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1、 課題背景 U尿素的利用 尿索是一種垂要的農(nóng)業(yè)採素不能亶接被農(nóng)作物吸 收.土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用. 2、細曹利用尿素的原f 土壊中的細苜分解尿素是因為它們能合 CO (NH2) 2 NH3 + H20 + co2 3、課題目的 ① 從土壞中分離出能夠分解尿素的細菌 ② 統(tǒng)計毎克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細曹 —?研究思路 （-）?篩選菌株 ㈡.統(tǒng)計曹落數(shù)目 ㈢?設■對 fill ★（一） ?篩選■擁 1、實例： DNA多聚酶鏈式反應是 一種在體外將少?DNA大■ 復制的技術(shù)，此項技術(shù)要求 使用耐高溫（93°C）的DNA 聚

2、合酶? 為熱泉溫度70?80°0,淘汰了絕大多數(shù) 微生物只有"q細菌被篩選出來。 啟示：尋找目的18種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要 求，到相應的環(huán)境中去尋找。 2、實驗室中微生物的篩冼原理: 要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點, 包括營養(yǎng)、生理、生長條件尊; 方法： ⑴人為提供有利于目的茵株生長的條件〈包括營養(yǎng).溫 度、PH等）, ⑵同時抑制或阻止大多數(shù)微生物不能生長 結(jié)果，培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)■上升，再通過平板稀 釋等方法對它進行純化培養(yǎng)分離. KH2P04 1.4g MaH2P04 2.1g Mg$04?7H20 0. 2g 荀萄糖 10. 0g

3、 尿素 I.Og 瓊脂 15. Og 3、土壇中分解尿査的■■的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基; ①從物理性質(zhì)■此 培養(yǎng)基■于娜類？ 固體培養(yǎng)基 ②在此培養(yǎng)基中鼻些 作為碳源.氯源？ 確源；???＞尿H 氯源：尿素 4、培養(yǎng)基選撞分解尿寨的微生皙的原理 培養(yǎng)基的氨源為尿索，只有能合成腮■的激生物才能分解 尿索，以尿索作為氛源.皺乏J8■的微生物由于不能分解尿索. 缺乏氯源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基 就能夠選擇出分解尿素的徽生物. 5、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？ 培養(yǎng)基類型 是否 接種 目的 結(jié)果 /宜2￡日以尿素為 儼驗組唯-氮源 的培養(yǎng)基

4、 是 分離 尿素 細菌 只生長尿 素細菌 牛肉膏 時照組蛋白淼 培養(yǎng)基 是 判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性 生長多種 微生物 1、顯徽鏡亶接計數(shù)： 利用血球計數(shù)板，在顯徹檢下計算 一定容積里樣品中微生物的數(shù)■? 缺點 不能區(qū)分死菌與活菌 不適于對運動細菌的計數(shù) 需要相對高的細苗濃度 個體小的細菌在顯微鏡下難以 觀察； 觀察到的紅細胞平均數(shù)：觀察到的細 i ni proved 小方格 ??榔氣? 菌平均數(shù)=紅細胞含鼠：細菌含量 2.間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法) ⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體 培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞 繁殖而成的，即一個菌

5、落代表原先的一個單 細胞O ⑵常命方法：稀釋涂布平板法。 每克樣品中的菌落數(shù) 其中，C代裏某一稀釋度下平板上生長的平均 菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積 (ml), M代表稀釋倍數(shù)? 注意事項 ① 為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30- -300的平板上進行計數(shù)。 ② 為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三 個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出 菌落平均數(shù)。 ③ 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 ■ fl* 想一想，如何從平板上的菌 落數(shù)推測出每克樣品中的菌落 數(shù)？ 答：統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的 落數(shù), 最好能統(tǒng)計3個平板，計 算出平板菌落數(shù)

6、的平均值，然后按 課本旁欄的公式進行計算。 統(tǒng)計菌落數(shù)n ~統(tǒng)計菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當樣品的稀釋度足夠高 時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的 一個活菌。因此，恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的 關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準確，通常將幾個稀釋度下的菌液都 涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30?300的平板進 行計數(shù)。教材的實例是為了說明設置重復組的重要性。第 一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結(jié)果 不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂 布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相 差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能 簡單地將3個

7、平板的計數(shù)值用來求平均值。這個實例啟示 了學生，在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為 重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結(jié) 果時，一定要考慮所設置的重復組的結(jié)果是否一致，若結(jié) 果不一致，意味著操作有誤，需要重新丈驗。 ★㈢?設■對照; 設■對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實 驗結(jié)果的影舸，提高實驗結(jié)果的可信度。 實例：在做分解床素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的 實驗時，A同學從對應的10。倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選岀 大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選 擇出大約50個菌落。分析其原因。 原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤（或者 是混入了其

8、他的含氯物質(zhì)） 方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進疔實驗 結(jié)果預測：如果結(jié)果與A同學一致，則證明A無誤：如果 結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制 有問題? 方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進 行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染? 小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服 力，對照的設盍是必不可少的. 巨實驗的具體操作 ㈠?土填取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去衷層土3呦 左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。 ?取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要 滅菌? ㈡.制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基.

9、 （三）?樣品的稀釋: ?應在火焰旁稱取土壞10? ?在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要衽火焰旁進行 ?分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因；不同微生物在土壊中含量不同 目的；保證獲得菌落數(shù)在30?300之間、適于計數(shù)的 平板 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測 定土壞中細菌的總■和測定土壞中能分解尿素的細菌的 數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 原因：土壤中各類微生物的數(shù)畳（單位：株/kg〉是不 同的?例如在干早土壤中的上層樣本中：好氯及兼性 厭氯細菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，專菌 數(shù)約為23?1萬. ㈣?取樣涂布 結(jié)論：為獲得不同類型的微生

10、物，就需要按不同的稀 釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng) 的條件. ?實驗時要對 培養(yǎng)皿作好標 記。注明培養(yǎng) 基類型、培養(yǎng) 時間、稀釋度. 培養(yǎng)物等。 ?如果得到了 2個或2個以上菌落數(shù)目在3 —300的平板, 則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如 果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大.裘明試 驗不箱確，需要賣新實驗? 培養(yǎng)不同微:生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細菌：30-37*0培養(yǎng)1~2d 放線菌：25?28C培養(yǎng)5?7d at菌：25?28*0的溫度下培養(yǎng)3?4d。 在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目. 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，

11、以防止因培養(yǎng) 時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目? ■資 ■ ■ M M 平■■ 左? ■幺 ??? MU ?A 三、換作提示 廠無菌操作 彳做好標記 I規(guī)劃時間 ?結(jié)果分析與評價 （一） 培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩 選出菌落 對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng) 基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于 選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。 （二） 樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了 2個或2個以上菌落數(shù)目在30?300的平板, 則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。 （=）重垣組的結(jié)果是否一致 飛?果

12、學生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應該接 近。如果結(jié)果相差太遠，教師需要引導學生一起分析產(chǎn) 生差異的原因。 五?課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅 指示劑。培養(yǎng)細菌后，如果PH升髙，指示劑 將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。 菌種的進一步鑒定 (1)原因！由于分離分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基上可能生長著 以分解尿索的細菌的代射產(chǎn)物為氮源的其它微生物。 (2) 原理：COO*!%)尹巴0 空 CO24-2NH3；由于NH3的產(chǎn)生，培養(yǎng) 基堿性增強，pH升高，因此可通過檢測pH的變化來判斷該化學反 應是否發(fā)生。 (3) 方法：以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng) 某種

13、細菌，若指示劑變紅，則pH升高，說明該種細菌能分解尿素. 實驗中的注意事項 (1) 設立重復組：統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)時，要至 少涂布3個平板作重復組，增強實驗結(jié)果的說服力與準確性. (2) 對照原則 ① 判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染，需將未接種的培養(yǎng)基同時進 行培養(yǎng)- ② 判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用，需設立牛肉膏蛋白豚培 養(yǎng)基進行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上菌落數(shù)目.進行對比 得出結(jié)論. 丹區(qū)警示 ①牛肉膏哥白庚培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基應各有一個空 白對照，如不涂布菌液，目的是驗迂培養(yǎng)基中是否含雜菌. ②樣品稀釋度將直接形響平板上生長的菌落數(shù). 本課題知識小結(jié): 土壇中

14、分 解屈索的 細苗的分 離與計數(shù) 「PCR技術(shù) ＜實驗女中篩選鍛生物的原理 L址擇塔養(yǎng)基 :稀釋涂布平板法 I顯戲涯直授計數(shù)法 r設置對照的目的 L對照我的根忿 尸篩選曲株 統(tǒng)計苗落數(shù)目 設置對照 \ 實驗設計 撫作探示 結(jié)果分析與評價 U 課題證伸 r 土堆取祥 ＜存品咖釋 L越生糊的壇齊與觀 「無菌供作 彳做好標記 I規(guī)劃時間 實踐訓練 1. 對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（A） A.在液體培養(yǎng)基上進行B.至少接種一種細菌 C.接種一個細菌 D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2. 使用選擇培養(yǎng)基的目的是（C）

15、 A. 培養(yǎng)細菌 B. 培養(yǎng)真 C-使需要的微生物大量繁殖 D?表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3. 能合成腺酸的微生物所需要的碳源和氮源分別是 （D） A. CO?和 ％ C. CO?和尿素 B.葡萄糖和MH? D.葡萄糖和尿素 4 .下列說法不正確的是(B) A.科學家從70-80度熱泉中分離到耐高溫的T&jDNA聚 合酶 B?統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為Ml、M2、 M3. M4、M5,以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C?設暨對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因 素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，

16、土壤中的微生物數(shù)量最大， 種類最多。 5?為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中 加入＜ C) A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青鑼素類藥物 D.髙濃度食鹽 例3. (2005年江蘇〉抗生素作為治療細菌感 染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟價值使抗生素工業(yè) 經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應用具有劃時代的意 義° (l)ffS素發(fā)酵產(chǎn)生青毎素。青寒菌的新陳代謝類型 是異鼻需，氯型青樁素是青霉菌的空代謝產(chǎn)物。 ⑵在生產(chǎn)和科研中，常選用處于 越期的青霉菌作 為菌種或研究材料，因為此時的青霉菌代珊旺盛生理特性 和個體的形態(tài)比較穩(wěn)定。 (3)對青爲菌菌體生長情況的測定詢孫庫

17、轎的發(fā) 酵液，經(jīng)離心分離、反復洗滌后X韓需朦計算 發(fā)酵罐中菌體的總重量。 實驗設計 2. 1實驗設計的內(nèi)容包括實驗方案、材料用具、 妻灌弟81和時間安排等. . . I 2.2根據(jù)圖示填寫以下 |配制上rio「麗錘鱷 實驗流程： |壤溶液|鬥「與㈱西數(shù) 2. 3土壌微生物主要分布在距地表3?Mm的近中性土壤中，約70 %?80%為細菌。 2. 4分離不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是不同微生物在 土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在M~3(W之間、適于 計數(shù)的平板.細菌稀釋度為105. 10?,放線菌稀釋度為12、 104. 105,真菌稀釋度為io2. 103. 1(九 2. 5培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度.細菌一般在3()?379 培養(yǎng)1?2d,放線菌一般在25?289培養(yǎng)5?7d,琴菌一股在25? 2JTC的溫度下培養(yǎng)3? 2. 6在菌落計數(shù)時?每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目.選取菌落數(shù)目穩(wěn) 定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺湖蔚落的數(shù) 目。 2. 7菌落的特征包括形狀、大小、隆起程度、顏色等方面.