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生物選修1 人教版 專題5DNA和蛋白質技術課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段 要點突破 一 生物體內的DNA復制與PCR反應的比較 特別提醒 DNA單鏈有方向性 DNA母鏈的3 端對應著子鏈的5 端 即DNA的兩條鏈是反向平行的 注意不同酶的作用 解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開 而DNA聚合酶與DNA連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵的 DNA聚合酶是將單個核苷酸加到已有的單鏈片段的3 端上 需要模板 而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口 不需要模板 例1標準的PCR過程一般分為變性 復性 延伸三大步 這三大步需要的溫度依次是 A 92 50 72 B 72 50 92 C 50 92 72 D 80 50 72 解析 當溫度上升到90 以上 90 96 時 雙鏈DNA解聚為單鏈 稱之為變性 當溫度下降到50 左右 40 60 時 兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合 當溫度上升到72 70 75 時 溶液中的四種脫氧核苷酸 A T C G 在TaqDNA聚合酶的作用下 根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈 稱為延伸 答案 A 變式訓練1 PCR技術中 引物的作用是 A 打開DNA雙鏈B 催化合成DNA子鏈C 使DNA聚合酶能夠從引物的3 端開始復制D 提供模板解析 DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA 而只能從3 端延伸DNA鏈 引物的作用就在于此 答案 C 二 PCR技術的基本原理 類似于DNA的天然復制過程 由變性 復性 延伸三個基本反應步驟構成 1 模板DNA的變性模板DNA經加熱至95 左右一定時間后 使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的DNA的雙鏈解開 使之成為單鏈 以便它與引物結合 為下輪反應作準備 2 模板DNA與引物的退火 復性 模板DNA經加熱變性成單鏈后 溫度降至55 左右 引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合 3 引物的延伸DNA模板引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以四種脫氧核苷酸為反應原料 DNA母鏈為模板 按堿基配對與半保留復制原理 合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈 重復循環(huán)變性 復性 延伸三過程 就可獲得更多的 半保留復制鏈 而且這種新鏈又成為下次循環(huán)的模板 每完成一個循環(huán)需2 4min 2 3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 特別提醒 PCR擴增過程中的易錯點 PCR過程中無解旋酶 破壞氫鍵需要升高溫度才能打開氫鍵 但此時的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵 因此 熱變性后是DNA單鏈 并未分解成單體 復性時只是在引物和DNA單鏈之間形成氫鍵 兩條單鏈之間并未形成氫鍵 因此復性后 無雙鏈DNA分子形成 三 PCR的實驗操作 1 操作步驟 1 按PCR反應體系的配方配制所需試劑 2 用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組分 3 蓋嚴離心管口的蓋子 用手指輕輕彈擊管壁 4 將微量離心管放在離心機上 離心約10s 5 將離心管放在PCR儀上 設置好PCR儀的循環(huán)程序 以上過程可以概括為準備 移液 混合 離心 反應五大步 2 實驗結果與分析 1 實驗中DNA含量的測定 稀釋 取2 LPCR反應液 加入98 L蒸餾水 即將樣品稀釋了50倍 對照調零 以蒸餾水作空白對照 在波長260nm處 將紫外分光光度計的讀數調至零 測定 取DNA稀釋液100 L至比色杯中 測定260nm處的光吸收值 計算 DNA含量 g mL 50 260nm的讀數 稀釋倍數 2 理論上DNA擴增數目的計算 DNA擴增與DNA復制一樣 呈指數擴增 若只有一個DNA為模板 則復制n次后有2n個 若一開始有a個模板 則復制n次有a 2n個DNA 3 DNA擴增是否成功 檢測DNA片段擴增情況可以采用上述方法 也可以采用電泳檢測的方法 可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果 如果擴增不成功 則要分析失敗原因 可能的原因有 漏加了PCR的反應成分 各反應成分的用量不當 PCR程序設置不當等 例2下列操作過程的敘述中錯誤的是 A PCR實驗中使用的微量離心管 槍頭 緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌B PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份 并在 20 儲存C PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后 迅速融化D 在微量離心管中添加反應成分時 每吸取一種試劑后 移液器上的吸液槍頭都必須更換 解析 從冰箱中放置的緩沖液和酶取出后應放在冰塊上緩慢融化 而不能迅速融化 答案 C 變式訓練2 在PCR實驗操作中 下列說法不正確的是 A 在微量離心管中添加各種試劑時 只需一個槍頭B 離心管的蓋子一定要蓋嚴 防止液體外溢C 用手輕彈離心管壁的目的是使反應液充分混合D 離心的目的是使反應液集中在離心管部 提高反應效果 解析 在微量離心管中添加各種試劑時 每吸取一種試劑后 移液器上的槍頭必須更換 以確保實驗的準確性 離心管的蓋子一定要蓋嚴 防止實驗中脫落或液體外溢 離心10s的目的是使反應液集中在離心管部 提高反應效果 答案 A 本節(jié)小結 核心歸納1 DNA復制需要引物 是因為DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA 而只能從3 端延伸DNA鏈 2 PCR反應需要的條件有模板 引物 耐熱的DNA聚合酶 原料 四種脫氧核苷酸 溫度控制設備及一定的緩沖液 3 PCR每次循環(huán)分為變性 復性和延伸三步 對應的溫度分別為95 55 和72 4 PCR技術最突出的優(yōu)點是快速 高效 靈活 易于操作