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專題十五　生物技術(shù)實(shí)踐 1．某研究小組嘗試制作藍(lán)莓果酒和藍(lán)莓果醋，并探討提取花青素的方法。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)為提高果酒的品質(zhì)，需先獲得純凈的酵母菌菌種。吸取1mL酵母菌樣液，在105稀釋倍數(shù)下統(tǒng)計(jì)各平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)為32，涂布時(shí)所用稀釋液體積為0.1mL，則每mL樣液中的菌株數(shù)＝__3.2107__個(gè)。 (2)釀制藍(lán)莓果酒前不需要對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行嚴(yán)格的消毒以除去雜菌，這是因?yàn)樵赺_缺氧、呈酸性__條件下，絕大多數(shù)微生物因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而受抑制。發(fā)酵時(shí)一般要先通氣，其目的是__酵母菌可在有氧條件下大量繁殖__。果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可在酸性條件下用橙色的__重鉻酸鉀__進(jìn)行檢驗(yàn)，若溶液顏色變成__灰綠色__證明有酒精存在。 (3)釀制成功的藍(lán)莓果酒如果暴露在空氣中酒味會(huì)逐漸消失而出現(xiàn)酸味，尤其是氣溫高的夏天，其原因是__醋酸菌在有氧條件下，產(chǎn)生大量醋酸(合理敘述給分)__。 (4)查閱資料得知，花青素是水溶性色素。在pH小于3.0條件下比較穩(wěn)定，在60℃以下熱穩(wěn)定性較好。溶劑萃取法是最常用提取方法，萃取劑宜選用__乙醇__(乙醇/乙醚)，將萃取相關(guān)過(guò)程的pH控制在__3__左右可有效地保障萃取成功。 [解析]　(1)為提高果酒的品質(zhì)，需先獲得純凈的酵母菌菌種。吸取1 mL酵母菌樣液，在105稀釋倍數(shù)下統(tǒng)計(jì)各平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)為32，涂布時(shí)所用稀釋液體積為0.1 mL，則每mL樣液中的菌株數(shù)＝320.1105＝3.2107個(gè)。(2)釀制藍(lán)莓果酒前不需要對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行嚴(yán)格的消毒以除去雜菌，這是因?yàn)樵谌毖酢⒊仕嵝詶l件下，絕大多數(shù)微生物因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而受抑制。發(fā)酵時(shí)一般要先通氣，其目的是酵母菌可在有氧條件下大量繁殖。果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可在酸性條件下用橙色的重鉻酸鉀進(jìn)行檢驗(yàn)，若溶液顏色變成灰綠色證明有酒精存在。(3)釀制成功的藍(lán)莓果酒如果暴露在空氣中酒味會(huì)逐漸消失而出現(xiàn)酸味，尤其是氣溫高的夏天，其原因是醋酸菌在有氧條件下，產(chǎn)生大量醋酸。(4)花青素是水溶性色素。在pH小于3.0條件下比較穩(wěn)定，在60℃以下熱穩(wěn)定性較好。溶劑萃取法是最常用提取方法，萃取劑宜選用乙醇，將萃取相關(guān)過(guò)程的pH控制在3左右可有效地保障萃取成功。 2．(2018河北省衡水中學(xué)一模)為了分離和純化高效分解石油的細(xì)菌，科研人員利用被石油污染過(guò)的土壤進(jìn)行如圖A所示的實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)配制好的培養(yǎng)基通常使用__高壓蒸汽滅菌__法滅菌。步驟③與步驟②中培養(yǎng)基成分相比，最大的區(qū)別是__步驟③的培養(yǎng)基中石油是唯一碳源__。 (2)同學(xué)甲進(jìn)行步驟④的操作，其中一個(gè)平板經(jīng)培養(yǎng)后的菌落分布如圖B所示。該同學(xué)的接種方法是__稀釋涂布平板法__，出現(xiàn)圖B結(jié)果可能的操作失誤是__涂布不均勻__。 (3)同學(xué)乙也按照同學(xué)甲的接種方法進(jìn)行了步驟④的操作：將1 mL樣品稀釋100倍，在3個(gè)平板上分別接入0.1 mL稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為56、58和57。據(jù)此可得出每升樣品中的活菌數(shù)為_(kāi)_5.7107__個(gè)。 (4)步驟⑤需要振蕩培養(yǎng)，原因是__使石油分布均勻，與細(xì)菌充分接觸，有利于細(xì)菌的繁殖(答案合理即可)__。 (5)步驟⑤后取樣測(cè)定石油含量的目的是__篩選出分解石油能力最強(qiáng)的細(xì)菌__。 [解析]　(1)培養(yǎng)基的滅菌方法常采用高壓蒸汽滅菌法。步驟③的培養(yǎng)基中石油是唯一的碳源，步驟②會(huì)有其他有機(jī)物作為碳源。(2)圖B中的菌落不是呈線形分布，所以采用的接種方法應(yīng)是稀釋涂布平板法。圖B中的菌落分布不均勻，應(yīng)是操作中涂布不均勻引起的。(3)三個(gè)平板中的菌落數(shù)分別是56、57、58，取平均值得57，每升樣品中的活菌數(shù)目＝57101001000＝5.7107(個(gè))。(4)步驟⑤應(yīng)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，其目的是使加入的石油分布均勻，石油與細(xì)菌充分接觸，有利于細(xì)菌的繁殖。(5)步驟⑤后取樣測(cè)定石油的含量，可以得到被細(xì)菌分解的情況，如果含石油越少，則說(shuō)明細(xì)菌分解的石油越多，這樣可以篩選出分解石油能力最強(qiáng)的細(xì)菌。 3．我國(guó)最早的詩(shī)集《詩(shī)經(jīng)》中有“田中有廬，疆場(chǎng)有瓜是剝是菹”的詩(shī)句，其中“廬”和“瓜”是蔬菜，“剝”和“菹”是腌制加工的意思。泡菜是一種歷史悠久、深受群眾喜愛(ài)的傳統(tǒng)美食。某興趣小組的同學(xué)進(jìn)行了制作泡菜的實(shí)踐活動(dòng)。 回答下列問(wèn)題： (1)按清水與鹽質(zhì)量比為4︰1的比例制好鹽水后，需將鹽水煮沸，其作用是__除去鹽水中的氧氣和殺菌__。 (2)為測(cè)定泡菜中亞硝酸鹽含量，首先要配制__亞硝酸鹽__標(biāo)準(zhǔn)顯色液，并與樣品進(jìn)行比較。泡菜制作的第3～5天亞硝酸鹽含量較高不宜食用，原因是__適宜的pH、溫度和一定微生物作用下亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成致癌物質(zhì)亞硝胺__。 (3)若將稀釋105倍的某細(xì)菌菌液，用直接計(jì)數(shù)法和稀釋涂布平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)。 ①直接計(jì)數(shù)法：用吸管吸取0.1 mL該菌液，滴于血球計(jì)數(shù)板上的__蓋玻片__邊緣，待該細(xì)菌全部沉降到計(jì)數(shù)室底部，用顯微鏡直接計(jì)數(shù)。并計(jì)算出每升菌液的細(xì)菌數(shù)目。 ②稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)：在五個(gè)固體培養(yǎng)基上分別接種0.1 mL該細(xì)菌菌液，適宜條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為：20、40、152、154、156，則每升菌液中細(xì)菌數(shù)量為_(kāi)_1.2551011__個(gè)。 ③正常操作情況下，上述兩種計(jì)數(shù)法中，__直接計(jì)數(shù)法__統(tǒng)計(jì)獲得的數(shù)目偏多，原因是__直接計(jì)數(shù)法無(wú)論菌體死活均被計(jì)數(shù)，而稀釋涂布平板法當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落(合理答案給分)__。 [解析]　(1)按清水與鹽質(zhì)量比為4︰1的比例制好鹽水后，需將鹽水煮沸，其作用是除去鹽水中的氧氣和殺菌。(2)為測(cè)定泡菜中亞硝酸鹽含量，首先要配制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)顯色液，并與樣品進(jìn)行比較，泡菜制作的第3～5天亞硝酸鹽含量較高不宜食用，原因是適宜的pH、溫度和一定微生物作用下亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成致癌物質(zhì)亞硝胺。(3)若將稀釋105倍的某細(xì)菌菌液，用直接計(jì)數(shù)法和稀釋涂布平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)。①直接計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先蓋蓋玻片，再在蓋玻片的邊緣滴加培養(yǎng)液。②稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，因此每升菌液中細(xì)菌數(shù)量＝(40＋154＋156＋152)40.1105103＝1.2551011個(gè)。③由于直接計(jì)數(shù)法無(wú)論菌體死活均被計(jì)數(shù)，而稀釋涂布平板法當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落，上述兩種計(jì)數(shù)法中，直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)獲得的細(xì)菌數(shù)量偏多，而稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)獲得的細(xì)菌數(shù)量偏少。 4．(2018東北三省三校一模)為了對(duì)柑橘綜合利用，某研究人員做以下實(shí)驗(yàn)： 請(qǐng)回答以下問(wèn)題： (1)橘皮精油__無(wú)__色，主要成分是__檸檬烯__。本實(shí)驗(yàn)用到的植物芳香油提取方法為_(kāi)_水蒸氣蒸餾和壓榨__。 (2)若要計(jì)算提取精油的出油率，需要稱量__芳香油和原料__的質(zhì)量。對(duì)比發(fā)現(xiàn)方法1的出油率稍低，但是發(fā)現(xiàn)其香氣、色澤更接近于鮮橘，原因是方法2會(huì)使__原料焦糊和有效成分水解__，所以通常先采用方法1提取，并將方法1之后的殘?jiān)梅椒?進(jìn)一步提取。 (3)通常使用方法1時(shí)，可以提前使用__石灰水__浸泡。浸泡的時(shí)間通常是__10h__以上。 (4)使用方法2提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，柑橘皮的破碎度越高，即顆粒越小，出油率越高，原因是__原料(相對(duì)表)面積大，隨水蒸汽蒸餾速度快。(與溶劑接觸的面積越大)(橘皮香精油從果皮內(nèi)部逐漸擴(kuò)散至固體表面所通過(guò)的距離越短，故容易滲出。)__。 [解析]　(1)橘皮精油無(wú)色，主要成分是檸檬烯。本實(shí)驗(yàn)用到的植物芳香油提取方法為水蒸氣蒸餾和壓榨。(2)若要計(jì)算提取精油的出油率，需要稱量芳香油和原料的質(zhì)量。對(duì)比發(fā)現(xiàn)方法1的出油率稍低，但是發(fā)現(xiàn)其香氣、色澤更接近于鮮橘，原因是方法2會(huì)使原料焦糊和有效成分水解。(3)通常使用方法1時(shí)，用石灰水浸泡檸檬皮可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，分解果膠，防止壓榨時(shí)滑脫，提高出油率。浸泡的時(shí)間通常是10h以上。(4)使用方法2(水蒸氣蒸餾法)提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，柑橘皮的破碎度越高，即顆粒越小，出油率越高，原因是原料(相對(duì)表)面積大，隨水蒸汽蒸餾速度快。 5．大腸桿菌是與我們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系非常密切的細(xì)菌，請(qǐng)回答有關(guān)檢測(cè)飲用水中大腸桿菌的問(wèn)題： (1)檢測(cè)飲用水中大腸桿菌的含量時(shí)，通常將樣品進(jìn)行一系列的梯度稀釋，將不同稀釋度的水樣用涂布器分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)，然后記錄菌落數(shù)量，這種方法稱為_(kāi)_稀釋涂布平板法__。判斷下圖所示的4個(gè)菌落分布圖中，不可能是用該方法得到的是__D__。 (2)用上述方法統(tǒng)計(jì)樣本中菌落數(shù)時(shí)是否需要設(shè)置對(duì)照組？__需要__，其原因是需要判斷培養(yǎng)基__是否被雜菌污染(滅菌是否合格)__，對(duì)于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是將__未接種__的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置一段時(shí)間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。 (3)在微生物培養(yǎng)操作過(guò)程中，為防止雜菌污染，需對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿進(jìn)行__滅菌__(填“消毒”或“滅菌”)處理；操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和__消毒__；靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使其內(nèi)蛋白質(zhì)變性，還能損傷它的__DNA__的結(jié)構(gòu)。 (4)檢測(cè)大腸桿菌實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用過(guò)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過(guò)__滅菌__處理才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。 [解析]　D中菌落分布情況為利用平板劃線法所得。為判斷培養(yǎng)基滅菌是否合格，本實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置對(duì)照。要判斷固體培養(yǎng)基是否被污染，可將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，若發(fā)現(xiàn)有菌落說(shuō)明培養(yǎng)基已被污染。消毒是指使用較溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。滅菌是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。對(duì)人的手不能進(jìn)行滅菌處理。對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿要進(jìn)行滅菌處理，對(duì)操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和用酒精消毒。 6．(2018全國(guó)卷Ⅲ)回答下列與酵母菌有關(guān)的問(wèn)題： (1)分離培養(yǎng)酵母菌通常使用__麥芽汁瓊脂__(填“牛肉膏蛋白胨” “MS”或“麥芽汁瓊脂”)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基應(yīng)采用__高壓蒸汽__滅菌法滅菌。若將酵母菌劃線接種在平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間后可觀察到菌落，菌落的含義是__由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體__。 (2)酵母菌液體培養(yǎng)時(shí)，若通入氧氣，可促進(jìn)__菌體快速增殖__(填“菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)生”或“乳酸產(chǎn)生”)；若進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，可促進(jìn)__乙醇產(chǎn)生__(填“菌體快速增殖”“乙醇產(chǎn)生”或“乳酸產(chǎn)生”)。 (3)制作面包時(shí)，為使面包松軟通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松軟的原因是__酵母菌分解葡萄糖會(huì)產(chǎn)生CO2，CO2使面包松軟__。 [解析]　(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用廣泛的細(xì)菌培養(yǎng)基；MS培養(yǎng)基是滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要的培養(yǎng)基；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基通常用于酵母菌(真菌)的培養(yǎng)、鑒定及菌種保存。培養(yǎng)基的滅菌方法為高壓蒸汽滅菌法。菌落是指由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體。 (2)酵母菌為兼性厭氧型微生物，在有氧條件下進(jìn)行有氧呼吸為酵母菌的繁殖提供能量，在無(wú)氧條件下，酵母菌進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生乙醇。 (3)面包松軟是因?yàn)橹谱鬟^(guò)程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖產(chǎn)生大量的CO2，CO2遇熱膨脹，使得制作的面包松軟多孔。 7．(2018江蘇卷)酵母的蛋白質(zhì)含量可達(dá)自身干重的一半，可作為飼料蛋白的來(lái)源。有些酵母可以利用工業(yè)廢甲醇作為碳源進(jìn)行培養(yǎng)，這樣既可減少污染又可降低生產(chǎn)成本。研究人員擬從土壤樣品中分離該類酵母，并進(jìn)行大量培養(yǎng)。下圖所示為操作流程，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)配制培養(yǎng)基時(shí)，按照培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的__pH__，及時(shí)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，并進(jìn)行__高壓蒸汽(濕熱)__滅菌。 (2)取步驟②中不同梯度的稀釋液加入標(biāo)記好的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在步驟③中將溫度約__50 ℃__(在25 ℃、50 ℃或80 ℃ 中選擇)的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。 (3)挑取分離平板中長(zhǎng)出的單菌落，按步驟④所示進(jìn)行劃線。下列敘述合理的有__a、b、d____。 a．為保證無(wú)菌操作，接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌 b．劃線時(shí)應(yīng)避免劃破培養(yǎng)基表面，以免不能形成正常菌落 c．挑取菌落時(shí)，應(yīng)挑取多個(gè)菌落，分別測(cè)定酵母細(xì)胞中甲醇的含量 d．可以通過(guò)逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株 (4)步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過(guò)程中需保證充足的營(yíng)養(yǎng)和__氧氣__供應(yīng)。為監(jiān)測(cè)酵母的活細(xì)胞密度，將發(fā)酵液稀釋1 000倍后，經(jīng)等體積臺(tái)盼藍(lán)染液染色，用2516型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)，理論上__無(wú)__色細(xì)胞的個(gè)數(shù)應(yīng)不少于__30__，才能達(dá)到每毫升3109個(gè)活細(xì)胞的預(yù)期密度。 [解析]　(1)配制培養(yǎng)基時(shí)，進(jìn)行計(jì)算、稱量、溶化后，需先調(diào)pH再分裝到錐形瓶中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。 (2)倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度約為50 ℃，冷凝后倒置培養(yǎng)。 (3)平板劃線時(shí)，接種針、接種環(huán)使用前和每次劃線后都需要進(jìn)行灼燒滅菌，以免造成雜菌污染，a正確；劃線時(shí)不能劃破培養(yǎng)基表面，否則不能形成正常菌落，b正確；挑取菌落時(shí)，應(yīng)挑取多個(gè)不同的菌落，分別測(cè)定酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量，c錯(cuò)誤；逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，能篩選出其中的耐受菌，獲得耐受高甲醇的菌株，d正確。 (4)酵母是兼性厭氧型真菌，在有氧條件下可大量繁殖。酵母擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，需保證充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣等條件。由題中信息“經(jīng)等體積臺(tái)盼藍(lán)染液染色”可知，計(jì)數(shù)室中培養(yǎng)液容積實(shí)際只有0.12＝0.05 mm3。設(shè)5個(gè)中方格中無(wú)色(活細(xì)胞不能被臺(tái)盼藍(lán)染色)的細(xì)胞數(shù)目為x個(gè)，則3109＝x/5251 0001 0000.05，解得x＝30(個(gè))。