(1)四種脫氧核苷酸　耐熱的DNA聚合酶　單鏈DNA分子或RNA分子　(2)模板DNA雙鏈解旋形成單鏈　在DNA聚合酶的作用下，脫氧核苷酸聚合形成新的DNA鏈　(3)31 000　(4)如圖 1．實驗操作步驟 2．DNA含量的測定 DNA在260 nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA含量有關。可以利用DNA的這一特點進行DNA含量的測定，具體方法如下： 注：計算公式中的50代表在波長為260 nm紫外波段照射下，吸收峰為1時，DNA含量為50 μg/mL。 [題組沖關] 3．使用PCR儀的具體實驗操作順序應為(　　) ①設計好PCR循環(huán)程序?、诎磁浞綔蕚浜酶鹘M分 ③用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分?、苓M行PCR反應　⑤離心，使反應物集中在離心管底部 A．②③⑤④① B．①⑤③②④ C．②③⑤①④ D．④②⑤③① 解析：選C　PCR反應的操作步驟一般分為準備(包括將 配方所需各組分放于實驗臺上)→移液→混合→離心→ 反應。因PCR儀是一種能自動控制溫度的儀器，設計好 循環(huán)程序就可以進行反應了。 4．下列有關PCR操作過程的敘述，錯誤的是(　　) A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 B．PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存 C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D．在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換 解析：選C　為了防止外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌；所用的緩沖液及酶應分裝成小份保存，并使用一次性槍頭。在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱中取出后應放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速 融化。 [隨堂基礎鞏固] 1．PCR技術是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，下列說法不正確的是(　　) A．PCR一般要經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復性和延伸三步 B．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高溫的特性 C．延伸的溫度大于復性的溫度，而小于變性的溫度 D．PCR技術可用于基因診斷、判斷親緣關系等 解析：選B　PCR技術需要耐高溫的DNA聚合酶，不需要解旋酶。 2．DNA的復制需要引物，其主要原因是(　　) A．可加快DNA的復制速度 B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補配對結合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA鏈 D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈 解析：選D　DNA的兩條鏈是反向平行的，為了明確表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，而磷酸基團的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從5′端開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。因此DNA復制需要引物，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 3．符合PCR反應條件的一項是(　　) ①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境?、贒NA模板　③合成引物 ④四種脫氧核苷酸?、軹aq DNA聚合酶　⑥DNA解旋酶 ⑦限制性核酸內切酶?、鄿乜卦O備 A．①②③④⑤⑥　　　　　 B．①②③④⑤⑥⑦⑧ C．③④⑤⑥⑦⑧ D．①②③④⑤⑧ 解析：選D　PCR反應模擬生物細胞內DNA復制的條件，只是不需要解旋酶，也不需要基因工程的工具酶(限制性核酸內切酶)。 4．PCR儀實質上是一臺自動調控溫度的儀器，它調控不同溫度的目的是(　　) ①95 ℃使DNA分子變性，失去生物活性 ②95 ℃使DNA分子變性，解開螺旋 ③55 ℃使DNA分子開始復制、延伸 ④55 ℃使DNA分子的兩條單鏈分別與兩種引物相結合 ⑤72 ℃使DNA分子開始復制、延伸 ⑥72 ℃使DNA分子恢復雙螺旋結構，恢復活性 A．①③⑤ B．②③⑤ C．②④⑤ D．②④⑥ 解析：選C　PCR技術在溫度上升到90 ℃以上時，雙鏈 DNA解旋變?yōu)閱捂湥划斚到y(tǒng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；當系統(tǒng)溫 度上升到72℃左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、G、C、T)在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。 5．如圖表示PCR擴增的產物，請分析它是哪次循環(huán)的產物(　　) A．第一次循環(huán) B．第二次循環(huán) C．第三次循環(huán) D．第四次循環(huán) 解析：選A　在PCR反應中以引物為標記，第一次循環(huán)時，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以，形成的每個子代DNA中只有一種引物。從第二次循環(huán)開始，第一次產生的DNA分子又可作為模板參與反應，形成的DNA分子中，只有兩個僅一端含有引物，其他DNA分子兩端都含有引物。 6．如圖所示為DNA變性和復性示意圖，相關說法正確的是(　　) A．向左的過程為加熱(80～100 ℃)變性的過程 B．向右的過程是DNA雙鏈迅速制冷復性 C．變性與在生物體內解旋過程的實質相同 D．圖中左側DNA片段共有4個游離的磷酸基團、4個3′端 解析：選C　DNA體外的變性和體內的解旋，其實質是相同的，都是使氫鍵斷裂，DNA雙螺旋打開，只是體內解旋需要解旋酶，體外變性需高溫條件。 7．PCR技術是把DNA片段在體外酶的作用下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異地擴增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本過程如下圖 所示： 注：圖中短線表示每次擴增過程中需要的引物。每個引物約含20個脫氧核苷酸，并分別與兩條單鏈DNA結合，其作用是引導合成DNA子鏈。 (1)PCR與體內DNA復制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度上，在PCR中先用95 ℃高溫處理的目的是________________；而這一過程在細胞內是通過________實現(xiàn)的。 (2)DNA子鏈復制的方向是____________，這是由于____________________________ ________________________________________________________________________。 (3)在PCR技術中所需要的引物實質上是一種________________。若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入________個引物。 (4)假定DNA片段含200對脫氧核苷酸，經3次擴增，從理論上計算需要________個游離脫氧核苷酸。 解析：在PCR中先用95 ℃高溫處理的目的是使DNA分子中的氫鍵斷裂，兩條鏈解開，使DNA分子解旋，形成單鏈。引物是一種單鏈DNA或RNA分子，它能與解開的DNA母鏈的3′端結合，為DNA聚合酶提供結合位點，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，從而決定了DNA子鏈復制的方向是從子鏈的5′端到3′端。在DNA分子擴增時，需要2種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復制的起點，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，若將1個DNA分子復制10次，則需要的引物為2210－2＝(211－2)個。擴增3次一共形成8個子代DNA片段，需游離的脫氧核苷酸數(shù)為(8－1)400＝2 800個。 答案：(1)使DNA變性(或使DNA的兩條鏈解開)　解旋酶　(2)從5′端到3′端　DNA聚合酶只能從引物的3′端連接單個脫氧核苷酸分子　(3)單鏈DNA或RNA分子　211－2　(4)2 800 [課時跟蹤檢測] 一、選擇題 1．關于PCR的說法，不正確的是(　　) A．PCR是體外復制DNA的技術 B．PCR過程中只需要一個模板DNA、兩個引物分子、大量脫氧核苷酸原料 C．Taq DNA聚合酶是一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 D．PCR利用的是DNA雙鏈復制原理 解析：選B　PCR技術是一種在體外迅速擴增DNA片段的技術；PCR過程除需要DNA分子雙鏈作為模板、兩種引物分子、大量脫氧核苷酸原料外，還需要酶等條件；Taq DNA聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶；PCR技術的原理和DNA的復制原理是一樣的，都是半保留復制。 2．關于DNA聚合酶催化合成DNA子鏈的說法，正確的是(　　) A．Taq DNA聚合酶是從深海生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的 B．DNA聚合酶能特異性地復制整個DNA的全部序列 C．Taq DNA聚合酶必須在每次高溫變性處理后再添加 D．DNA聚合酶是以DNA為模板，使DNA子鏈從5′端延伸到3′端的一種酶 解析：選D　Taq DNA聚合酶是在熱泉中發(fā)現(xiàn)的。PCR 擴增的是引物之間的固定長度的DNA序列。Taq DNA聚合酶能耐高溫，所以在反應體系中可反復利用而不用另外再添加。DNA聚合酶不能從頭開始催化合成 DNA，而只能從DNA單鏈的3′端延伸子鏈。 3．多聚酶鏈式反應是體外酶促合成特異DNA片段的一種方 法，由高溫變性、低溫復性及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，其簡要過 程如圖所示。下列關于PCR技術的敘述不正確的是(　　) A．PCR技術是在實驗室中以少量DNA制備大量DNA 的技術 B．反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板 C．PCR技術中以核糖核苷酸為原料，以指數(shù)方式擴增 D．應用PCR技術與DNA分子雜交技術可以檢測基因突變 解析：選C　PCR技術是體外大量擴增DNA的技術，即以少量DNA制備大量DNA的技術；PCR技術的原理是DNA復制，反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板，所需原料是脫氧核苷酸，以指數(shù)方式擴增；應用PCR技術與DNA分子雜交技術可以檢測基因突變。 4．PCR一般要經過三十多次循環(huán)，從第二次循環(huán)開始，上一 次循環(huán)的產物也作為模板參與反應，由引物Ⅰ延伸而成 的DNA單鏈作模板時將(　　) A．仍與引物Ⅰ結合進行DNA子鏈的延伸 B．與引物Ⅱ結合進行DNA子鏈的延伸 C．同時與引物Ⅰ和引物Ⅱ結合進行子鏈的延伸 D．無須與引物結合，在酶的作用下從頭合成子鏈 解析：選B　當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物端為5′端，因此與它互補的子鏈應從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結合延伸DNA的子鏈。 5．在PCR擴增DNA的實驗中，根據設計，一分子DNA經 30次循環(huán)后，應得到約230個DNA分子，但結果只有約 210個DNA分子。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是(　　) ①循環(huán)次數(shù)不夠?、赥aq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制?、垡锊荒芘c親鏈結合?、芟到y(tǒng)設計欠妥 A．①②③ B．①②④ C．①③④ D．②③④ 解析：選B?、傺h(huán)次數(shù)過少，產物的量比預期的少；②Taq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制會導致擴增效率低，得到的產物比預期的少；③如果引物設計不合 理，則無法進行擴增；④PCR系統(tǒng)設置不妥，將達不到預期 的效果。 6．下列關于PCR技術的敘述，正確的是(　　) A．PCR技術建立在對擴增的目的基因序列完全已知的基礎上 B．該技術需要解旋酶和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 C．該技術需要一對特異性的引物，要求一對引物的序列是互補的 D．該技術應用體內DNA雙鏈復制原理，也需要模板、原料、酶等條件 解析：選D　PCR技術不必知道目的基因的全部序列，只需知道部分序列，就可根據已知序列合成引物。PCR技術不需要解旋酶。PCR技術需要引物，但引物的序列不能是互補的，否則，在復性時，兩種引物通過堿基互補配對結合而失去作用。 7．下列有關PCR的敘述，正確的是(　　) A．PCR所需要的引物只能是RNA B．PCR所需要的原料是核糖核苷酸 C．PCR所需要的酶在60 ℃會變性 D．PCR需要在一定的緩沖液中進行 解析：選D　PCR所需的引物是一小段DNA或RNA。PCR所需要的原料是脫氧核糖核苷酸。PCR所需要的 酶是耐高溫的Taq DNA聚合酶。 8．在PCR的實驗操作中，下列說法正確的是(　　) ①在微量離心管中添加各種試劑時，只需要一個槍頭 ②離心管的蓋子一定要蓋嚴 ③用手指輕彈離心管壁 ④離心的目的是使反應液集中在離心管的底部 A．①②③ B．①②④ C．②③④ D．①③④ 解析：選C　在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，以確保實驗的準確性；蓋嚴離心管口的蓋子，防止實驗中外源DNA污染；用手指輕輕彈擊離心管的側壁，使反應液混合均勻；離心的目的是使反應液集中在離心管的底部，提高反應效果。 9．復性溫度是影響PCR特異性的較重要的因素。變性后溫度快速冷卻至40～60 ℃，可使引物與模板發(fā)生結合。PCR的結果可不考慮原來解旋開的兩個DNA模板鏈的重新結合，原因不包括(　　) A．由于模板DNA比引物復雜得多 B．引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞 C．加入引物的量足夠多而模板鏈數(shù)量少 D．模板鏈加熱解旋已經變性不可能再次結合 解析：選D　DNA雙鏈變性解旋后是可以再次結合的，只不過是在PCR中，引物量較多，與DNA模板鏈結合機會大，而原來兩條母鏈再次結合的機會小。 10．如圖中PCR第二輪產物a、b、c、d分別是以PCR第一輪產物的哪一條單鏈DNA為模板復制產生的(　　) A．②①③④ B．①③④② C．①②④③ D．①②③④ 解析：選D　因為PCR的反應過程需要引物，在第二輪循環(huán)的產物中，a、d的引物分別為Ⅰ、Ⅱ，無引物的為模板鏈(即①、④)，則b、c的模板鏈分別為②、③。 二、非選擇題 11．PCR技術是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術，下圖表示合成過程，請據圖分析回答： (1)A過程高溫使DNA變性解旋，對該過程的敘述，正確的是(　　) A．該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B．該過程用到限制酶破壞磷酸二酯鍵 C．該過程不需要解旋酶的作用 D．該過程與人體細胞的過程完全相同 (2)C過程要用到的酶是________________。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴增時可以______加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反應除提供酶外，還需要滿足的基本條件有______________________________________________________ ______________________________________________________________________________。 (3)如果模板DNA分子共有a個堿基對，其中含有胞嘧啶m個，則該DNA復制10次，需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸____________________個。 (4)PCR中由堿基錯配引起的變異屬于________________________________________。 假設對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，之后正常配對，則擴增若干次后檢測所有DNA的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占________________ ________________________________________________________。 解析：(1)高溫所起的作用類似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂湣?2)C過程是PCR技術的延伸階段，當系統(tǒng)溫度上升至72 ℃左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。Taq DNA聚合酶具有耐高溫的特性，所以一次性加入即可。(3)在一個雙鏈DNA分子中，C＋T占堿基總數(shù)的一半，則T的數(shù)目為(a－m)個，復制10次，新增加了(210－1)個DNA分子，故需補充胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)目為(210－1)(a－m)個。(4)基因中堿基對的改變屬于基因突變。以一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配，以后按正常配對方式進行擴增，以錯配鏈作為模板擴增的都是錯誤的DNA分子，原正常鏈擴增得到的DNA分子都是正常的DNA分子，故若干次后檢測所有DNA的擴增片段，與原DNA相應片段相同的占3/4。 答案：(1)C　(2)Taq DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行　 (3)(210－1)(a－m)　(4)基因突變　75% (或3/4) 12．請回答基因工程方面的有關問題： (1)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(如下圖所示)。 圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成、延伸的基礎。①從理論上推測，第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為____________。 ②在第________輪循環(huán)產物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。 (2)設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。 ①第1組：______________________________________________________________ ________________________________________________________________________； ②第2組：_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)①從理論上推測，第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效；②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。 答案：(1)①15/16?、谌? (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效 ②引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效 (3)DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 13．如圖為細胞內DNA復制過程示意圖，該過程在體外也可進行，以獲得大量相同的DNA片段，該項技術被稱為PCR技術，又稱多聚酶鏈式反應，請分析回答： (1)PCR過程與細胞內DNA復制相比，主要不同點______________。 (2)PCR技術過程的三個步驟是：________、________、________。 (3)假設PCR過程中，只用一個DNA片段作為模板，30次循環(huán)后，理論上反應物中有______個這樣的DNA片段。 (4)PCR技術能在幾小時內將微量的DNA片段特異性地擴增上百萬倍，從而解決了樣品中DNA含量低，難以分離的難題，試舉兩例，說明PCR技術的應用：_______________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)PCR過程與細胞內DNA復制相比，主要不同點是：PCR過程是高溫變性解旋，不需要解旋酶。(2)PCR的每次循環(huán)可以分為變性、復性和延伸三步。(3)由于一個DNA片段作為模板，一次循環(huán)能產生2個DNA片段，所以30次循環(huán)后，反應物中大約有230個這樣的DNA片段。(4)PCR技術有廣泛的應用，可以用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、親子鑒定等方面。 答案：(1)PCR過程是高溫變性解旋，不需要解旋酶 (2)變性　復性　延伸　(3)230　(4)刑偵破案、親子鑒定、疑難疾病的診斷、基因序列分析等