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1、總結(jié) 第一章 1. 簡述基因操作、基因重組和基因工程的關(guān)系。 基因操作: 對基因進行分離、分析、改造、檢測、表達、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。 基因工程:專指為實踐應(yīng)用而進行的基因重組事件，產(chǎn)生的基因工程體可以用作生物反應(yīng)器，或改變了生物性狀的工程體等。 基因工程（基因操作）：主要是利用DNA 重組技術(shù)，將生物的某個基因或一個DNA片段通過基因載體（DNA載體）運送到另一生物的活性細胞中，然后經(jīng)過克?。╟lone）和行使正常功能（表達），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)分子技術(shù)（從細菌到高等生物）。 2. 為什么說基因工程是生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展的必然產(chǎn)物？ （1）基因的提出與基因和D

2、NA關(guān)系的建立，為基因重組打下物質(zhì)基礎(chǔ) （2）DNA結(jié)構(gòu)的闡明和DNA在生命活動中作用的認識，為基因操作打下了理論基礎(chǔ) （3）基因操作技術(shù)的發(fā)展直接導(dǎo)致基因工程的誕生和發(fā)展 （4）人們研究的熱情和對基因工程產(chǎn)品的迫切需求，進一步推動了基因工程的快速發(fā)展 3. 簡述基因的結(jié)構(gòu)組成對基因操作的影響。 (1)．基因及其產(chǎn)物的共線性 (2)．基因及其產(chǎn)物的非共線性 (3)．基因的重疊與基因的可變性 (4)．啟動子和終止子 4. 重組DNA技術(shù)包括哪些步驟 分---分離制備目的基因 切---切割目的基因和載體 接---目的基因與載體連接 轉(zhuǎn)---將重組DNA

3、導(dǎo)入宿主細胞 篩---篩選并檢定含有重組DNA分子的受體細胞克隆 表---克隆基因在受體細胞中進行復(fù)制與表達 5. 基因工程的流程 目的基因的分離制備→與載體體外重組→遺傳轉(zhuǎn)化→轉(zhuǎn)化子篩選→提取目的基因→測序 ↓ 獲得優(yōu)良品種 ←表達特定蛋白產(chǎn)物←導(dǎo)入宿主細胞←將目的基因克隆到表達載體 6.基因工程中所用酶類及作用特點 (1)限制性核酸內(nèi)切酶：在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進行切割 (2)DNA連接酶：將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體

4、(3)DNA聚合酶I：通過向3’端逐一增加核苷酸以填補雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性 (4) Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。 (5)反轉(zhuǎn)錄酶:以RNA或DNA鏈為模板合成互補的cDNA鏈 (6)DNA末端轉(zhuǎn)移酶:將寡聚物尾巴加到了線性雙鏈或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端 (7)堿性磷酸酶:去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團 (8)降解酶S1:降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時

5、也可切割雙鏈核酸分子的單鏈 (9)Taq DNA 聚合酶：能在高溫（72℃）下以單鏈DNA為模板，從5’→3’方向合成新的互補鏈。 （10）多核苷酸激酶：催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的5’－OH末端上 （11）核酸外切酶III:降解DNA3’－OH末端的核苷酸殘基 （12）脫氧核糖核酸酶：內(nèi)切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA 7. 常用的目的基因的獲取方法 構(gòu)建基因組文庫；構(gòu)建cDNA文庫；人工合成DNA技術(shù)；PCR擴增 8. 堿裂解法提取質(zhì)粒原理 高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大

6、，不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。 9. 常用的目的基因與載體的連接方法 （1）黏性末端連接：將靶基因DNA片段和載體DNA經(jīng)過相同的限制酶進行切割，使他們兩端產(chǎn)生相同的黏性末端，然后經(jīng)黏性末端堿基配對和DNA連接酶的作用，共價連接成為新的重組DNA分子。 （2）平頭末端連接:將平末端的DNA分子在T4連接酶的作用下，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵相互連接。 （3）人工接頭法：利用人工接頭加在平端的DNA片段的兩端，然后用相應(yīng)的限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶有相同黏性末端的載體進行連接。 （4）同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催

7、化下，在線性載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾，而在目的基因的分子兩端加上dC多聚尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶I或) Klenow DNA聚合酶填補裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。 第二章 1. 什么是細菌的限制－修飾系統(tǒng)，其功能是什么？ 細胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細胞中有限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modification system)。R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。 限制作用就是限制酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩(wěn)定性的機制。 甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A 成為N6 甲基-腺膘

8、呤，胞嘧啶C 成為5‘ 甲基胞 嘧啶。修飾作用是通過甲基化酶來的甲基化作用，是宿主細胞能識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的機制。 2. 說明限制性內(nèi)切核酸酶命名原則（舉例）。 3. 限制內(nèi)切核酸酶的星活性是指什么？ 星星活性（star activity）:在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。 4. T4 DNA ligase 和E.coli ligase 有什么異同？ 同：(1)催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。 (2)反應(yīng)底物為粘

9、端、切口、平端的RNA或DNA。 (3)低濃度的聚乙二醇PEG（一般為10%）和單價陽離子（150-200 mM NaCl）可以提高平端連接速率。 (4)連接反應(yīng)需要ATP.若在16℃反應(yīng)，大約需4小時；若在4℃反應(yīng)，則需反應(yīng)過夜。 不同：E.coli ligase需NAD+參與，且其平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA。作cDNA克隆時，不會將RNA連接到DNA，不連接RNA。 5. 連接酶的反應(yīng)溫度如何選擇，為什么？ 連接酶最適的反應(yīng)溫度應(yīng)是37℃。但在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，溫度過高，雖然酶反應(yīng)速度快，但是連接-斷開是雙向的，動態(tài)平衡，可能由于熱運動的關(guān)系，

10、斷開速度也快，溫度過低，連接速度太慢。4度過夜也是有很高的連接效率。因此連接反應(yīng)常采用的最佳溫度一般在4-16℃間，通常多選用12-16℃ 30分鐘到16小時。 6. 什么是Klenow酶？有什么作用？ Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenow frgment），或E.coli DNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coli DNA polymeraseⅠlargefragment）。 Klenow DNA聚合酶作用 ① 補平3′凹端，如果使用帶標記的dNTP，則可對DNA進行末端

11、標記。 ② 抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性 ③ 通過置換反應(yīng)對DNA進行末端標記 ④ 在cDNA克隆中合成第二鏈 ⑤ 隨機引物標記 ⑥ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA 7. 分子克隆的基本流程 8. 什么是限制性內(nèi)切酶？可劃為哪幾個類型？識別序列有結(jié)構(gòu)特點？ 限制性核酸內(nèi)切酶是由細菌產(chǎn)生的一類能夠特異性識別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。 限制酶的識別和切割位點序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6個堿基，且具有回文序列的DNA片段，主要產(chǎn)生5'、3'突出的黏性末端或平末端。當一個樣本DNA被一個特定的限

12、制酶切割后，可以產(chǎn)生一批相同的堿基序列的DNA片段，進而可以被用于基因重組、克隆、核酸分子雜交和序列分析等。 10. 簡述質(zhì)粒的基本性質(zhì)？ （1）質(zhì)粒的復(fù)制：質(zhì)粒含有復(fù)制起始區(qū)和復(fù)制調(diào)控原件?？蓪崿F(xiàn)自主復(fù)制 （2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：質(zhì)粒分為嚴謹性和松弛型，因而拷貝數(shù)不同 （3）質(zhì)粒的不相容性：兩個質(zhì)粒不能共存于同一個宿主細胞 （4）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：通過細菌的接合作用，質(zhì)?？梢员晦D(zhuǎn)移到新宿主細胞中 11. DNA聚合酶有哪些種類？各有什么活性？ 大腸桿菌DNA聚合酶I: 5‘--3’ DNA 聚合酶活性 5‘--3' DNA外切核酸酶活性 3'--5' DNA外切酶活性 Klenow酶

13、:5‘--3’ DNA 聚合酶活性 3'--5' DNA外切酶活性 T4 DNA聚合酶:3’-5’DNA外切酶活性 T7 DNA聚合酶:5‘--3’ DNA 聚合酶活性 3'--5' DNA外切酶活性（強） 反轉(zhuǎn)錄酶:5’→3’ DNA聚合酶活性5‘--3' RNA外切核酸酶活性 3'--5'RNA外切酶活性 12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？ 重組DNA導(dǎo)入受體細胞后，檢測目的基因是否表達的第一個步驟就是篩選。 方法：（1）抗藥性標記及其插入失活選擇法 （2）b-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 第三章 1. 作為一個最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？ (1

14、) 具有復(fù)制起點，可在宿主細胞中進行獨立復(fù)制。 (2) 具有抗菌素抗性基因，便于篩選。 (3) 具若干限制酶單一識別位點，可以進行特異性酶切。 (4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，便于制備。 2. 何為α-互補，其基本原理是什么？在載體構(gòu)建中有何作用？ α-互補（α-complementation）：是指lacZ基因上缺失近操作子基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操作子基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶基因的突變體之間實現(xiàn)互補。 α-互補是基于在兩個不同的缺陷β-半乳糖苷酶之間可實現(xiàn)功能互補而建立的。 在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個堿基對的多克隆位點），不影響

15、β-半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。若在該DNA 小片段中再插入一個大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無α-互補能力的β-半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。 3. 藍白斑篩選的原理 大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β-半乳糖苷酶。 lacZ△M15 基因是編碼缺失了β-半乳糖苷酶中第11-41 個氨基酸的lacZ 基因無酶學(xué)活性。對于只編碼N-端140 個氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ′) ，其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。 這兩個無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時，可恢復(fù)β-半乳糖苷酶的活性，實現(xiàn)基因內(nèi)互補。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（

16、如51 個堿基對的多克隆位點），不影響β-半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。 若在該DNA 小片段中再插入一個大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無α-互補能力的β-半乳糖苷酶片段。 利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。 在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15 放在F 質(zhì)粒上,隨宿主傳代； lacZ ’放在載體上, 作為篩選標記。 4. 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問題？ (1)較大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌體擴增過程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長的噬菌體更具競爭優(yōu)勢所致。 (2)單鏈載體分子感染的細胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類型的分子

17、(尤其是雙鏈分子)比較費力，同時由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失，培養(yǎng)時間不能長，故所得DNA的量有限。 (3)重組中，經(jīng)常出現(xiàn)一些能以兩種可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNA片段的情況，這是因為外源DNA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致。 5. 解釋下列名詞: 基因工程載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞(host cell)的工具.載體是基因工程技術(shù)的核心細菌的質(zhì)粒、酵母的質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA的衍生物等，經(jīng)過改造都可以成為載體。 插入失活：通過插入失活進行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因

18、（ampr）兩種抗性標記。當外源DNA 片段插入tetr 基因后，導(dǎo)致tetr 基tet tet 因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。 琥珀突變：在基因的編碼區(qū)中，若某個密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA），或琥珀突變（突變?yōu)閁AG），或乳白突變（突變?yōu)閁GA）。 噬菌粒: 在質(zhì)粒中插入絲狀噬菌體的主要基因區(qū)域(1.3kb)，構(gòu)成一種特殊的質(zhì)粒載體，其基因區(qū)包括： a.噬菌體DNA合成起始和終止區(qū)。b.絲狀噬菌體顆粒裝配所需的序列c.帶有E.coli的復(fù)制點(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴增

19、。 6.簡述M13KO7輔助噬菌體的遺傳學(xué)特性和生物學(xué)功能？ 遺傳學(xué)特性：基因II基因突變，由G變?yōu)門。突變的基因II產(chǎn)物減弱了與自身攜帶的噬菌體復(fù)制起點的作用。 生物學(xué)功能：當與噬菌粒載體共同存在于宿主細胞時M13KO7表達后的基因產(chǎn)物優(yōu)先作用于噬菌粒，使其進行單鏈復(fù)制。 第四章 1. 大容量克隆載體有哪些種類，各有何特點？ 黏粒載體（cosmid）；酵母人工染色體載體（YAC）；細菌人工染色體載體(BAC)； P1噬菌體載體(P1)；P1人工染色體載體(PAC) 2. 簡述黏粒、YAC、BAC克隆載體基本構(gòu)成元件。 黏粒：質(zhì)粒復(fù)制起點（ColE1）、抗性標記（ampr）、c

20、os位點。 YAC：自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere, CEN）和兩個端粒（TEL）。 BAC：復(fù)制單元的特殊性:來自F質(zhì)粒，包括嚴謹型控制的復(fù)制區(qū)oriS，啟動DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動的解旋酶（RepE）以及3個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷貝性可以減小外源基因的表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒副作用。標記基因:氯霉素抗性基因 3. 黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點？ 優(yōu)（1）同時具有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特性 （2）具有高容量的克隆能力

21、 缺（1）兩個粘粒之間，當存在同源序列時，可能會發(fā)生重組，結(jié)果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。 （2）含不同重組DNA的菌落生長速度不一。當柯斯質(zhì)粒文庫復(fù)制擴增時，由于不同的插入片段對宿主細胞作用的情況不同，結(jié)果會出現(xiàn)各種外源DNA片段間的比例失調(diào)。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。 （3）包裝蛋白制備過程較復(fù)雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。而且，購買包裝蛋白的費用較高。 5. 簡述P1噬菌體載體的基本構(gòu)成元件。 ⑴ 復(fù)制元件：質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子 ⑵ 環(huán)化和包裝信號：2個loxP重組位點和包裝識別位點pac,用于體外包裝 ⑶ 標記基因：kanr;果聚糖蔗糖酶基因sacB

22、，含sacB的大腸桿菌在蔗糖培養(yǎng)基上不能存活，用于插入失活篩選重組子。 ⑷ 克隆位點： sacB內(nèi)部 ⑸ 填充片段：11kb腺病毒，作為填充物彌補外源DNA片段長度。 第五章 1. 以大腸桿菌為例，表達載體比克隆載體多了哪些功能元件，各有什么生物學(xué)功能？ ⑴ 啟動子：轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶在啟動子部位啟動RNA轉(zhuǎn)錄的過程。當轉(zhuǎn)錄啟動以后，RNA聚合酶對啟動子下游要轉(zhuǎn)錄的序列是無法識別的，這就為利用強啟動子來表達目的基因提供了可能。 ⑵ 終止子：轉(zhuǎn)錄會受到模板RNA序列結(jié)構(gòu)的影響，當遇到頸環(huán)結(jié)構(gòu)時轉(zhuǎn)錄便會停止，或遇到ρ因子介導(dǎo)的終止信號轉(zhuǎn)錄也會停止。 ⑶ 核糖體結(jié)合位點： 細胞中的核

23、糖體必須在mRNA上找到有效的核糖體結(jié)合位點（RBS）以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列），從而啟動鄰近其下游的翻譯起始密碼子的蛋白質(zhì)翻譯。 2. 簡述表達載體構(gòu)建的一般原則。 表達載體實際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達所需的元件，當外源基因被接入合適的位點后，在宿主中啟動表達，因此表達載體的構(gòu)建原則主要體現(xiàn)在表達元件的選擇和利用。 （1）啟動子選擇 A.超量表達：以獲得最大限度的目的產(chǎn)物，則選擇高強啟動子，在適當條件下可使外源基因高水平表達，如大腸桿菌的Plac。 B.使某關(guān)鍵基因表達：使宿主表現(xiàn)出一種特殊性或啟動其他產(chǎn)物合成?？墒褂没蜃陨韱幼踊蛩拗飨嚓P(guān)性狀

24、基因的啟動子。 （2）轉(zhuǎn)錄有效性 A.在載體上設(shè)法除去衰減序列或插入轉(zhuǎn)錄終止序列，以防止轉(zhuǎn)錄提前終止。 B.在終止密碼子之后增加終止序列，使轉(zhuǎn)錄確有效終止。 （3）翻譯的有效性 A.選用最佳密碼子AUG B.SD序列相似或相同 C.采用UAA終止密碼子 3. 何為穿梭載體，在遺傳結(jié)構(gòu)上有何特點？ 穿梭載體（shuttle vector）是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體，如有些載體既能在原核細胞中復(fù)制又能在真核細胞中復(fù)制，或能在E.coli中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細菌中復(fù)制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起

25、點與選擇標記，另有一個多克隆位點區(qū)。此類型的載體既可在大腸桿菌細胞和釀酒酵母細胞中復(fù)制，可實現(xiàn)在兩種不同的寄主細胞之間來回轉(zhuǎn)移基因，并單獨或同時在兩種宿主細胞中研究目的基因的表達活性及其它的調(diào)節(jié)功能。 4. 將人的某個基因在大腸桿菌中表達應(yīng)注意哪些問題？ （1）序列為去掉內(nèi)含子的cDNA序列 （2）要用原核啟動子。檢查真核基因密碼子偏好是否存在原核表達系統(tǒng)的稀有密碼子。稀有密碼子的地方會成為表達瓶頸，對其進行點突變。 （3）若單獨的蛋白無活性，考慮是否統(tǒng)一起到克服分子伴侶的基因 （4）控制表達條件，盡量不要形成包涵體 5.利用原核細胞表達真核基因的難點在哪？ （1）真核基因含有內(nèi)

26、含子序列，原核細胞中無法切除內(nèi)含子，從而無法表達蛋白產(chǎn)物。 （2）細菌的RNA聚合酶無法識別真核啟動子。 （3）表達出的真核蛋白產(chǎn)物易被細菌的蛋白酶降解。 （4）在原核細胞中，真核基因所表達出的蛋白往往不能進行正常的折疊，而形成沒有活性的包涵體。 6.分離純化RNA應(yīng)注意什么？ （1）由于RNA是單鏈，易受到核酸酶的攻擊，應(yīng)盡量避免RNA的降解。 （2）盡量簡化操作步驟，縮短時間。 （3）防止機械剪切和高溫對RNA的傷害，剪切和高溫可能會導(dǎo)致降解。 （4）維持pH4—10，防止核酸在堿性條件下降解。 7. 簡述PET表達系統(tǒng)的特點及工作原理 特點：表達載體pET-5a是典型

27、的pET載體，含T7噬菌體啟動子序列，當外源基因插入其下游的幾個酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導(dǎo)表達。 （1）T7噬菌體啟動子只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識別并啟動轉(zhuǎn)錄，而大腸桿菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌體啟動子。 （2）用于表達的宿主細胞必須能表達T7噬菌體的RNA聚合酶。 （3）大腸桿菌BL21（DE3）是常用的pET表達載體的宿主菌，該菌對T7 RNA聚合酶和目的基因的轉(zhuǎn)錄實行多層次的調(diào)控。 （4）控制外源基因嚴謹表達的2個系統(tǒng) A.通過宿主控制T7 RNA聚合酶的量來實現(xiàn)的 在宿主細胞中引入一個帶有T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質(zhì)粒，它們表達T7噬菌體的溶菌酶

28、。該溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，從而減少在未誘導(dǎo)情況下外源基因的表達。 B.使啟動子的控制效應(yīng)更嚴謹。 在pET載體上裝載lacⅠ基因，提高阻抑物的濃度。也可利用T7-lac啟動子。在當阻抑物結(jié)合在lacO位點時，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也無法表達。只有當誘導(dǎo)物存在時，才能解開T7 RNA聚合酶基因和外源基因表達的雙重阻遏。 工作原理：pET載體進入大腸桿菌BL21（DE3）中后，由于宿主細胞的的lac I基因表達產(chǎn)生阻遏物，從而抑制T7 RNA聚合酶基因的表達，在載體上的目的基因也無法表達，當IPTG誘導(dǎo)物加入時，使阻遏物失去抑制作用，T7 RNA聚合酶基因可以表

29、達，從而啟動T7啟動子控制外源基因的表達。 8.簡述利用T7噬菌體啟動子的表達系統(tǒng)的表達調(diào)控模式。 （1）在表達載體上使用T7啟動子，在宿主細胞中表達T7 RNA聚合酶，構(gòu)成了表達系統(tǒng)。 （2）T7啟動子的轉(zhuǎn)錄活性和宿主T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性均受IPTG的誘導(dǎo)、 第八章 1. 簡述PCR擴增的原理和過程？如果要擴增某基因，需要知道什么信息? 原理：利用生物體內(nèi)DNA的半保留復(fù)制原理。在體外采用變性、退火、延伸過程，以含有目的片段的DNA為模板，根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物，在DNA聚合酶作用下實現(xiàn)目的基因擴增。 目的基因的基本信息：片段大小、序列和堿基特點等。據(jù)此來決定PCR策

30、略。如果是已知序列，可設(shè)計引物，直接從含有目的基因序列的DNA中擴增；知道部分序列的，先PCR獲得該序列，再采用RACE或反向PCR等技術(shù)獲得全長序列。 過程：（1）變性（denaturation）：將模板DNA置于92-96℃，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì) （2）退火（annealing）：將溫度降至37-72℃，使引物與模板的互補區(qū)相結(jié)合 （3）延伸（extension）：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘-OH端，合成DNA。 這三個熱反應(yīng)過程的重復(fù)稱為一個循環(huán)，經(jīng)過20-40個循環(huán)可擴增得到大量位于兩條引物之間序列的DN

31、A片段。 2. T/A克隆的基本原理是什么？ Tap DNA聚合酶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3’末端添加一個核苷酸，通常為A。因此，Tap DNA聚合酶擴增的產(chǎn)物可與T-載體進行黏端互補連接，達到高效克隆的目的。 3. PCR技術(shù)有哪些應(yīng)用？ 4. PCR引物有哪些基本要求？ ① 長度：至少16 bp，通常為18-30 bp，更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性。 ② 解鏈溫度（Tm值）：兩個引物之間的Tm值差異最好在2-5℃。 ③ 避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（3個堿基） ④ G＋C含量盡量控制在40%-60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻

32、。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3′末端的重復(fù)排列。 ⑤ 引物的3′末端最好是G或C，但不要GC連排。 第九章 1. 簡述化學(xué)降解法測序的基本原理以及主要應(yīng)用范圍。 原理：將待測DNA片段的5‘端磷酸基團作放射性標記，再分別采用不同的化學(xué)方法對特定堿基進行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列長度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過并列點樣（lane-bylane）的方式用凝膠電泳進行分離，再經(jīng)放射自顯影，即可讀出目的DNA的堿基序列。 核心原理:特定化學(xué)試劑可對不同堿基進行特異性修飾并在被修飾的堿基處（5′或3′）打斷磷酸二酯鍵，從而達

33、到識別不同堿基種類的目的。 應(yīng)用: Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法不需要進行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差；對未經(jīng)克隆的DNA片段可以直接測序。化學(xué)降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤、G＋C含量較高的DNA片段以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。 測定長度大約250個堿基。 2. 簡述Sanger雙脫氧鏈終止法測序的原理。 雙脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的3‘位置的-OH缺失，致使下位核苷酸的5‘磷酸基團無法與之結(jié)合。一旦雙脫氧核苷酸整合到正在合成的DNA鏈中，該股DNA的合成就到此終止。 第十一章 1. 基因組DNA文庫有哪些類型？其相關(guān)的特點是什么？

34、 ⑴ 質(zhì)粒文庫 質(zhì)粒載體所容納的外源DNA片段一般在10kb以內(nèi)。這類基因組DNA文庫一般應(yīng)用于“鳥槍法”全基因組測序研究和用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。 ⑵ 噬菌體文庫 噬菌體文庫是以細菌噬菌體基因組衍生的一系列載體系統(tǒng)構(gòu)建的，常用的有l(wèi)噬菌體載體、M13單鏈噬菌體載體、P1噬菌體載體及由噬菌體衍生的質(zhì)粒載體。 M13載體所容納的外源片段較小，一般用于構(gòu)建cDNA文庫或BAC和PAC亞克隆文庫。 噬菌體文庫中應(yīng)用最廣泛的是l噬菌體。由于其有利于利用分子雜交的方法進行篩選，用l噬菌體構(gòu)建的基因組DNA文庫在小基因組物種的基因克隆中起著重要作用。 ⑶ 黏粒文庫 黏粒又稱柯斯質(zhì)粒

35、，是由l噬菌體的cos序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列及抗生素抗性基因構(gòu)建而成的一類特殊的質(zhì)粒載體。黏粒載體和噬菌體載體類似，主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組DNA文庫。利用它們在篩選上的優(yōu)勢來分離單個基因或構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組DNA文庫等。 ⑷ 人工染色體文庫 包括酵母人工染色體文庫、細菌人工染色體文庫和P1人工染色體文庫，也稱為大片段基因組DNA文庫，容納的外源DNA片段為100 kb-1 Mb。主要用于大基因組物種的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測序等，在基因組研究中應(yīng)用越來越廣泛。 ⑸ 亞基因組文庫 亞基因組文庫是相對于基因組文庫提出的，文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)

36、段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段（如一個YAC或BAC克隆等）。 2. 均一化cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是什么？ 兩種方法：基因組DNA飽和雜交法和基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化方法 基因組DNA飽和雜交法:原理是不同表達水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相同 基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化方法：高豐度cDNA復(fù)性所需時間短，低豐度cDNA復(fù)性所需時間長。羥基磷石灰柱可將單鏈與雙鏈DNA分開。 3. 扣除cDNA的基本原理是什么？ 將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本（tester），將基因表達譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體

37、作為對照樣本（driver）。將tester和driver的cDNA進行多次雜交，去掉在二者之間都表達的基因，而保留兩者之間差異表達的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達的基因的可能性也大大提高。 4. 如何構(gòu)建全長cDNA文庫 有三種方法：SMART法，cap-trapper法，TAP（煙草酸焦磷酸酶）法 SMART法：利用反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在第一鏈cDNA3’末端加上幾個dC。加入帶有幾個dG的特異性引物,該引物會與第一鏈互補結(jié)合，再繼續(xù)合成第二鏈。利用接頭錨定的方法提高了全長DNA的比例。 第十三章 1. 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)具備的條件？ （1）較

38、高的遺傳穩(wěn)定性 （2）具有穩(wěn)定的外植體來源 （3）對選擇抗生素敏感 （4）對農(nóng)桿菌有敏感性 （5）是否具有經(jīng)濟價值或有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價值 2. 植物基因工程常用的受體系統(tǒng)有哪些？ (1)愈傷組織再生系統(tǒng) (2)直接分化再生系統(tǒng) (3)原生質(zhì)體再生系統(tǒng) (4)生殖細胞受體系統(tǒng) 3. 植物基因轉(zhuǎn)化方法有哪些？ (1)原生質(zhì)體介導(dǎo)法: PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化，電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化， 顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 (2)基因槍法 (3)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 4. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的基本原理及分子機理？ 在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個大的致瘤質(zhì)粒（t

39、umor inducing plasmid），簡稱Ti質(zhì)粒。 當根癌農(nóng)桿菌感染植物的時候，菌體本身并不進入植物細胞內(nèi)，而僅是Ti質(zhì)粒中的一部分稱之為“T-DNA”的DNA片段進入寄主細胞并插入基因組中，T-DNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。 Ti質(zhì)粒有兩個區(qū)域：T-DNA區(qū)（是質(zhì)粒上能夠轉(zhuǎn)移整合入植物受體基因組并能在植物細胞中表達從而導(dǎo)致冠癭瘤的發(fā)生，且可通過減數(shù)分裂傳遞給子代的區(qū)域）和Vir區(qū)（編碼能夠?qū)崿F(xiàn)T-DNA轉(zhuǎn)移的蛋白）。 Vir區(qū)位于T-DNA以外的一個35 kb 內(nèi)，其產(chǎn)物對T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合必不可少。 農(nóng)桿菌侵染植物首先是吸

40、附于植物表面?zhèn)?，受傷植物分泌的酚類小分子化合物可以誘導(dǎo)Vir基因的表達。Vir產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生一條新的T-DNA單鏈分子。此單鏈分子從Ti質(zhì)粒上脫離后，可以與Vir產(chǎn)物VIRD 2 蛋白共價結(jié)合，并在VIRD 4和VIRB等蛋白的幫助下從農(nóng)桿菌進入植物細胞的染色體中。 5. 什么是二元載體？和一元載體比有什么優(yōu)點？ 雙元載體(binary vector)系統(tǒng)是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，也因為其T-DNA與Vir基因在兩個獨立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移故稱之為反式載體(trans vector) 優(yōu)點：首先，二元載體的構(gòu)建較為方便

41、；而一元載體還需在根癌農(nóng)桿菌中進行共整合，構(gòu)建效率相對較低。其次，二元載體的外源基因的轉(zhuǎn)化效率要高于一元載體。 6. 植物轉(zhuǎn)化常用的選擇基因和報告基因有哪些？報告基因有什么特點？ 選擇基因：新霉素抗性基因（neor）、慶大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因（hpt），以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar） 報告基因：β-葡萄糖甘酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）熒光素酶基因（luc） 綠色熒光蛋白（GFP）基因（gfp） 特點：① 報告分子不存在于宿主中或易于與內(nèi)源性基因相區(qū)別 ② 應(yīng)有一個簡單、快捷、靈敏及經(jīng)濟的分析方法 ③ 報告基因的分析結(jié)

42、果應(yīng)具有很強的線性范圍，便于分析啟動子活性的大小變化 ④ 報告基因的表達必須不改變受體細胞或生物體生理活動 7. 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有哪些？ 鑒定：1. PCR檢測外源基因的整合 2. Southern 雜交檢測外源基因的整合 3. RT-PCR 檢測外源基因的表達 4. Northern雜交檢測外源基因的表達 5. Western雜交檢測外源基因表達的產(chǎn)物 8. 簡述建立植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的主要考慮因素 影響基因受體選擇的因素包括基因轉(zhuǎn)化方法、受體的再生能力、受體材料的生理狀態(tài)和再生途徑，以及體細胞無性系變異的發(fā)生等。其中限制基因轉(zhuǎn)移的首要因素當屬受體的再生能力，因為建立高

43、頻植株再生體系是植物基因轉(zhuǎn)化的一個重要條件，但是其他因素在不同程度上和以不同方式影響植物基因轉(zhuǎn)化的有效性。 第十四章 1. 簡述反轉(zhuǎn)錄病毒在動物基因工程中的作用。 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合到宿主細胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制并由5‘-LTR中的一個強啟動子轉(zhuǎn)錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時又具有mRNA模板活性，翻譯出結(jié)構(gòu)。蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。在宿主細胞質(zhì)中，兩條相同的RNA鏈和反轉(zhuǎn)錄酶被包裝于內(nèi)殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽殖方式分泌至細胞外，但通常不致死宿主細胞 2. 動物基因工程中載體的類型及功能 類型：1.質(zhì)粒載體 2.病毒載體：腺病毒，與腺病毒相

44、關(guān)病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒 3.定向打靶載體 功能：1.將外源基因?qū)胧荏w細胞 2.讓外源基因整合進入基因組中 3.介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移與表達 3. 簡述基因?qū)雱游锛毎姆椒? 向真核細胞轉(zhuǎn)移外源基因的方法大致可分為下面3類： (1)．物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法 (2)．化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體融合法 (3)．病毒感染法 制備轉(zhuǎn)基因動物常用的方法： 常用的有顯微注射法、胚胎干細胞介導(dǎo)法和核移植法。 顯微注射法（microinjection）是利用玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的

45、重組（rearrangement）、缺失（deletion）、復(fù)制（duplication）或易位（translocation）等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。 胚胎干細胞介導(dǎo)法是將外源基因?qū)肱咛ジ杉毎缓髮⑥D(zhuǎn)基因的胚胎干細胞注射入受體動物胚胎后，可參與宿主的胚胎構(gòu)成，形成嵌合體，直至達到種系嵌合。 核移植法是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動物體內(nèi)的方法。 4. 簡述轉(zhuǎn)基因小鼠的制備過程。 DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠 ⑴ 超數(shù)排卵 對年輕、

46、健康未孕母鼠（4-5周齡）注射促性腺激素，誘導(dǎo)超數(shù)排卵，與種公鼠合籠交配，從輸卵管的壺腹部收集原核期受精卵。 ⑵ 基因準備 從整合率上看線形DNA分子要好于環(huán)形DNA，而環(huán)形DNA在細胞內(nèi)的半衰期較長，適用于瞬間表達與基因治療。盡管載體DNA序列不影響外源DNA的整合效率，但載體序列能抑制轉(zhuǎn)基因的表達，因此應(yīng)盡量去除轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中的載體部分。 ⑶ 顯微注射 （1）外源DNA進入原核 （2）培養(yǎng)液中培養(yǎng) （3）進行冷凍保存，或直接用于移植，或繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育到囊胚后再移植。 ⑷ 胚胎移植 胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依據(jù)早期胚胎的發(fā)育階段和物種的不同決定移植的部位。注射后的單細胞

47、至桑葚期的胚胎應(yīng)移植到0.5d假孕鼠的輸卵管內(nèi)，而達到囊胚期的胚胎則須轉(zhuǎn)移至2.5 d假孕鼠子宮內(nèi)。未經(jīng)注射的新鮮胚胎的移植成功率為50%-70%，注射胚胎移植后的受胎率有所下降，僅為10%-30%。 ⑸ 轉(zhuǎn)基因個體鑒定 接受胚胎移植的假孕鼠產(chǎn)下的幼鼠是否含有外源基因？ （1）分子鑒定，判定其基因組內(nèi)是否整合了外源基因 （2）目的蛋白表達與否和表達水平測定 （3）產(chǎn)物的分離純化及生物活性檢測 胚胎干細胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠 5. 轉(zhuǎn)基因動物的鑒定方法有哪些？ （1）標記篩選法利用正負篩選標記 （2）分子鑒定法：PCR擴增、斑點雜交、Southern雜交、熒光原位雜交 （3）

48、表達水平檢測：報告基因檢測、Northern雜交、RT-PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western雜交、目的蛋白的生物活性檢測 6.報告基因 報告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細胞（器官或組織），是否啟動表達的一類特殊用途的基因。 7. 什么是定向打靶技術(shù)和定向打靶載體？如何確保外源基因的定向整合？ 基因打靶是通過外源基因與靶細胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點整合到靶細胞特定位置上，而使某一個特定位點上的基因發(fā)生定點突變的技術(shù)。 定向打靶載體：將正向選擇標記（如neor）基因置于發(fā)生同源交換的序列中間，同源臂外側(cè)為真核細胞的負選擇

49、標記（如TK基因）以及在原核細胞中進行復(fù)制和篩選的載體。 確保整合：通過對新霉素抗性篩選獲得整合外源基因的細胞，通過添加丙氧鳥苷（GANC）到細胞，剔除隨機整合的細胞，獲得定點整合的細胞克隆。 8.如何獲得人生長因子？ 尋找人生長因子含量豐富的細胞，從中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR獲取目的基因。 第十五章 1. 舉例說明酵母基因工程相對于大腸桿菌基因工程的優(yōu)勢與不足。 優(yōu)點 ① 是真核生物，大多具有較高的安全性 ② 繁殖速度快，能大規(guī)模生產(chǎn)，具有降低基因工程產(chǎn)品成本的潛力 ③ 將原核生物中已知的分子和基因操作技術(shù)與真核生物中復(fù)雜的轉(zhuǎn)譯后修飾能力相結(jié)合，能方便地用于

50、外源基因的操作 ④ 采用高表達啟動子，可高效表達目的基因，而且可誘導(dǎo)調(diào)控 ⑤ 提供了翻譯后加工和分泌的環(huán)境，使得產(chǎn)物與天然蛋白一樣或類似 ⑥ 酵母菌可將表達的外源蛋白與末端前導(dǎo)肽融合，指導(dǎo)新生肽分泌，同時在分泌過程中可對表達的蛋白進行糖基化修飾 ⑦ 不會形成不溶性的包涵體，易于分離提純 ⑧ 移去起始甲硫氨酸，避免了在作為藥物使用中引起免疫反應(yīng)的問題 ⑨ 酵母菌（主要是釀酒酵母）已完成全基因組測序，它具有比大腸桿菌更完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力 ⑩ 酵母可進行蛋白的N-乙?；?、C-甲基化，對定向到膜的胞內(nèi)表達蛋白具有重要作用。 不足 (1)較難進行高密

51、度發(fā)酵：乙醇的產(chǎn)生和影響 (2)蛋白質(zhì)的分泌能力較差 (3)過度糖基化修飾，平均50-150個甘露糖殘基 2. 作為一個酵母表達載體，包括那些基本元件？ ①啟動子：最常用的啟動子是基因AOX1的啟動子 ② 選擇標記：常用HIS4，以及ARG4、TRP1或URA3作選擇標記的載體。 ③ 信號肽序列 3. 酵母雙雜交的基本原理？ （1）來自酵母轉(zhuǎn)錄激活因子（transcriptionalactivator）GAL4是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，有兩個功能域: 一是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain, BD）靠近羧基端,含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可與DNA序列中半乳糖苷酶的上

52、游激活序列（upstream activating sequence, UAS）結(jié)合； 二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain, AD，可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFII相互作用，提高RNA聚合酶的活性。這兩個結(jié)構(gòu)域的功能是獨立的。 （2）酵母雙雜交系統(tǒng)利用融合蛋白的策略，將要篩選的“探針”蛋白X與BD融合為BD-X（通常稱為誘餌， bait） （3）將所要篩選的對象Y與AD構(gòu)建成融合蛋白的AD-YcDNA文庫（即將目的cDNA與AD基因構(gòu)建融合基因文庫），通常稱AD-Y為獵物（prey） （4）將它們導(dǎo)入酵母細胞中共表達，如果X與Y相互作用，則會導(dǎo)致BD和AD在空間上接近形成一個有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報告基因的表達。 4. 如何提高基因在染色體上的拷貝數(shù)來提高異源基因的表達量？ ① 不同轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)致產(chǎn)生天然高拷貝轉(zhuǎn)化子； ② 體外在載體上多次插入目的基因片段； ③ 將載體中目的基因兩端連上來自宿主rDNA或其他非必須高重復(fù)的基因片段，通過同源重組而達到高拷貝整合； ④ 利用基因的功能篩選高拷貝整合。