《藥物分析學(xué)：總論 第十章 生物藥物分析概論》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《藥物分析學(xué)：總論 第十章 生物藥物分析概論（69頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、第十章第十章 生物藥物分析概論生物藥物分析概論藥物分析學(xué)藥物分析學(xué) 總論總論1Chapter 10 Biopharmaceutical Analysis基本要求掌握生化藥物的種類、鑒別、檢查和含量測定方法1熟悉生物制品的分類、理化檢定與生物學(xué)檢定2了解生化藥物分析和生物制品分析的實(shí)例32防病、治病的防病、治病的三大藥源三大藥源藥藥物物化化學(xué)學(xué)藥藥物物生生物物藥藥物物中中藥藥生生化化藥藥物物生生物物技技術(shù)術(shù)藥藥物物生生物物制制品品3生化藥物生化藥物生物制品生物制品（生物技術(shù)藥物）（生物技術(shù)藥物）生物藥物生物藥物（biopharmaceuticals）：利用利用生物體、生物生物體、生物組織和器官制

2、組織和器官制得的天然活性得的天然活性物質(zhì)及其類似物質(zhì)及其類似物物分類沒有嚴(yán)分類沒有嚴(yán)格的界限格的界限 一、一、生化藥物種類生化藥物種類 例例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。動動物物植植物物微微生生物物提提取取現(xiàn)現(xiàn)代代生生物物技技術(shù)術(shù)生生命命基基本本物物質(zhì)質(zhì)及及衍衍生生物物降降解解物物大大分分子子的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)修修飾飾物物生生物物- -化化學(xué)學(xué)半半合合成成5氨基酸及其衍生物類藥物氨基酸及其衍生物類藥物 多肽和蛋白類藥物多肽和蛋白類藥物酶類與輔酶類藥物酶類與輔酶類藥物糖類藥物糖類藥物脂類藥物脂類藥物生化藥物種類生化藥物種類核酸及其降解產(chǎn)物和衍生物類藥物核酸及其降解產(chǎn)物和衍

3、生物類藥物 多組分生化藥物多組分生化藥物6 應(yīng)用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動物和人源的組織和液體等生物材料制備的藥品 自動免疫制品自動免疫制品 生物制品生物制品biological products 其他（血液制品、組織制品等）其他（血液制品、組織制品等） 免疫血清免疫血清菌苗、疫苗、類毒素菌苗、疫苗、類毒素診斷制品診斷制品中國藥科大學(xué)藥物分析教研室 利用重組利用重組DNA等生等生物技術(shù)生產(chǎn)的藥物物技術(shù)生產(chǎn)的藥物基因工程藥物基因工程藥物 biotechnology drugs發(fā)現(xiàn)并確定有治療作用的Pr分離或合成控制該P(yáng)r合成的基因?qū)⒃摶?/p>

4、因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞表達(dá)該P(yáng)r分離純化中國藥科大學(xué)藥物分析教研室胰臟胰臟(A)n胰島素原胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因胰島素原基因與質(zhì)與質(zhì)粒連粒連接接感染感染E.coli胰島素原胰島素原重組胰島素原的合成基因工程藥物主要類別基因工程藥物主要類別蛋白質(zhì)多肽類：蛋白質(zhì)多肽類： 激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類 細(xì)胞因子類細(xì)胞因子類 酶及凝血因子類酶及凝血因子類核酸類：核酸類： 反義寡核苷酸反義寡核苷酸 等等人生長激素釋放抑制因子人生長激素釋放抑制因子（Human Somatotin）干擾素（干擾素（Human Interferon

5、s）鏈激酶（鏈激酶（Streptokinase） 中國藥科大學(xué)藥物分析教研室生化藥物和基因工程藥物特點(diǎn)生化藥物和基因工程藥物特點(diǎn)1 1）共同特點(diǎn)：）共同特點(diǎn)：活性強(qiáng)，毒副作用小活性強(qiáng)，毒副作用小2 2）分子量大，結(jié)構(gòu)確證難）分子量大，結(jié)構(gòu)確證難3 3）全過程全過程的質(zhì)量控制：從原料、菌種到生產(chǎn)設(shè)備、的質(zhì)量控制：從原料、菌種到生產(chǎn)設(shè)備、中間體、產(chǎn)品中間體、產(chǎn)品4 4）生物活性檢查）生物活性檢查5 5）安全性檢查：異常毒性檢查、過敏物質(zhì)檢查、外）安全性檢查：異常毒性檢查、過敏物質(zhì)檢查、外源性源性DNA殘留量、宿主菌蛋白殘留量等殘留量、宿主菌蛋白殘留量等 6 6）效價（含量）測定）效價（含量）測定二

6、、鑒別方法二、鑒別方法 理化鑒別法：理化鑒別法：化學(xué)鑒別法化學(xué)鑒別法 光譜鑒別法光譜鑒別法 HPLCHPLC法法生化鑒別法：生化鑒別法：酶法酶法 電泳法電泳法 等電聚焦法等電聚焦法生物鑒別法：生物鑒別法：家兔驚厥試驗家兔驚厥試驗肽圖鑒別法：肽圖鑒別法：胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解- -RP-HPLCRP-HPLC法法 溴化氰裂解法溴化氰裂解法12 第一節(jié)第一節(jié) 生化藥物生化藥物 1.1.化學(xué)鑒別法化學(xué)鑒別法 藥藥物物 + + 試試劑劑現(xiàn)現(xiàn)象象顏顏色色沉沉淀淀例：谷氨酸例：谷氨酸(Glutamic Acid)片的鑒別片的鑒別 取本品的細(xì)粉適量(約相當(dāng)于谷氨酸5 mg)加水5ml，加熱使谷氨酸溶解，濾

7、過，取濾液，加茚三酮約5 mg，加熱，溶液顯藍(lán)至藍(lán)紫色。13 2.2.光譜鑒別法光譜鑒別法 例例：細(xì)胞色素細(xì)胞色素C的鑒別的鑒別 取含鐵量項下的供試品溶液1ml，置50 ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉約15 mg，搖勻，測定，在520、550 nm波長處有最大吸收，在535 nm波長處有最小吸收。 利用藥物的光譜特性如利用藥物的光譜特性如UVUV或或IRIR特征吸收而特征吸收而進(jìn)行鑒別進(jìn)行鑒別1415原理：原理：細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C是以含鐵卟啉為是以含鐵卟啉為輔基的結(jié)合蛋白，當(dāng)其結(jié)構(gòu)中鐵輔基的結(jié)合蛋白，當(dāng)其結(jié)構(gòu)中鐵原子為三價原子為三價(Fe(Fe3+3+

8、) )時，它是氧化型時，它是氧化型的細(xì)胞色素的細(xì)胞色素C C，但接受一個電子變，但接受一個電子變成二價鐵成二價鐵(Fe(Fe2+2+) )后，就成了還原型后，就成了還原型的細(xì)胞色素的細(xì)胞色素C C。 在磷酸鹽緩沖液在磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)(pH=7.3)中，中，其還原型在其還原型在550550、520520與與415nm415nm波長波長處有最大吸收，而其氧化型在處有最大吸收，而其氧化型在280280、361361、410410與與529nm529nm波長處有最大波長處有最大吸收，故可采用吸收，故可采用UVUV進(jìn)行鑒別。進(jìn)行鑒別。 3. 3. HPLCHPLC法法 利用對照品溶液和供試品

9、溶液色譜圖的保留利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。時間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。 例例：胰島素的鑒別胰島素的鑒別 采用HPLC法，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠(5 m)，柱溫40，流動相為0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=3.0)乙腈(73 27)，檢測波長214 nm。取胰島素(豬或牛)對照品及供試品適量，分別加0.01mol/L鹽酸溶液制成濃度為40 U/ml的溶液，各取5 L進(jìn)樣，供試品主峰的保留時間應(yīng)與同種屬對照品主峰的保留時間一致。 16 4. 4.酶法酶法牛牛 纖纖 維維 蛋蛋 白白 原原牛牛 凝凝 血血 酶酶蛋蛋 白白 結(jié)結(jié) 塊塊尿尿 激激

10、 酶酶牛牛 纖纖 維維 蛋蛋 白白 溶溶 酶酶 原原結(jié)結(jié) 塊塊 溶溶 解解 ：氣氣 泡泡 上上 升升17例：尿激酶的鑒別例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法氣泡上升法 原理：原理： 方法方法： 取濃度為取濃度為20 U/ml20 U/ml的供試品溶液，的供試品溶液，1ml1ml加牛纖維加牛纖維蛋白原溶液蛋白原溶液0.3 ml0.3 ml，再依次加入加牛纖維蛋白原溶，再依次加入加牛纖維蛋白原溶酶溶液酶溶液0.2 ml0.2 ml，牛凝血酶溶液，牛凝血酶溶液0.2 ml0.2 ml，迅速振搖，迅速振搖，立即置立即置37370.50.5水浴中保溫，記時，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)水浴中保溫，記時，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在在303045

11、s45s內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15 min15 min內(nèi)重新溶解，當(dāng)內(nèi)重新溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時，氣泡逐漸上升。以凝結(jié)塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%0.9%氯化鈉作空氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在白，同法操作，凝結(jié)塊在2h2h內(nèi)不溶。內(nèi)不溶。185. 5. 電泳法電泳法：以肝素鑒別為例：以肝素鑒別為例OOOOOOHCOO-OSO3-HNSO3-CH2OSO3-與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置相應(yīng)與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置相應(yīng)19 6. 6. 生物鑒別法生物鑒別法 利用生物體進(jìn)行試驗來鑒別藥物利用生物體進(jìn)行試驗來鑒別藥物20 例例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素家兔驚厥試驗鑒別胰島素

12、 利用胰島素的降糖作用，給家兔大利用胰島素的降糖作用，給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS50%GS，驚厥停止。，驚厥停止。 7. 7. 肽圖鑒別法肽圖鑒別法 肽圖譜分析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小肽圖譜分析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶，一般為肽鏈內(nèi)切酶，作用于特殊白水解酶，一般為肽鏈內(nèi)切酶，作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)，將蛋白質(zhì)裂解成較小的片斷，的肽鏈位點(diǎn)，將蛋白質(zhì)裂解成較小的片斷，經(jīng)分離檢測形成特征性指紋圖譜。經(jīng)分離檢測形成特征性指紋圖譜。21三、檢查三、檢查 生化制藥主要

13、有六個階段，有效成分在生物材生化制藥主要有六個階段，有效成分在生物材料中濃度很低，雜質(zhì)的含量相對比較高，因此，料中濃度很低，雜質(zhì)的含量相對比較高，因此，雜質(zhì)檢查和安全性檢查就顯得非常重要。生化雜質(zhì)檢查和安全性檢查就顯得非常重要。生化藥物應(yīng)保證符合無毒、無菌、無熱源、無致敏藥物應(yīng)保證符合無毒、無菌、無熱源、無致敏源和降壓物質(zhì)等一般安全性要求。源和降壓物質(zhì)等一般安全性要求。22（一）雜質(zhì)檢查（一）雜質(zhì)檢查 一般雜質(zhì)檢查：一般雜質(zhì)檢查：氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬等 特殊雜質(zhì)檢查：特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析 生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查 如：如：原料藥純度分析原料藥純度分析 多糖類多糖類-低

14、聚糖、核酸、蛋白質(zhì)低聚糖、核酸、蛋白質(zhì) 酶類藥物酶類藥物-酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。23例例：糜蛋白酶中胰蛋白酶的檢查：糜蛋白酶中胰蛋白酶的檢查 吸取供試品溶液吸取供試品溶液(10 mg/ml) 50l(10 mg/ml) 50l與與0.1%0.1%胰蛋白酶對照品溶液胰蛋白酶對照品溶液5l5l，分別置白色點(diǎn)滴板，分別置白色點(diǎn)滴板上，各加對甲苯磺酰上，各加對甲苯磺酰-L-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽試液精氨酸甲酯鹽酸鹽試液0.2 ml0.2 ml，放置后，供試品溶液應(yīng)不呈現(xiàn)紫紅色，放置后，供試品溶液應(yīng)不呈現(xiàn)紫紅色或

15、呈色時間晚于胰蛋白酶對照品溶液或呈色時間晚于胰蛋白酶對照品溶液(1.0(1.0) )。2425（二）安全性試驗（二）安全性試驗熱源與細(xì)菌內(nèi)毒素試驗熱源與細(xì)菌內(nèi)毒素試驗 ： ChP ChP中的熱原檢查采中的熱原檢查采 用家兔法，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用鱟試劑法用家兔法，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用鱟試劑法 異常毒性試驗異常毒性試驗 : :急性毒性物質(zhì)急性毒性物質(zhì) 用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物死亡與否為終點(diǎn)。應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物死亡與否為終點(diǎn)。

16、 過敏試驗：過敏試驗：異性蛋白異性蛋白 有可能存在異性蛋白的藥物應(yīng)作過敏試驗。有可能存在異性蛋白的藥物應(yīng)作過敏試驗。例例： 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C的過敏試驗的過敏試驗 取本品適量，加滅菌注射用水稀釋成每取本品適量，加滅菌注射用水稀釋成每1ml1ml中含中含細(xì)胞色素細(xì)胞色素C 7.5 mgC 7.5 mg的溶液，作為致敏液與供試品溶液的溶液，作為致敏液與供試品溶液。另取體重為。另取體重為250250350 g350 g的健康豚鼠的健康豚鼠6 6只，連續(xù)只，連續(xù)3 3次隔次隔日腹腔注射致敏液日腹腔注射致敏液0.5 ml0.5 ml時，時，2 2周后，再自股周后，再自股( (耳耳) )靜靜脈注射供試

17、品溶液脈注射供試品溶液1mL1mL時，注射后時，注射后15 min15 min內(nèi)，均不得內(nèi)，均不得出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽三聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者，或有抽搐或咳嗽三聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者，或有抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。2627 降壓物質(zhì)試驗：降壓物質(zhì)試驗： 降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。血壓降低的物質(zhì)。 無菌試驗無菌試驗

18、檢查藥品及敷料是否染有活菌：檢查藥品及敷料是否染有活菌： 無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢測手段。要使藥品真正達(dá)到無菌，首先應(yīng)嚴(yán)格測手段。要使藥品真正達(dá)到無菌，首先應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行執(zhí)行GMPGMP管理制度。管理制度。n含量表示方法：含量表示方法：百分含量百分含量適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物 或經(jīng)水解后變成小分子的藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物 生物效價或酶活力單位生物效價或酶活力單位適用于酶類、適用于酶類、 蛋白質(zhì)類藥物蛋白質(zhì)類藥物28四、含量測定四、含量測定n含量測定方法含量測定方法： 理化分析法理化分析法： 化學(xué)分析法：化學(xué)分析法：

19、重量測定法、滴定分析法重量測定法、滴定分析法 電化學(xué)分析法電化學(xué)分析法 光譜分析法：光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法比色法、紫外分光、熒光分光光法 色譜分析法：色譜分析法：HPLCHPLC法（法（RP-HPLCRP-HPLC、 HPIEC HPIEC 、HPGFCHPGFC、 灌注色譜法、灌注色譜法、HPCEHPCE法）法） 酶法酶法：酶活力測定法、酶分析法：酶活力測定法、酶分析法 電泳法電泳法 生物檢定法生物檢定法291.1.滴定分析法滴定分析法 利用氨基酸類藥物分子的氨基的弱堿性，利用氨基酸類藥物分子的氨基的弱堿性，可采用非水溶液滴定法測定含量，如可采用非水溶液滴定法測定含量，如

20、L L門冬門冬氨酸、氨酸、L L丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、組氨酸丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、組氨酸。利用谷氨酸羧基的酸性，可采用中和滴定法。利用谷氨酸羧基的酸性，可采用中和滴定法測定含量。測定含量。 3031例：例：甘露醇和山梨醇均采用碘量法測定，甘露甘露醇和山梨醇均采用碘量法測定，甘露醇與高碘酸發(fā)生定量氧化還原反應(yīng)，剩余的高碘醇與高碘酸發(fā)生定量氧化還原反應(yīng)，剩余的高碘酸及生成的碘酸再與碘化鉀作用，生成游離碘，酸及生成的碘酸再與碘化鉀作用，生成游離碘，用硫代硫酸鈉溶液滴定。用硫代硫酸鈉溶液滴定。CH2OH(CHOH)4CH2OH+5HIO42HCHO+4HCOOH+5HIO3+H2O2HIO4+14

21、KI+7H2SO48I2+7K2SO4+8H2O 2. 2. 分光光度法分光光度法 生化藥物一般采用比色法和生化藥物一般采用比色法和UVUV法測定含法測定含量量如：如：硫酸軟骨素硫酸軟骨素為大分子酸性粘多糖類藥物，其結(jié)為大分子酸性粘多糖類藥物，其結(jié)構(gòu)中的雙糖單位分子中含一分子氨基己糖，可采用構(gòu)中的雙糖單位分子中含一分子氨基己糖，可采用Elson-MorganElson-Morgan比色法測定含量。先酸水解供試品，比色法測定含量。先酸水解供試品，生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，再與對二甲氨基苯甲醛鹽酸醇溶液反應(yīng)產(chǎn)生紅色，再與對二甲氨基苯

22、甲醛鹽酸醇溶液反應(yīng)產(chǎn)生紅色，以鹽酸氨基葡萄糖為對照品，于以鹽酸氨基葡萄糖為對照品，于525nm525nm波長處測定波長處測定吸光度。吸光度。323. HPLC3. HPLC法法 HPLCHPLC法適用于高沸點(diǎn)、大分子量、熱穩(wěn)定性差法適用于高沸點(diǎn)、大分子量、熱穩(wěn)定性差的生物活性物質(zhì)的分析，常以具有一定的生物活性物質(zhì)的分析，常以具有一定pHpH值的緩沖溶值的緩沖溶液作為流動相，常溫操作，分析環(huán)境與生理環(huán)境相似，液作為流動相，常溫操作，分析環(huán)境與生理環(huán)境相似，因而具有溫和的分析條件與良好的生物兼容性，有利因而具有溫和的分析條件與良好的生物兼容性，有利于保持生物大分子的構(gòu)象和生理活性等特點(diǎn)。于保持生物

23、大分子的構(gòu)象和生理活性等特點(diǎn)。 HPLCHPLC法可以用于氨基酸及其衍生物、多肽、蛋白法可以用于氨基酸及其衍生物、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、卟啉、核酸及其降解產(chǎn)物的分離與測定。質(zhì)、糖類、卟啉、核酸及其降解產(chǎn)物的分離與測定。33l 高效離子交換色譜法（高效離子交換色譜法（HPIECHPIEC）：）：常用于分離分析蛋白質(zhì)、多肽；常用于分離分析蛋白質(zhì)、多肽；特點(diǎn)：特點(diǎn)： 蛋白質(zhì)、多肽的分離是根據(jù)其相應(yīng)的離子化程度而進(jìn)行的；蛋白質(zhì)、多肽的分離是根據(jù)其相應(yīng)的離子化程度而進(jìn)行的； 分離過程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進(jìn)行的；分離過程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進(jìn)行的； 柱效中等但具有較高質(zhì)量的活性回收。柱效中等但具

24、有較高質(zhì)量的活性回收。l 高效凝膠過濾色譜法（高效凝膠過濾色譜法（HPGFCHPGFC） 可用于多肽和蛋白質(zhì)等生化藥物分離，并測定分子量?？捎糜诙嚯暮偷鞍踪|(zhì)等生化藥物分離，并測定分子量。特點(diǎn)：特點(diǎn)：本法填料和樣品間的相互作用在所有的液相色譜技術(shù)中，本法填料和樣品間的相互作用在所有的液相色譜技術(shù)中，是最溫和的。是最溫和的。 在固定比例的水溶液中分離，流動相通常為緩沖液；在固定比例的水溶液中分離，流動相通常為緩沖液； 分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。 20 20世紀(jì)世紀(jì)9090年代發(fā)展起來的用于分離純化和分析的色譜新技術(shù)年

25、代發(fā)展起來的用于分離純化和分析的色譜新技術(shù) 特點(diǎn)：采用新的分離介質(zhì)，允許液體傳送流經(jīng)介質(zhì)的內(nèi)表特點(diǎn)：采用新的分離介質(zhì)，允許液體傳送流經(jīng)介質(zhì)的內(nèi)表面，面，樣品直接灌注入介質(zhì)顆粒中樣品直接灌注入介質(zhì)顆粒中，大大消除了傳統(tǒng)色譜，大大消除了傳統(tǒng)色譜分離中擴(kuò)散速率對分離容量和分辨率的負(fù)面影響，提高分離分離中擴(kuò)散速率對分離容量和分辨率的負(fù)面影響，提高分離的速度和效率。的速度和效率。 應(yīng)用：基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化和分析應(yīng)用：基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化和分析l 灌注灌注色譜法色譜法 4.4.酶分析法酶分析法 以酶能專一而高效地催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過以酶能專一而高效地催化某化學(xué)反

26、應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶反應(yīng)速度的測定或?qū)ι晌锏葷舛鹊臏y定而檢對酶反應(yīng)速度的測定或?qū)ι晌锏葷舛鹊臏y定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量。測相應(yīng)物質(zhì)的含量。包括酶活力測定法和酶法分析包括酶活力測定法和酶法分析兩種類型。兩種類型。 37以酶為分析對象以酶為分析對象的分析方法的分析方法以酶為分析工具或分以酶為分析工具或分析試劑的分析方法析試劑的分析方法 酶活力測定法酶活力測定法 酶分析法酶分析法以酶能夠高效、專一地催化某些化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通以酶能夠高效、專一地催化某些化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過過對酶反應(yīng)速度的測定對酶反應(yīng)速度的測定或或生成物等濃度的測定生成物等濃度的測定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量原理：原理：

27、定義：定義：目的：目的：測定某種測定某種酶的活力酶的活力或活性或活性，用酶的活力，用酶的活力單位和比活性表示單位和比活性表示以酶為試劑測定樣品中酶以酶為試劑測定樣品中酶以外的以外的其它物質(zhì)的含量其它物質(zhì)的含量 酶反應(yīng)速度用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示酶反應(yīng)速度用單位時間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示l酶活力測定法酶活力測定法1. 1. 概念：概念：酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力酶活力的測定即是測定一個酶活力的測定即是測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度dtdtdC(B)dC(B)dtdtdC(A)dC(A)反應(yīng)速度反應(yīng)

28、速度A A B B 酶酶2. 2. 酶活力酶活力評價指標(biāo)評價指標(biāo)酶的活力單位（酶的活力單位（enzymatic activity unitenzymatic activity unit） 酶的比活性（酶的比活性（specific activityspecific activity）定義：一定條件下，單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化一定定義：一定條件下，單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化一定量底物所需酶的量。量底物所需酶的量。酶在酶在2525以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、最適當(dāng)?shù)囊宰钸m當(dāng)?shù)牡孜餄舛取⒆钸m當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)?shù)膒HpH等條件下，等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化每分鐘能轉(zhuǎn)化1 1 molmol底物的酶量為一

29、個活底物的酶量為一個活性單位，用性單位，用IUIU表示。表示。定義：每毫克蛋白質(zhì)中所含的酶單位定義：每毫克蛋白質(zhì)中所含的酶單位數(shù)，用數(shù)，用IU/IU/（mg mg 蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)）表示表示每毫克酶的每毫克酶的活力單位數(shù)活力單位數(shù) 在酶高度純凈，酶的分子量已知時，可采用分子活力表示在酶高度純凈，酶的分子量已知時，可采用分子活力表示3. 3. 酶促反應(yīng)的條件及影響因素：酶促反應(yīng)的條件及影響因素：使所有待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。使所有待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。如何選擇酶促反應(yīng)的條件：如何選擇酶促反應(yīng)的條件： 底物濃度影響底物濃度影響：反應(yīng)速率受到底物濃度影響：反應(yīng)

30、速率受到底物濃度影響 pHpH影響影響：pHpH影響酶的活性和反應(yīng)方向影響酶的活性和反應(yīng)方向SS100K100KmmpH7pH7pH10pH10乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸如：乳酸脫氫酶如：乳酸脫氫酶 溫度影響溫度影響：這一影響體現(xiàn)在兩個方面這一影響體現(xiàn)在兩個方面直接影響化學(xué)反應(yīng)速度直接影響化學(xué)反應(yīng)速度影響酶影響酶通常選用通常選用2525，3030或或37 37 （0.10.1） 輔助因子影響輔助因子影響： 有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時需要某些

31、相應(yīng)的物質(zhì)。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。 空白和對照空白和對照： 通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經(jīng)通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經(jīng)過失效處理）；過失效處理）； 空白是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量；空白是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量；提供未知因素的影響。提供未知因素的影響。 對照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要對照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要用于比較或標(biāo)定。用于比較或標(biāo)定。ii) ii) 常用方法有：常用方法有：適當(dāng)條件下適當(dāng)條件下將酶和底物混合將酶和底物混合 測定生成一定量產(chǎn)物所需的時測

32、定生成一定量產(chǎn)物所需的時間，即終點(diǎn)法間，即終點(diǎn)法 隔一定時間，間斷或連續(xù)地測隔一定時間，間斷或連續(xù)地測定反應(yīng)變化定反應(yīng)變化 反應(yīng)一定時間后停止反應(yīng)，定反應(yīng)一定時間后停止反應(yīng)，定量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量 i) i) 包括物理法、化學(xué)法和酶分析法包括物理法、化學(xué)法和酶分析法4. 4. 測定方法：測定方法：按取樣和檢測方式分為按取樣和檢測方式分為取樣測定取樣測定和和連續(xù)測定連續(xù)測定： 取樣測定取樣測定 酶反應(yīng)開始后不同的時間，取出一定量反應(yīng)液，并用酶反應(yīng)開始后不同的時間，取出一定量反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，對產(chǎn)物和底物進(jìn)行定量分析，適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，對

33、產(chǎn)物和底物進(jìn)行定量分析，求得單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。求得單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。加入酶變性劑加入酶變性劑加熱使酶變性加熱使酶變性 基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測的方法。程中對反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測的方法。 連續(xù)測定連續(xù)測定 幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出具體測定方法具體測定方法取樣測定法目前仍廣泛采用，這是因為：取樣測定法目前仍廣泛采用，這是因為： 它不需要特殊儀器；它不需要特殊儀器； 由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原

34、來的底物由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。從準(zhǔn)確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。從準(zhǔn)確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。 檢測方法：檢測方法：常用常用UV-VisUV-Vis和熒光分光光度法和熒光分光光度法 UV-Vis UV-Vis分光光度法：分光光度法： 熒光分光光度法熒光分光光度法如：細(xì)胞色素氧化酶的底物為細(xì)胞色素如：細(xì)胞色素氧化酶的底物為細(xì)胞色素C C，該物質(zhì)的還，該物質(zhì)的還原態(tài)在原態(tài)在550nm550nm的摩爾吸收系數(shù)為的摩爾吸收系數(shù)為2.182.1810104 4，而氧

35、化，而氧化態(tài)為態(tài)為0.800.8010104 4，可利用這種吸收度差別來進(jìn)行測定。，可利用這種吸收度差別來進(jìn)行測定。 產(chǎn)物和底物之一有熒光，熒光強(qiáng)度變化可指示反應(yīng)速度。產(chǎn)物和底物之一有熒光，熒光強(qiáng)度變化可指示反應(yīng)速度。特別適于酶量或底物量極低時的快速分析。特別適于酶量或底物量極低時的快速分析。 旋光度法旋光度法產(chǎn)物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。產(chǎn)物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。某些酶反應(yīng)過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的某些酶反應(yīng)過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的方法可用時，可考慮用旋光度測定法方法可用時，可考慮用旋光度測定法 其它法其它法酶偶聯(lián)測定、電化學(xué)

36、測定、放射化學(xué)法等酶偶聯(lián)測定、電化學(xué)測定、放射化學(xué)法等5. 5. 計算：計算：測定酶反應(yīng)速度測定酶反應(yīng)速度V V (velocity)(velocity)求酶的濃度或含量求酶的濃度或含量C C (concentration)(concentration)V V=k=kC C+b+b 酶反應(yīng)進(jìn)程曲線：酶反應(yīng)進(jìn)程曲線：不同酶量的不同酶量的產(chǎn)物濃度產(chǎn)物濃度C CB B時間時間t t反應(yīng)速度反應(yīng)速度V Vt t檢驗酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否正確檢驗酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否正確酶濃度曲線：酶濃度曲線：反應(yīng)速度反應(yīng)速度V Vt t酶量酶量C C生物制品：生物制品：是應(yīng)用普通的生物技術(shù)獲得的微是應(yīng)用普通的生物技術(shù)獲得

37、的微生物、細(xì)胞及組織等生物材料制備用于人類生物、細(xì)胞及組織等生物材料制備用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。第二節(jié)第二節(jié) 生物制品生物制品49一、生物制品的分類一、生物制品的分類1.1.疫苗類藥物：疫苗類藥物：細(xì)菌疫苗、病毒疫苗、聯(lián)合疫苗、細(xì)菌疫苗、病毒疫苗、聯(lián)合疫苗、 2.2.抗毒素及抗血清類藥物：抗毒素及抗血清類藥物：被動免疫制劑被動免疫制劑3.3.血液制品血液制品4.4.重組重組DNADNA制品：制品：細(xì)胞因子、生長因子、酶、抗體細(xì)胞因子、生長因子、酶、抗體5.5.診斷制品診斷制品 6.6.其他制品其他制品50二、質(zhì)量控制特點(diǎn)二、質(zhì)量控制特點(diǎn)生物制品的質(zhì)量需要

38、從原材料、生產(chǎn)過程到最生物制品的質(zhì)量需要從原材料、生產(chǎn)過程到最終產(chǎn)品進(jìn)行全過程控制，對原液、半成品和成終產(chǎn)品進(jìn)行全過程控制，對原液、半成品和成品進(jìn)行微生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)檢定。質(zhì)量突品進(jìn)行微生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)檢定。質(zhì)量突出體現(xiàn)在安全性和有效性。出體現(xiàn)在安全性和有效性。51三、物理化學(xué)檢定三、物理化學(xué)檢定生物制品的物理化學(xué)檢定包括鑒別、物理性狀生物制品的物理化學(xué)檢定包括鑒別、物理性狀檢查、分子量測定法、蛋白質(zhì)含量測定、防腐檢查、分子量測定法、蛋白質(zhì)含量測定、防腐劑含量測定、純度檢查、安全性檢查、生物制劑含量測定、純度檢查、安全性檢查、生物制品的效力測定等品的效力測定等521.生物制品的鑒別生物

39、制品的鑒別生鑒別方法包括理化方法和生物學(xué)方法生鑒別方法包括理化方法和生物學(xué)方法理化方法：常用的有理化方法：常用的有HPLC法法生物學(xué)方法：依據(jù)生物制品的生物學(xué)特點(diǎn)，生物學(xué)方法：依據(jù)生物制品的生物學(xué)特點(diǎn)，利用免疫學(xué)等方法進(jìn)行真?zhèn)蔚呐袛?，常用的有利用免疫學(xué)等方法進(jìn)行真?zhèn)蔚呐袛?，常用的有免疫印跡法、免疫斑點(diǎn)法、免疫雙擴(kuò)散法、酶免疫印跡法、免疫斑點(diǎn)法、免疫雙擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫法等聯(lián)免疫法等53例例 重組人生長激素的鑒別重組人生長激素的鑒別：在相關(guān)蛋白質(zhì)檢在相關(guān)蛋白質(zhì)檢查項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間查項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間響應(yīng)與相應(yīng)的對照品響應(yīng)與相應(yīng)的對照品(重組人生長激素或

40、甲?；刂亟M人生長激素或甲酰化重組人生長激素對照品組人生長激素對照品)的保留時間一致；的保留時間一致；取對照取對照品溶液和供試品溶液各品溶液和供試品溶液各10 L ，分別注入液相色，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品的肽圖譜應(yīng)與對照品譜儀，記錄色譜圖，供試品的肽圖譜應(yīng)與對照品的肽圖譜一致。的肽圖譜一致。54例例 ChP中中注射用重組人促紅素注射用重組人促紅素(CHO細(xì)胞細(xì)胞)、注射、注射用重組人干擾素用重組人干擾素1b、注射用重組人干擾素、注射用重組人干擾素2a、注射用重組人干擾素注射用重組人干擾素2b、注射用重組人白介素、注射用重組人白介素-2等等33種生物制品均采用種生物制品均采用免疫

41、印跡法免疫印跡法鑒別。該法是鑒別。該法是以供試品與特異性抗體結(jié)合后，抗體再與酶標(biāo)抗以供試品與特異性抗體結(jié)合后，抗體再與酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合，通過酶學(xué)反應(yīng)的顯色，對供試品體特異性結(jié)合，通過酶學(xué)反應(yīng)的顯色，對供試品的抗原特異性進(jìn)行檢查。的抗原特異性進(jìn)行檢查。552.物理性狀檢查物理性狀檢查主要包括外觀、真空度及溶解時間檢查。主要包括外觀、真空度及溶解時間檢查。制品外觀異常往往會涉及制品的安全和效力，一般制品外觀異常往往會涉及制品的安全和效力，一般以澄明度來檢查外觀類型不同的制品。以澄明度來檢查外觀類型不同的制品。真空封口的凍干制品應(yīng)進(jìn)行真空度及溶解時間檢查，真空封口的凍干制品應(yīng)進(jìn)行真空度及溶解時間檢

42、查，通?？捎酶哳l火化真空測定器檢查其真空度，凡有通?？捎酶哳l火化真空測定器檢查其真空度，凡有真空度者瓶內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)紫色輝光。真空度者瓶內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)紫色輝光。563.分子量的測定分子量的測定 通常采用十二烷基硫酸鈉通常采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。多數(shù)蛋白質(zhì)與陰離子表面活性劑電泳法測定。多數(shù)蛋白質(zhì)與陰離子表面活性劑SDS按按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白質(zhì)分子的凈電荷，消除了不同蛋白質(zhì)遠(yuǎn)超過天然蛋白質(zhì)分子的凈電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)，使蛋白質(zhì)按分子大小分離。分子的電荷效應(yīng)，

43、使蛋白質(zhì)按分子大小分離。 有些蛋白如電荷異常的蛋白質(zhì)，用有些蛋白如電荷異常的蛋白質(zhì)，用SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳法測出的分子量不可靠，則可采用胺凝膠電泳法測出的分子量不可靠，則可采用ESI/MS法，該法是生物大分子精確分子量測定的重要工具，法，該法是生物大分子精確分子量測定的重要工具，可以確證蛋白質(zhì)氨基酸序列是否正確，并由此推斷可以確證蛋白質(zhì)氨基酸序列是否正確，并由此推斷DNA序列是否正確。序列是否正確。574.蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定很多生物制品的有效成分是蛋白質(zhì)。類毒素、抗毒很多生物制品的有效成分是蛋白質(zhì)。類毒素、抗毒素、血液制品和基因工程產(chǎn)品等需要測定蛋白質(zhì)含素、血液制品和基

44、因工程產(chǎn)品等需要測定蛋白質(zhì)含量，以檢查其有效成分，計算純度和比活性。量，以檢查其有效成分，計算純度和比活性。ChP采用的測定方法有采用的測定方法有凱氏定氮法、酶試劑法凱氏定氮法、酶試劑法(Lowry法法)和雙縮脲法和雙縮脲法。58凱氏定氮法凱氏定氮法 通過測定供試品通過測定供試品的總氮含量以及經(jīng)鎢酸沉淀法去的總氮含量以及經(jīng)鎢酸沉淀法去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計算出蛋白質(zhì)的含量。氮含量，計算出蛋白質(zhì)的含量。59一般步驟是將一定量的供試品置于凱氏燒瓶中，加一般步驟是將一定量的供試品置于凱氏燒瓶中，加硫酸、硫酸鹽硫酸、硫酸鹽及適當(dāng)?shù)拇呋瘎?，加熱消解，使有機(jī)分及

45、適當(dāng)?shù)拇呋瘎?，加熱消解，使有機(jī)分子破壞分解，將氮完全轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，加氫氧化鈉溶子破壞分解，將氮完全轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，加氫氧化鈉溶液堿化，將游離出的氨蒸餾出來，并由液堿化，將游離出的氨蒸餾出來，并由2硼酸溶液吸硼酸溶液吸收，然后用硫酸滴定液進(jìn)行滴定。收，然后用硫酸滴定液進(jìn)行滴定。 5.純度檢查純度檢查抗毒素、類毒素、血液制品和基因工程產(chǎn)品在制造抗毒素、類毒素、血液制品和基因工程產(chǎn)品在制造中，經(jīng)過精制提純，故要求檢查純度，通常采用電中，經(jīng)過精制提純，故要求檢查純度，通常采用電泳法和高效液相色譜法檢查。泳法和高效液相色譜法檢查。例：例：ChP收載人用單克隆抗體的純度測定采用還原收載人用單克隆抗體的純度測

46、定采用還原和非還原條件和非還原條件SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法，掃描后聚丙烯酰胺凝膠電泳法，掃描后免疫球蛋白含量應(yīng)達(dá)到免疫球蛋白含量應(yīng)達(dá)到95%以上，二聚體以上，二聚體10%。ChP收載的人血白蛋白多聚體、人免疫球蛋白類制收載的人血白蛋白多聚體、人免疫球蛋白類制品品IgG單體加二聚體的測定采用分子排阻色譜法。單體加二聚體的測定采用分子排阻色譜法。60四、安全性檢定四、安全性檢定生物制品的安全檢定有一般安全檢查；殺菌、生物制品的安全檢定有一般安全檢查；殺菌、滅活和脫毒情況的檢查；外源性污染物檢查和滅活和脫毒情況的檢查；外源性污染物檢查和過敏性物質(zhì)檢查。過敏性物質(zhì)檢查。611. 一般安全檢查包括無菌

47、試驗、熱原試驗等。一般安全檢查包括無菌試驗、熱原試驗等。2. 疫苗和類毒素制品的菌毒種多為致病性強(qiáng)疫苗和類毒素制品的菌毒種多為致病性強(qiáng)的微生物，如未被殺死或解毒不完全，在生物的微生物，如未被殺死或解毒不完全，在生物制品的使用中就會發(fā)生嚴(yán)重事故，因此需要進(jìn)制品的使用中就會發(fā)生嚴(yán)重事故，因此需要進(jìn)行活毒檢查、解毒試驗和殘余毒力試驗。行活毒檢查、解毒試驗和殘余毒力試驗。 623. 抗毒素是采用異種蛋白為原料所制成，因此抗毒素是采用異種蛋白為原料所制成，因此需要檢查過敏原是否符合限度要求。需要檢查過敏原是否符合限度要求。4. 外源性污染物檢查主要有野毒檢查、支原體外源性污染物檢查主要有野毒檢查、支原體

48、檢查、乙肝表面抗原和丙肝抗體檢查、外源檢查、乙肝表面抗原和丙肝抗體檢查、外源DNA測定和殘余宿主細(xì)胞蛋白測定。測定和殘余宿主細(xì)胞蛋白測定。 63宿主細(xì)胞蛋白殘留量的檢查宿主細(xì)胞蛋白殘留量的檢查目的：控制異源蛋白的含量以防超量后引起機(jī)體免目的：控制異源蛋白的含量以防超量后引起機(jī)體免疫反應(yīng)疫反應(yīng)測定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法測定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法ELISAELISA外源性外源性DNADNA殘留量的檢查殘留量的檢查目的：防止外源性目的：防止外源性DNADNA對人類的危害對人類的危害測定法：分子雜交技術(shù)、基于測定法：分子雜交技術(shù)、基于DNADNA結(jié)合蛋白分析系結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)、實(shí)時定量統(tǒng)、實(shí)時定量

49、PCRPCR技術(shù)技術(shù)64例例 重組人干擾素中抗生素殘留量測定重組人干擾素中抗生素殘留量測定 取直徑取直徑8 cm8 cm或或10 cm10 cm的培養(yǎng)皿，注入融化的抗生素的培養(yǎng)皿，注入融化的抗生素號培養(yǎng)基號培養(yǎng)基151520 ml20 ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺上使凝固，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層。取抗生素作為底層。取抗生素號培養(yǎng)基號培養(yǎng)基101015 ml15 ml置于置于1 1支支5050水浴預(yù)熱的試管中，加入水浴預(yù)熱的試管中，加入0.5%0.5%1.5%(ml/ml)1.5%(ml/ml)的菌懸液的菌懸液300 l300 l混勻，取適量注入已鋪制底層的培養(yǎng)

50、皿中，放混勻，取適量注入已鋪制底層的培養(yǎng)皿中，放置水平臺上，冷卻后，在每個培養(yǎng)皿上等距離均勻放置置水平臺上，冷卻后，在每個培養(yǎng)皿上等距離均勻放置鋼管鋼管( (內(nèi)徑內(nèi)徑6 68 mm8 mm、壁厚、壁厚1 12 mm2 mm、管高、管高101015 mm15 mm的不的不銹鋼管，表面應(yīng)光滑平整銹鋼管，表面應(yīng)光滑平整) )，于鋼管中依次滴加供試品，于鋼管中依次滴加供試品溶液、陰性對照溶液溶液、陰性對照溶液( (磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液) )及對照品溶液。培及對照品溶液。培養(yǎng)皿置養(yǎng)皿置3737培養(yǎng)培養(yǎng)181822h22h。結(jié)果判定對照品溶液有抑菌圈，陰性對照溶液無抑菌圈。結(jié)果判定對照品溶液有抑菌圈，

51、陰性對照溶液無抑菌圈。供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照品溶液抑菌圈的直徑供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照品溶液抑菌圈的直徑時判為陰性；否則判為陽性。時判為陰性；否則判為陽性。65五、生物學(xué)活性檢定五、生物學(xué)活性檢定生物活性測定是利用生物體來測定檢品的生物活性或效價的生物活性測定是利用生物體來測定檢品的生物活性或效價的方法，它以生物體對檢品的生物活性反應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)方法，它以生物體對檢品的生物活性反應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗設(shè)計，通過比較檢品與相應(yīng)的標(biāo)計為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗設(shè)計，通過比較檢品與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品在一定條件下所產(chǎn)生的特定生物反應(yīng)的劑量間的差異，準(zhǔn)品在一定條件下所產(chǎn)生的特

52、定生物反應(yīng)的劑量間的差異，來測定檢品的效價。來測定檢品的效價。66 生物活性測定主要有動物保護(hù)力試驗、活疫苗的效生物活性測定主要有動物保護(hù)力試驗、活疫苗的效力測定、抗毒素和類毒素的單位測定、免疫學(xué)活性力測定、抗毒素和類毒素的單位測定、免疫學(xué)活性測定、蛋白質(zhì)藥物的比活度測定等。測定、蛋白質(zhì)藥物的比活度測定等。 常用的檢測定量方法有酶法、電泳法、理化測定法常用的檢測定量方法有酶法、電泳法、理化測定法和生物檢定法。和生物檢定法。67例例 干擾素生物學(xué)活性測定法干擾素生物學(xué)活性測定法 本法系依據(jù)干擾素本法系依據(jù)干擾素可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞(WISH)免受水泡性口炎病毒免受水泡性口炎病毒(VSV)破壞的作用，用結(jié)晶紫對存活的破壞的作用，用結(jié)晶紫對存活的WISH細(xì)胞染細(xì)胞染色，在波長色，在波長570 nm處測定其吸光度，可得到干擾素處測定其吸光度，可得到干擾素對對WISH細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線，以此測定干擾素生物細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線，以此測定干擾素生物學(xué)活性。學(xué)活性。68v請?zhí)釂栴}