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1、第四章：蛋白質的結構與功能第四章：蛋白質的結構與功能第一節(jié)：蛋白質第一節(jié)：蛋白質一一. 什么是蛋白質什么是蛋白質? 蛋白質蛋白質(protein)是由許多氨基酸是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵通過肽鍵(peptide bond)相連相連形成的高分子含氮化合物。形成的高分子含氮化合物。What are proteins? 分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人含量高：蛋白質是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的體干重的45，某些組織含量更高，例如脾

2、、肺，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達及橫紋肌等高達80。催化作用催化作用高效專一地催化機體內(nèi)幾乎所有高效專一地催化機體內(nèi)幾乎所有的反應的反應酶酶運輸作用運輸作用專一運輸各種小分子和離子專一運輸各種小分子和離子如血紅蛋白如血紅蛋白調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)機體代謝活動調(diào)節(jié)機體代謝活動如胰島素、鈣調(diào)如胰島素、鈣調(diào)蛋白、阻遏蛋白蛋白、阻遏蛋白運動作用運動作用負責機體的運動負責機體的運動如肌動蛋白、肌如肌動蛋白、肌球蛋白球蛋白防御作用防御作用防御異體侵入機體防御異體侵入機體如免疫球蛋白、如免疫球蛋白、病毒外殼蛋白病毒外殼蛋白營養(yǎng)作用營養(yǎng)作用作為氨基酸的貯庫，用于生長發(fā)育所需作為氨基酸的貯庫，用于

3、生長發(fā)育所需或某些物質與蛋白質結合而被貯存或某些物質與蛋白質結合而被貯存如卵清蛋白、酪如卵清蛋白、酪蛋白、麥醇溶蛋蛋白、麥醇溶蛋白、鐵蛋白白、鐵蛋白結構蛋白結構蛋白 作為構建機體某部分的材料作為構建機體某部分的材料如如a-角蛋白、膠角蛋白、膠原蛋白原蛋白二. 蛋白質在機體中的重要作用What do proteins do? 三. 蛋白質的化學組成C、 H、 O、 N ，大多含有大多含有 S有的還含有有的還含有P、Fe、I、Cu、Mo、Zn1. 元素組成元素組成各元素的百分比對于大多數(shù)蛋白質都較相似，各元素的百分比對于大多數(shù)蛋白質都較相似，其中其中N約占約占16% 。因此可通過測定生物樣品中的含

4、氮量計算出樣品中蛋白質的含量，1克氮就相當于6.25克蛋白質，（凱氏定氮法）。凱氏定氮法）。 2. 蛋白質的基本結構單元蛋白質的基本結構單元v 蛋白質的基本結構單元是蛋白質的基本結構單元是氨基酸氨基酸 amino acidv 多個氨基酸首尾連結形成長而不分支的多聚物多個氨基酸首尾連結形成長而不分支的多聚物多肽鏈多肽鏈v 多肽鏈再折疊卷曲，形成多肽鏈再折疊卷曲，形成蛋白質蛋白質第二節(jié)：氨基酸第二節(jié)：氨基酸H1. 由R基團的性質 2. 由aa的營養(yǎng)需求 幾種特殊氨基酸幾種特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸proline（亞氨基酸）（亞氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+C

5、H2CH2Specific amino acidsSpecific amino acids-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫鍵二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3(Cysteine) (Cysteine) 三三. . 稀有稀有氨基酸氨基酸1. 稀有的蛋白質氨基酸 2. 非蛋白質氨基酸氨基酸同時含有氨基和羧基：氨基酸同時含有氨基和羧基：氨基

6、具有氨基具有堿性堿性，羧基具有羧基具有酸性酸性H|RCC|NH3+OOH+-H+H-H|RCC|NH3+OO-H|RCC|NH2OO+-H+H強堿溶液強酸溶液兩性離子四四. 氨基酸的理化性質氨基酸的理化性質 1. 兩性性質甘氨酸的解離曲線甘氨酸的解離曲線滴定曲線滴定曲線H NCH COO22_H N CH COO32+_H N CH COO32+_H NCH COO22_H N CH COOH32+H N CH COO32+_H N CH COOH32+ pK =2.341 pI=5.97 pK =9.602Hcl的摩爾數(shù)NaOH的摩爾數(shù)6-12-1-3-9-000.50.51.0 pH兩性性

7、質和等電點 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點，值稱為該氨基酸的等電點，用用 pI 表示表示(isoelectric point, pI)。pI 是氨基酸的特征常數(shù)是氨基酸的特征常數(shù)等電點 等電點的計算等電點的計算例例 Gly 的的pI 計算計算H+H +NH2 CH2 COOGly NH3 CH2 COO Gly NH3 CH2 COOHGly H+H +K1K2K1 、K2分別代表分別代表COOH和和NH3的

8、表觀解的表觀解離常數(shù)?？梢詮碾x常數(shù)?？梢詮牡味ㄇ€中求得。滴定曲線中求得。等電點的計算等電點的計算例例 Lys 的的pI 計算計算溶液 pH 值增大COOHCHNH3(CH2) 4NH3Lys COOCHNH2(CH2) 4NH2Lys COOCHNH3(CH2) 4NH3Lys H+H +Lys COOCHNH2(CH2) 4NH3H+H +H+H +K1K2K3例例 Glu 的解離的解離等電點的計算等電點的計算結論除除Gly之外之外，其余蛋白質氨基酸都有手性碳，其余蛋白質氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性。原子，都具有旋光性。旋光性質旋光性質2. 光學性質Trp、Tyr、Phe 含芳香環(huán)共

9、軛雙鍵系統(tǒng)，最大吸含芳香環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，最大吸收峰分別在收峰分別在 279nm、278nm、259nm。紫外吸收紫外吸收2. 光學性質茚三酮反應茚三酮反應 還原性茚三酮還原性茚三酮OOOHH NH3CO2 RCHO水合茚三酮水合茚三酮RCHCOOHNH2OOO 2NH3OOOHH OOOONH4N O 3H2O藍紫色化合物藍紫色化合物OO3. 重要的化學性質茚三酮反應茚三酮反應 Sanger反應反應O2NNO2FH2NCHCOOHR O2NNO2 HNCHCOOHR HFEdman反應反應NCSNCNHRCHCOSH+ 、硝基甲烷硝基甲烷COOHH2NCHRHNCNHRCHCOOHSEdman

10、反應反應Edman反應反應4、氨基酸分析 分配層析法：分配層析法： 分配系數(shù) Kd=CACBCA：一種物質在A相（流動相）中的濃度 CB：一種物質在B相（固定相）中的濃度 原理：主要根據(jù)被分析的樣品（如aa混合物）在兩種互不相溶的兩相中分配系數(shù)的不同而達到分離的目的， 紙層析 單向紙層析圖Rf值 洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱離子交換離子交換層析法層析法1.平衡階段平衡階段:離子交換劑與反離子結合離子交換劑與反離子結合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸脫，先洗下弱吸附

11、物質，后洗下強吸附物質附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用滌，既可重復使用第三節(jié)：肽（第三節(jié)：肽（peptidepeptide） 一一. . 肽的定義肽的定義 一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基脫去脫去一分子水而形成酰胺鍵，這個鍵稱為一分子水而形成酰胺鍵，這個鍵稱為肽鍵肽鍵（peptide peptide bondbond），），產(chǎn)生的化合物叫做產(chǎn)生的化合物叫做肽肽（peptidepeptide）。）。 二個氨基酸形成的肽稱作二肽二個氨基酸形成的肽稱作二肽, ,三個氨基酸形成三個氨基酸形成的肽稱作三肽；

12、的肽稱作三肽； 余類推。余類推。寡肽寡肽（oligopeptideoligopeptide）：）：aa 10 aa 10 aa 10 個個肽平面肽平面Peptide bond plane 二二. .肽的結構肽的結構 無分枝無分枝的長鏈的長鏈 由由“N-C-CN-C-C”單元的周期性連接，構成多肽鏈的單元的周期性連接，構成多肽鏈的主鏈主鏈；氨基酸殘基的氨基酸殘基的R R基團連接在主鏈的基團連接在主鏈的CaCa上，形成多肽鏈上，形成多肽鏈的的側鏈側鏈。具有方向性。兩個末端分別為具有方向性。兩個末端分別為N N端端( (氨基端氨基端) )和和C C端端( (羧羧基端基端) )。 肽鏈中的氨基酸分子因

13、為脫水縮合而基團不全，被稱為肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基氨基酸殘基(residue)。 1、中文表示法： 從肽鏈的從肽鏈的N N端開始，對氨基酸殘基逐一命名，端開始，對氨基酸殘基逐一命名，殘基稱氨酰殘基稱氨酰 三三. . 肽的表示法肽的表示法2、 三字母表示法： aa1 - aa2 - aa3 - aa4 - aa1 . aa2 . aa3 . aa4 . 3、 單字母表示法： ABCD 四四. . 多肽的理化性質多肽的理化性質 其等電點是在所有可解離的基團的凈電荷為其等電點是在所有可解離的基團的凈電荷為0 0時的狀態(tài)。時的狀態(tài)。 肽鏈的一端含有一個游離的肽鏈的一

14、端含有一個游離的 - -氨基，另一端含氨基，另一端含有一個游離的有一個游離的 - -羧基，加上部分氨基酸可解離的羧基，加上部分氨基酸可解離的R R基基團，因而與氨基酸一樣具有團，因而與氨基酸一樣具有兩性解質兩性解質的性質。的性質。（1）雙縮脲反應 肽鍵的紫外吸收：肽鍵的紫外吸收：210230nm 雙縮脲 堿性CuSO4溶液 紫色肽的化學性質與氨基酸相似，但肽有與氨基酸不同的特殊反應：雙縮脲反應雙縮脲反應 五五. . 重要肽重要肽1 1、谷胱甘肽、谷胱甘肽還原性谷胱甘肽（還原性谷胱甘肽（reduced glutathionereduced glutathione）是存在于動植物細是存在于動植物細

15、胞中的一種非常重要的三肽。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨胞中的一種非常重要的三肽。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成。酸組成。CONHCHCONHCHCOOH2|CH2|SH|CHNH2|COOH|CH2|CH2 GluCysGly|S|S|GluCysGly氧化型谷胱甘肽（）GSSG還原型谷胱甘肽（）GSH谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 2 2多肽抗菌素多肽抗菌素 3多肽激素 4神經(jīng)肽甲硫氨酸腦啡肽 TyrGlyGlyphe- Met 亮氨酸腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能：鎮(zhèn)痛 如腦啡肽 (enkephalin) 一、填空：一、填空：1、在組成蛋白質的二十種氨基酸中， 是亞氨基酸，

16、當它在a-螺旋行進中出現(xiàn)時，可使螺旋 。2、Lys的a-COOH、a-NH3 的pK值分別為2.18和8.95，該氨基酸的pI值為9.74，則R基團的pK值為 ，它是由 基團的解離引起的。3、Glu的pK1(a-COOH)=2.19、pK2(R基團)=4.25、pK3(a-NH3 )=9.67，該氨基酸的pI值為 。二、選擇題二、選擇題(注意：有些題不止一個正確答案注意：有些題不止一個正確答案)：1、下列什么氨基酸溶液不使偏振光發(fā)生旋轉(A)Ala (B)Gly (C)Leu (D)Ser (E)Val2、下列AA中，蛋白質內(nèi)所沒有的是(A)高半胱氨酸 (B)半胱氨酸(C)鳥氨酸 (D)胍氨酸

17、3、在下列肽鏈主干原子排列中，哪個符合肽鍵的結構(A)CNNC (B)CCCN (C)NCCC(D)CCNC (E)COCN4、Cys的pK1(-COOH)為1.96，pK2(-NH3+)為8.18，pK3(R基團)為10.28，在pH為6.12的緩沖液中，該氨基酸所帶電荷為(A) 正電荷 (B) 負電荷 (C) 無電荷 (D) 等電荷5、下列氨基酸中，在波長280 nm處紫外吸收值最高的氨基酸是(A) Lys (B) Cys (C) Thr (D) Trp重要的化合物和化學反應：DNFB， Sanger 反應PITC， Edman 反應 第四節(jié)：蛋白質的分子結構第四節(jié)：蛋白質的分子結構一級結

18、構 初級結構（共價結構）二級結構 高級結構（空間結構）三級結構四級結構 在二級結構和三級結構之間還有另一些層次，如超二級結構和結構域。一一. . 蛋白質的結構蛋白質的結構 蛋白質的（primary structure）是指蛋白質肽鏈中氨基酸的排列順序。而蛋白質的化學結構包括肽鏈數(shù)目、端基組成、氨基酸序列和二硫鍵的位置，又稱共價結構。蛋白質的一級結構是最基本的結構，它決定著蛋白質高級結構。 以胰島素為例，胰島素是動物胰臟中胰島細胞分泌的一種分子量較小的激素蛋白，它的主要功能是降低體內(nèi)血糖含量。臨床上用來治療糖尿病。一. 蛋白質的一級結構 最先由Sanger于1953年完成測定胰島素一級結構. 蛋

19、白質的二級結構指多肽鏈本身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構象。 天然蛋白質包括-螺旋、 -折疊、 -轉角、 無規(guī)則卷曲等二級結構。二. 蛋白質的二級結構 （一）二級結構的概念 蛋白質分子的多肽鏈按一定方式折疊、盤繞或組裝成特有的空間結構，亦稱高級結構。蛋白質的高級結構即蛋白質的構象問題。 構型（configuration）是指不對稱碳原子上相連的各原子或取代基團的空間排布（D-構型、L-構型）。構型的改變伴隨著共價鍵的斷裂和重新形成。構型和構象（一）二級結構的概念 構型和構象 X-射線衍射技術研究表明，肽鍵C-N鍵介于單鍵和雙鍵之間，具有部分雙鍵性質，不能自由旋轉，其中絕大多數(shù)都形成剛性

20、的酰胺平面結構。蛋白質的構象（二）酰胺平面Peptide bond plane 因此，從理論上講，蛋白質的構象（二）酰胺平面原因：1. -螺旋(-helix) 2. -折疊 (-pleated sheet) 3. -轉角 (-turn) 4. 無規(guī)卷曲 (nonregular coil)（三）二級結構單元的種類1）肽鏈中的酰胺平面繞C相繼旋轉一定角度形成-螺旋，并盤繞前進。每隔3.6個氨基酸殘基，螺旋上升一圈；每圈間距0.54nm，即每個氨基酸殘基沿螺旋中心軸上升0.15nm，旋轉100。-螺旋結構的主要特點（P51）：1.-螺旋(-helix)2）螺旋體中所有氨基酸殘基側鏈都伸向外側； 肽鏈

21、上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成，鏈中的全部C=O和N-H幾乎都平行于螺旋軸,氫鍵幾乎平行于中心軸; -螺旋結構的主要特點：1.-螺旋(-helix)3）絕大多數(shù)天然蛋白質都是右手螺旋。每個氨基酸殘基的N-H都與前面第四個殘基C=O形成氫鍵。 -螺旋結構的主要特點：1.-螺旋(-helix)l R為Gly時，由于Ca上有2個氫，使Ca-C、Ca-N的轉動的自由度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩(wěn)定性大大降低。l-螺旋遇到Pro就會被中斷而拐彎，因為脯氨酸是亞氨基酸。 l帶相同電荷的氨基酸殘基連續(xù)出現(xiàn)在肽鏈上時，螺旋的穩(wěn)定性降低。側鏈在-螺旋結構中的作用：2、-折疊(-pleated sheet) -

22、折疊是由兩條或多條伸展的多肽鏈靠氫鍵聯(lián)結而成的鋸齒狀片狀結構。 側鏈基團與C間的鍵幾乎垂直于折疊平面，R基團交替地分布于片層平面兩側。 -折疊分平行式和反平行式，后者更為穩(wěn)定。N端在同一端。氨基酸之間沿軸相距0.325nmN端不在同一端。氨基酸之間沿軸相距0.35nm2、-折疊(-pleated sheet) 維持-折疊結構穩(wěn)定性的力 氫鍵由一條鏈上的羰基和另一條鏈上的氨基之間形成，即氫鍵是在鏈與鏈之間形成的。2、 -折疊( -pleated sheet) 2、 -折疊( -pleated sheet) 3、 -轉角（ -turn） 也稱-回折，存在于球狀蛋白中。其特點是肽鏈回折180，使得氨

23、基酸殘基的C=O和與第四個殘基的N-H形成氫鍵。 -轉角都在蛋白質分子的表面。3、 -轉角（ -turn） 4、無規(guī)則卷曲（non-regular coil） 又稱自由卷曲，是指沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結構。酶的功能部位常常處于這種構象區(qū)域。 無規(guī)卷曲常出現(xiàn)在a-螺旋與a-螺旋、a-螺旋與-折疊、 -折疊與-折疊之間。它是形成蛋白質三級結構所必需的。1. 定義指蛋白質中相鄰的二級結構單位(即單個-螺旋或-轉角)組合在一起，形成有規(guī)則的在空間上能辯認的二級結構組合體。三.蛋白質的超二級結構2. 類型2. 類型3. 結構域 (domain) 指多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構的局部折

24、疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體，稱為結構域（domain）或功能域。3. 結構域 (domain)四.蛋白質的三級結構 三級結構指的是多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構象和側鏈構象相互作用，進一步盤曲折疊形成球狀分子結構。（一）三級結構的概念（二）球狀蛋白的三級的結構特怔 具有三級結構的蛋白質分子含有多種二級結構單元。如具有三級結構的球狀蛋白溶菌酶中含有螺旋、-折疊、-轉角和無規(guī)卷曲四種二級結構 （二）球狀蛋白的三級的結構特怔大多數(shù)非極性側鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核；而極性側鏈在分子表面，形成親水面。分子表面往往有一個內(nèi)陷的空隙，它常常是蛋白質的活性中心 蛋白質的三級結構具

25、有明顯的折疊層次。（三）維持三級結構的作用力二硫鍵 共價鍵 疏水作用非共價鍵（次級鍵）氫鍵 離子鍵范德華力（三）肌紅蛋白肌紅蛋白由條多肽鏈和一個血紅素（heme）輔基構成，分子量為16700，含153個氨基酸殘基。 五.蛋白質的四級結構(一) 四級結構的概念 四級結構：由兩條或兩條以上具有三級結構的多肽鏈聚合而成、有特定三維結構的蛋白質構象。每條多肽鏈又稱為亞基。 血紅蛋白由四條多肽鏈形成，是一種寡聚蛋白質。這四條鏈主要通過非共價鍵相互作用締合在一起。血紅蛋白分子上有四個氧的結合部位，因為每條鏈上含有一個血紅素輔基。 例如，血紅蛋白的四級結構(一) 四級結構的概念(一) 四級結構的概念(二)

26、維持四級結構的作用力v 疏水作用v 氫鍵v 離子鍵v 范德華力 第五節(jié)：蛋白質的結構與功第五節(jié)：蛋白質的結構與功能能（一）一級結構與功能的關系（一）一級結構與功能的關系 以細胞色素以細胞色素C C為例為例：細胞色素細胞色素C C廣泛存在于真核廣泛存在于真核生物細胞的線粒體中，是一種含有血紅素輔基的單生物細胞的線粒體中，是一種含有血紅素輔基的單鏈蛋白質。在生物氧化時，細胞色素鏈蛋白質。在生物氧化時，細胞色素C C在呼吸鏈的電在呼吸鏈的電子傳遞系統(tǒng)中起傳遞電子的作用，使血紅素上鐵原子傳遞系統(tǒng)中起傳遞電子的作用，使血紅素上鐵原子的價數(shù)發(fā)生變化。子的價數(shù)發(fā)生變化。 1.同功能蛋白的種屬特異性與一級結構

27、的關系三、蛋白質結構與功能關系三、蛋白質結構與功能關系 脊椎動物的細胞色素脊椎動物的細胞色素C C由由l04l04個氨基酸殘基組成個氨基酸殘基組成，分子量約，分子量約13,00013,000左右；昆蟲有左右；昆蟲有108108個氨基酸殘基組個氨基酸殘基組成；植物則有成；植物則有112112個氨基酸殘基組成，大都沿個氨基酸殘基組成，大都沿N N端延端延伸。對不同生物的細胞色素伸。對不同生物的細胞色素C C的一級結構分析表明，的一級結構分析表明，大約有大約有2828個氨基酸殘基是各種生物共有的，表明這個氨基酸殘基是各種生物共有的，表明這些氨基酸殘基是規(guī)定細胞色素些氨基酸殘基是規(guī)定細胞色素C C的生

28、物功能所必需的的生物功能所必需的。 表4-5 不同有機體中細胞色素C中的氨基酸順序與人的差異生物名稱生物名稱 氨基酸差異數(shù)氨基酸差異數(shù) 生物名稱生物名稱 氨基酸差異數(shù)氨基酸差異數(shù)黑猩猩黑猩猩0雞、火雞雞、火雞13恒河猴恒河猴1響尾蛇響尾蛇14兔兔9烏龜烏龜15袋鼠袋鼠10金槍魚金槍魚21鯨鯨10狗魚狗魚23牛羊豬牛羊豬10蠶蛾蠶蛾31狗狗11小麥小麥43騾騾11面包酵母面包酵母45馬馬12紅色面包霉紅色面包霉48 三、蛋白質結構與功能關系三、蛋白質結構與功能關系（一）一級結構與功能的關系（一）一級結構與功能的關系2.一級結構變異與分子病 所謂分子病是指由于遺傳基因突變導致蛋白分子中所謂分子病是

29、指由于遺傳基因突變導致蛋白分子中某些氨基酸殘基被更換所造成的一種遺傳病。鐮刀狀細某些氨基酸殘基被更換所造成的一種遺傳病。鐮刀狀細胞貧血?。ò氀。╯ickle-cell anemia）是最早被認識的一種分是最早被認識的一種分子病，這種疾病在非洲的某些地區(qū)十分流行。病人的紅子病，這種疾病在非洲的某些地區(qū)十分流行。病人的紅細胞在氧氣不足的情況下變形而呈鐮刀狀，故由此得名細胞在氧氣不足的情況下變形而呈鐮刀狀，故由此得名 三、蛋白質結構與功能關系三、蛋白質結構與功能關系（一）一級結構與功能的關系（一）一級結構與功能的關系2.一級結構變異與分子病 通過對血紅蛋白分子的一級結構研究表明，病人的通過對血紅

30、蛋白分子的一級結構研究表明，病人的血紅蛋白（血紅蛋白（HbS）與正常人的血紅蛋白（與正常人的血紅蛋白（HbA）相比，相比，在在574個氨基酸殘基中只有個氨基酸殘基中只有2個氨基酸殘基的差異。個氨基酸殘基的差異。HbA和和 HbS的的 -鏈是完全相同的，所不同只是鏈是完全相同的，所不同只是 -鏈上從鏈上從N末末端開始的第端開始的第6位的氨基酸殘基，在正常的位的氨基酸殘基，在正常的HbA分子中是分子中是谷氨酸，而患者的谷氨酸，而患者的HbS分子中為纈氨酸所代替，分子中為纈氨酸所代替， 2.一級結構變異與分子病 鐮刀狀細胞貧血病：鐮刀狀細胞貧血?。篐b-AHb-A（正常人）：正常人）：Val-His

31、-Leu-Thr-Pro-Val-His-Leu-Thr-Pro-GluGlu-Glu-Lys-Glu-LysHb-SHb-S（患者）：患者）： Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-His-Leu-Thr-Pro-ValVal-Glu-Lys-Glu-Lys -鏈鏈 1 2 3 4 5 6 7 8 2.一級結構變異與分子病 原因是什么？ Glu 和和Val 分子的側鏈在性質上有很大的不同。分子的側鏈在性質上有很大的不同。Glu 側側鏈帶負電荷，而鏈帶負電荷，而Val側鏈是一個非極性基團，所以使得側鏈是一個非極性基團，所以使得HbS分子表面的負電荷減少，這種變化使患者的血紅蛋白分子表

32、面的負電荷減少，這種變化使患者的血紅蛋白容易發(fā)生聚集并形成桿狀多聚體，這就是導致紅細胞變形容易發(fā)生聚集并形成桿狀多聚體，這就是導致紅細胞變形的原因。的原因。 在體內(nèi)許多具有一定功能的蛋白質如酶蛋白、在體內(nèi)許多具有一定功能的蛋白質如酶蛋白、激素類蛋白等常以無活性的前體形式產(chǎn)生和貯存。激素類蛋白等常以無活性的前體形式產(chǎn)生和貯存。在一定情況下，這些前體經(jīng)特定蛋白酶水解，切除在一定情況下，這些前體經(jīng)特定蛋白酶水解，切除部分肽段后，才轉變成有活性的蛋白質。這一過程部分肽段后，才轉變成有活性的蛋白質。這一過程叫做叫做蛋白質前體的激活3.一級結構與蛋白質前體的激活 例如：例如： 有功能的胰島素含有有功能的胰

33、島素含有51個氨基酸殘基，個氨基酸殘基，由由A、B兩條鏈組成。但在胰島兩條鏈組成。但在胰島 細胞最初合成的細胞最初合成的是一個比胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱前是一個比胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱前胰島素原，它是胰島素原的前體，而胰島素原是胰島素原，它是胰島素原的前體，而胰島素原是有活性的胰島素的前體。前胰島素原比胰島素原有活性的胰島素的前體。前胰島素原比胰島素原在在N末端上多一段肽鏈，稱信號肽（末端上多一段肽鏈，稱信號肽（signal peptide），），含有含有20個左右氨基酸殘基，其中很多是疏水個左右氨基酸殘基，其中很多是疏水側鏈殘基。側鏈殘基。 3.一級結構與蛋白質前體的激活（

34、一）一級結構與功能的關系（一）一級結構與功能的關系 許多蛋白質，如酶蛋白、激素蛋白等，它們在體許多蛋白質，如酶蛋白、激素蛋白等，它們在體內(nèi)常以無活性的前體存在，內(nèi)常以無活性的前體存在，在一定情況下經(jīng)體內(nèi)的蛋在一定情況下經(jīng)體內(nèi)的蛋白酶水解，切去部分肽段后，白酶水解，切去部分肽段后，才變成有活性的蛋白質才變成有活性的蛋白質。 3.一級結構與蛋白質前體的激活 前體胰島素（前體胰島素（84 84 aaaa） A A鏈（鏈（2121aaaa） B B鏈（鏈（3030aaaa） C C鏈（鏈（3333aaaa） 活性胰島素活性胰島素（二）空間結構與功能的關系（二）空間結構與功能的關系 牛胰核糖核酸酶牛胰核

35、糖核酸酶A A（RNaseRNase）是由是由124124個氨個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質，含有基酸殘基組成的單鏈蛋白質，含有4 4個二硫鍵，個二硫鍵，并通過其它次級鍵使多肽鏈得以折疊成一個具并通過其它次級鍵使多肽鏈得以折疊成一個具有三維構象的、有催化能力的活性蛋白質。三有三維構象的、有催化能力的活性蛋白質。三維結構的形成對維持酶的活力是必不可少的。維結構的形成對維持酶的活力是必不可少的。 例一例一（二）空間結構與功能的關系（二）空間結構與功能的關系 當天然的當天然的RNase RNase 在在8 8molLmolL-1-1尿素存在下用尿素存在下用 - -巰基乙?guī)€基乙醇處理后，分子內(nèi)四個二硫鍵

36、即被斷裂，整個肽鏈呈醇處理后，分子內(nèi)四個二硫鍵即被斷裂，整個肽鏈呈伸展的無規(guī)則的線形狀態(tài)，同時酶活性完全喪失。但伸展的無規(guī)則的線形狀態(tài)，同時酶活性完全喪失。但是當用透析方法將尿素和巰基乙醇除去后，是當用透析方法將尿素和巰基乙醇除去后，RNaseRNase活性活性又可完全恢復。研究表明，復性后的產(chǎn)物與天然又可完全恢復。研究表明，復性后的產(chǎn)物與天然RNaseRNase并無差別。所有正確配對的并無差別。所有正確配對的4 4個二硫鍵都獲得重建。個二硫鍵都獲得重建。 （二）空間結構與功能的關系（二）空間結構與功能的關系 （二）空間結構與功能的關系（二）空間結構與功能的關系血紅蛋白的別構效應血紅蛋白的別構

37、效應 例二例二（二）空間結構與功能的關系（二）空間結構與功能的關系肌紅蛋白與血紅蛋白肌紅蛋白與血紅蛋白：兩者三級結構相似：兩者三級結構相似別構效應別構效應。 PoPo2 2/133Pa/133Pa001.0.0.5.20406080100活動肌肉中活動肌肉中PoPo2 2肺泡中肺泡中PoPo2 2氧飽和度氧飽和度肌紅蛋白血紅蛋白第六節(jié)：蛋白質的重要性質( (一一) )膠體性質膠體性質 蛋白質的分子量蛋白質的分子量1 1萬萬-100-100萬之間，其分子直萬之間，其分子直徑徑1-1001-100nmnm之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質的之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體

38、，這是因為在水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為在蛋白質顆粒表面帶有很多極性基團，如蛋白質顆粒表面帶有很多極性基團，如 NHNH3 3、 COOCOO- -、 OHOH- -、 SHSH、 CONHCONH2 2等和水有高度親和性等和水有高度親和性，當?shù)鞍踪|與水相遇時，就很容易在蛋白質顆粒，當?shù)鞍踪|與水相遇時，就很容易在蛋白質顆粒外面形成外面形成層水膜。層水膜。 所以蛋白質具有膠體性質，如布朗運動、光散所以蛋白質具有膠體性質，如布朗運動、光散射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。利射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白質不能透過半透膜的性質，可用羊皮紙、火用蛋白質不能透過半

39、透膜的性質，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來分離純化蛋白質，這個方法稱棉膠、玻璃紙等來分離純化蛋白質，這個方法稱透透析（析（dialysis）。）。 蛋白質能形成較為穩(wěn)定的親水膠體的另一個原因蛋白質能形成較為穩(wěn)定的親水膠體的另一個原因：蛋白質顆粒在非等電點狀態(tài)時帶有相同電荷，使：蛋白質顆粒在非等電點狀態(tài)時帶有相同電荷，使得蛋白質顆粒之間相相互排斥，得蛋白質顆粒之間相相互排斥， ( (一一) )膠體性質膠體性質( (二二) )兩性解離及等電點兩性解離及等電點 蛋白質同氨基酸一樣也是兩性電解質，即能和蛋白質同氨基酸一樣也是兩性電解質，即能和酸作用，也能和堿作用。蛋白質分子中可解離的基酸作用，也能和堿

40、作用。蛋白質分子中可解離的基團除肽鏈末端的團除肽鏈末端的 - -氨基和氨基和 - -羧基外，主要還是多肽羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側鏈基團如鏈中氨基酸殘基上的側鏈基團如 - -氨基、氨基、 - -羧基、羧基、 - -羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pHpH條件下，這些基團能解離為帶電基團從而使蛋白條件下，這些基團能解離為帶電基團從而使蛋白質帶電。質帶電。 蛋白質的等電點（蛋白質的等電點（pIpI）：）：當某蛋白質在一定的當某蛋白質在一定的pHpH的溶液中，所帶的正負電荷相等，它在電場中既不向的溶液中，所帶的正負電荷相等，它在電場中

41、既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的陽極也不向陰極移動，此時溶液的pHpH值叫做該蛋白質值叫做該蛋白質的等電點。的等電點。 蛋白質的帶電性質與溶液的蛋白質的帶電性質與溶液的pHpH有關。利用蛋白質有關。利用蛋白質的兩性解離可以通過電泳分離純化蛋白質。的兩性解離可以通過電泳分離純化蛋白質。( (二二) )兩性解離及等電點兩性解離及等電點 蛋白質受到某些理化因素的影響，其空間結構蛋白質受到某些理化因素的影響，其空間結構發(fā)生改變，蛋白質的理化性質和生物學功能隨之改發(fā)生改變，蛋白質的理化性質和生物學功能隨之改變或喪失，但未導致蛋白質一級結構的改變，這種變或喪失，但未導致蛋白質一級結構的改變，這種現(xiàn)象叫

42、變性作用（現(xiàn)象叫變性作用（denaturationdenaturation）。）。 1.蛋白質變性的概念2.蛋白質變性的因素物理因素物理因素：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；化學因素化學因素：強酸、強堿、脲、鹽酸胍、去垢：強酸、強堿、脲、鹽酸胍、去垢劑、重金屬鹽等；劑、重金屬鹽等； ( (三三) )蛋白質的變性蛋白質的變性3.蛋白質變性后的表現(xiàn)( (三三) )蛋白質的變性蛋白質的變性4.蛋白的復性 蛋白質的變性作用若不過于劇烈，則是一種可蛋白質的變性作用若不過于劇烈，則是一種可逆過程。高級結構松散了的變性蛋白質通常在除去逆過程。高級結構松散了的變性蛋白質通常在除去

43、變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來的構變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來的構象，恢復原有的理化性質和生物活性，這種現(xiàn)象稱象，恢復原有的理化性質和生物活性，這種現(xiàn)象稱為為復性復性( (renaturation)renaturation)。 大多蛋白質變性后，很難復性。大多蛋白質變性后，很難復性。( (三三) )蛋白質的變性蛋白質的變性( (四四) )蛋白質的沉淀蛋白質的沉淀 加入適當試劑使蛋白質分子處于等電點狀態(tài)或失去加入適當試劑使蛋白質分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層，蛋白質的膠體溶液就不穩(wěn)定水化層，蛋白質的膠體溶液就不穩(wěn)定, ,并將產(chǎn)生沉淀。并將產(chǎn)生沉淀。能使蛋白質沉淀的試劑有：能

44、使蛋白質沉淀的試劑有：1. 1. 高濃度中性鹽高濃度中性鹽 （NHNH4 4) )2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl 這種加入鹽使蛋白質沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，這種加入鹽使蛋白質沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質分離制備。用于蛋白質分離制備。2. 2. 有機溶劑有機溶劑 丙酮、乙醇丙酮、乙醇3.3.重金屬鹽重金屬鹽 Hg Hg2+2+、AgAg+ +、PbPb+ + （與蛋白質中帶負電基團形與蛋白質中帶負電基團形成不易溶解的鹽成不易溶解的鹽, ,或改變蛋白質的空間結構或改變蛋白質的空間結構） 4.4.生物堿試劑和某些酸類物質生物堿試劑和某些酸類物質 苦味酸、單

45、寧酸苦味酸、單寧酸 三氯乙酸、磺基水楊酸等三氯乙酸、磺基水楊酸等 （與蛋白質中帶正電荷的基團生成不溶性鹽）（與蛋白質中帶正電荷的基團生成不溶性鹽）5.5.加熱變性沉淀加熱變性沉淀( (四四) )蛋白質的沉淀蛋白質的沉淀( (五五) )蛋白質的顏色反應蛋白質的顏色反應1. 1. 雙縮脲反應雙縮脲反應 雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。雙雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產(chǎn)生紅紫色絡合縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產(chǎn)生紅紫色絡合物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應

46、和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應。通常可用此反應來定性鑒定蛋白質，也可根據(jù)反。通?？捎么朔磻獊矶ㄐ澡b定蛋白質，也可根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色深淺在應產(chǎn)物的顏色深淺在540540nmnm處進行蛋白質的定量測定處進行蛋白質的定量測定。 2. 2. 酚試劑（酚試劑（Folin-酚試劑）反應酚試劑）反應 蛋白質分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸蛋白質分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將中的酚基能將Folin-酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。這一反應常用來定量測定蛋白質含量。這一反應常用來定量測

47、定蛋白質含量?？筛鶕?jù)反可根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色深淺在應產(chǎn)物的顏色深淺在540540nmnm處進行蛋白質的定量處進行蛋白質的定量測定測定. . ( (五五) )蛋白質的顏色反應蛋白質的顏色反應3. 3. 茚三酮反應茚三酮反應 由于蛋白質多肽鏈兩端有游離的由于蛋白質多肽鏈兩端有游離的 -NH2和和 -COOH，所以蛋白質也可以和茚三酮發(fā)生反應。所以蛋白質也可以和茚三酮發(fā)生反應。4. 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭 與蛋白質反應形成藍色透明物質，在與蛋白質反應形成藍色透明物質，在595nm下進行比色。下進行比色。( (五五) )蛋白質的顏色反應蛋白質的顏色反應( (六六) )蛋白質的蛋白質的的分離、純化與鑒定的分

48、離、純化與鑒定1.1.蛋白質分離、純化的過程和一般原則蛋白質分離、純化的過程和一般原則 （1 1）前處理（）前處理（Pretreatment）-細胞破碎，蛋白細胞破碎，蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來。質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來。（2 2）粗分級（）粗分級（Rough fractionation） 當?shù)鞍踪|混當?shù)鞍踪|混合物的提取液獲得后，選用一套適當分離純化方法合物的提取液獲得后，選用一套適當分離純化方法，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。 （3 3）細分級（）細分級（Fine fractionation） 是將樣品進是將樣品進一步

49、提純的過程。樣品經(jīng)粗分級以后，一般體積較一步提純的過程。樣品經(jīng)粗分級以后，一般體積較小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。（4 4）結晶（）結晶（Crystal）由于結晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性由于結晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質，因此蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志蛋白質，因此蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。蛋白質，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。蛋白質純度愈高，溶液愈濃就愈容易結晶。純度愈高，溶液愈濃就愈容易結晶。 2.2.蛋白質分離純化的一般方法蛋白質分離純化的一般方法 （1）根據(jù)蛋白質分子大小不同的分離方法）根據(jù)蛋白質分子大小不同的分離方法

50、a. 透析（透析（dialysis）和超濾和超濾 （ultrafiltration）( (六六) )蛋白質的蛋白質的的分離、純化與鑒定的分離、純化與鑒定b. 密度梯度（區(qū)帶）離心密度梯度（區(qū)帶）離心 c. 凝膠過濾（凝膠過濾（gel filtration） 葡聚糖凝膠過濾（2）根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行分離的方法根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行分離的方法 a. 等電點沉淀（等電點沉淀（isoelectric precipitation）b. 蛋白質的鹽溶和鹽析蛋白質的鹽溶和鹽析 c. 有機溶劑分級分離有機溶劑分級分離 （3）根據(jù)蛋白質電荷不同的分離方法）根據(jù)蛋白質電荷不同的分離方法 a. 電泳電泳-

51、在電場中，帶電顆粒向著與其帶相反電荷的在電場中，帶電顆粒向著與其帶相反電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳（電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳（electrophoresis）。）。n影響遷移率的因素：電位梯度影響遷移率的因素：電位梯度 電流密度電流密度 導電性導電性 環(huán)境環(huán)境pH （分子電荷）分子電荷） 離子強度離子強度 分子的大小、形狀分子的大小、形狀 n根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設計不同的電根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設計不同的電泳方法以達到預期的目的泳方法以達到預期的目的聚丙烯酰胺的結構和特點聚丙烯酰胺的結構和特點 單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺 增速劑：增速劑：TEM

52、EDTEMED（N,N,NN,N,N,N,N- -四甲基乙二胺）、四甲基乙二胺）、3-3-二甲胺丙腈二甲胺丙腈 引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素 特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大小大小n電泳原理：電泳原理：1.1.最主要的特性是蛋白質的帶電行為，產(chǎn)生最主要的特性是蛋白質的帶電行為，產(chǎn)生電荷效應電荷效應2.2.分子篩效應分子篩效應（3）根據(jù)蛋白質電荷不同的分離方法）根據(jù)蛋白質電荷不同的分離方法 b. 離子交換層析（離子交換層析（ion-exchange chromatography） （4）根據(jù)蛋白質配體專

53、一性進行）根據(jù)蛋白質配體專一性進行（affinity chromatography） 3.3.蛋白質相對蛋白質相對分子量的測定方法分子量的測定方法 (1)(1)超速離心分析法，亦稱沉降分析法。超速離心分析法，亦稱沉降分析法。（2 2）凝膠過濾測定蛋白質的分子質量）凝膠過濾測定蛋白質的分子質量 ( (3 3) ) SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）十二烷基硫酸鈉）-PAGE-PAGE測定蛋白質分子測定蛋白質分子量量 ( (4 4) ) 毛細管電泳測定蛋白質的分子質量毛細管電泳測定蛋白質的分子質量 毛細管電泳（毛細管電泳（CECE）則可以在很大程度上克服常則可以在很大程度上克服常規(guī)方法時間長、靈敏度低

54、不利情況。用毛細管電泳規(guī)方法時間長、靈敏度低不利情況。用毛細管電泳測定蛋白質分子量僅需要納克量蛋白質，而且還可測定蛋白質分子量僅需要納克量蛋白質，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機精確定量。以用積分儀或電腦聯(lián)機精確定量。 ( (5 5) )質譜測定蛋白質分子量質譜測定蛋白質分子量質譜測定蛋白質分子量是近年來發(fā)展的一項新技術，其分辨率質譜測定蛋白質分子量是近年來發(fā)展的一項新技術，其分辨率和精確度都較前幾項技術高。尤其近幾年發(fā)展起來的磁質譜可和精確度都較前幾項技術高。尤其近幾年發(fā)展起來的磁質譜可精確測定分子質量精確測定分子質量20002000DaDa以下的多肽；而電噴霧質譜（以下的多肽；而電噴霧質譜（E

55、SIESI）可可以測以測5 5萬萬DaDa的蛋白質，而且只需要皮摩爾（的蛋白質，而且只需要皮摩爾（pmolpmol）量的蛋白質。量的蛋白質。一、填空：一、填空：1、蛋白質在波長為 nm的紫外光中有明顯的吸收峰，這是由 、 和 三種氨基酸殘基所引起的。2、有一混合蛋白樣品，含A、B、C、D四種蛋白質，其pI分別為4.9、5.2、6.6和7.8，若將此樣品液置于pH7.0的緩沖液中電泳，向陰極移動的有 。3、某蛋白質的某一區(qū)段含有15個氨基酸殘基，這些殘基之間均可形成如右圖所示的氫鍵。(1) 該區(qū)段具有 的二級結構，它的長度為 納米。(2) 該區(qū)段的主鏈中可形成 個氫鍵。(3) 已知該區(qū)段被包埋在整個蛋白質分子的內(nèi)部，則這一區(qū)段很可能含有較多的 氨基酸。二、選擇題1、蛋白質變性不包括(A) 肽鏈斷裂 (B) 離子鍵斷裂 (C) 疏水鍵斷裂 (D) 氫鍵斷裂2、蛋白質肽鏈在形成-螺旋時，遇到Pro殘基時，-螺旋就會中斷而拐彎，主要是因為，（A） 沒有多余的氫形成氫鍵 (B) 不能形成所需的角 (C) R基團電荷不合適 (D) 整個-螺旋不穩(wěn)定3、維持蛋白質二級結構的主要作用力是(A) 肽鍵 (B) 離子鍵 (C) 疏水鍵 (D) 氫鍵 (E) 二硫鍵