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離子交換柱層析法分離氨基酸 指導(dǎo)老師 肖靚小老師 田春麗 李潔茜 一 實驗?zāi)康暮鸵?1 學(xué)習(xí)采用離子交換柱層析法分離氨基酸的原理和方法 2 掌握離子交換柱層析法的基本操作技術(shù) 包括樹脂的裝柱加樣 洗脫 檢查等 二 實驗原理 離子交換樹脂是具有酸性或堿性的合成聚苯乙烯 苯乙二烯不溶性高分子化合物 各種氨基酸分子的結(jié)構(gòu)不同從而導(dǎo)致pI點不同 各種氨基酸在同一pH時帶有不同的電荷 與離子交換樹脂的親和力有差異 因此可依親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來 達(dá)到分離的效果 樹脂對離子的親和力 與水合離子半徑 電荷及離子的極化程度有關(guān) 水合離子半徑愈小 電荷愈高 極化程度愈大 則它的親和力愈大 其中靜電力起主要作用 在ph 5 8的緩沖液中 在陽離子柱中氨基酸洗出的大體順序為酸性 中性 堿性 本試驗所用氨基酸中 Asp 天冬氨酸 是酸性氨基酸 pI 2 97 Lys 賴氨酸 是堿性氨基酸 pI 9 74 茚三酮跟蛋白質(zhì)或者多肽在加熱條件下發(fā)生紫色反應(yīng) 三 實驗試劑 1 732陽離子交換樹脂2 2mol L鹽酸溶液 3 2mol L氫氧化鈉溶液 4 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液 天冬氨酸2mg mL 賴氨酸均配制成4mg mL的0 1mol L鹽酸溶液 5 混合氨基酸溶液 將上述天冬氨酸 賴氨酸各溶液按1 3的比例混合 6 兩種檬酸鈉 氧氧化鈉 鹽酸緩沖液 pH5 8 鈉離子濃度0 45mol L的緩沖液和鈉離子濃度為0 90mol L的緩沖液 取檸檬酸14 25g 氫氫化鈉9 3g和濃鹽酸5 25mL溶于少量蒸餾水后 定容至500Ml 另一種定容至250mL 冰箱保存 7 顯色劑 稱取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇單甲醚中 加蒸餾水至100mL 8 50 乙醇水溶液 離子交換樹脂轉(zhuǎn)型示意圖 離子交換樹脂分離氨基酸原理示意圖 四 實驗器材 MC99 3自動液相色譜分離層析儀層析管 20cmX1cm 專用試管 50支 水浴鍋鋁制試管架X2分光光度計玻璃棒移液管洗瓶硅膠管 五 實驗步驟 1 樹脂的準(zhǔn)備 將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na 型后洗至中性待用 方法如下 將干的強酸型離子交換樹脂用蒸餾水浸過夜或攪拌2小時 使其充分溶脹 傾去細(xì)小顆粒 再用4倍體積的2mol L的鹽酸浸泡一小時 樹脂換為氫型 傾去清液 洗至中性 再用2mol L的氫氧化鈉溶液做同樣處理 樹脂換為鈉型 洗至中性待用 2 連接裝置梯度混合器 恒流泵 層析管 部分收集器 3 裝柱干凈的燒杯內(nèi)裝入大約20mL樹脂和10mL蒸餾水 將層析管用層析管架固定在鐵架臺上適當(dāng)高度 一個同學(xué)一手手執(zhí)燒杯 一手用玻璃棒快速在杯口攪動樹脂 使樹脂緩慢均勻的流入層析管 另一個同學(xué)控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度注意 1 裝柱過程不可中斷 倒樹脂要緩慢均勻2 剛開始倒樹脂時 水流出速度要控制到很小 同時可以適當(dāng)多加點水 最后一段加水和放水都要慢 裝柱過程中水面一定不能低于樹脂 但也不能溢出 倒好的層析管端面平整 無氣泡 約18cm高 4 平衡 將層析管與恒流泵聯(lián)接 從燒杯中吸取pH 5 8鈉離子強度為0 45的檸檬酸緩沖液平衡層析柱 流出液達(dá)床體積的四倍以上時 用pH試紙測流出的液體的pH 直到和緩沖液的pH一樣時 即試管內(nèi)的pH和緩沖液一樣 即可上樣 在平衡同時進行調(diào)速 調(diào)節(jié)恒流泵流速 定時收集流出液并測量流出液的體積 根據(jù)流出液體積與所需時間計算其流速 反復(fù)調(diào)整測量直到流速約為1mL min 5 加樣 平衡好后 停止加入緩沖溶液 待緩沖溶液彎月面靠近樹脂頂端時 關(guān)閉下端開口 加入0 5mL左右混合氨基酸溶液 待樣品彎月面靠近樹脂頂端時 立即用少量濃度為 0 45mol L 的檸檬酸緩沖溶液沖洗層析管內(nèi)壁數(shù)次 再加入緩沖液約3 4厘米左右 加樣時應(yīng)避免沖破樹脂表面 且避免將樣品全部加在某一局限部位 注意 平衡 加樣 洗脫時都不能沖破樹脂表面 加樣示意圖 6 洗脫并收集 將體積均70mL 建議適量多加 離子強度為0 45與0 9的兩種緩沖溶液分別加入到梯度混合器的兩個燒杯中 其中0 45的加入到直接輸出溶液的那個池 如圖將層析管與恒流泵 恒流泵與梯度混合器聯(lián)接 同時開始用部分收集器開始收集洗脫液 1 5ml 管 50 注意 設(shè)置首管為1 若有50支管 建議末管號設(shè)置為51 7 氨基酸的鑒定 向各管收集液中加1 5mL水合茚三酮顯色劑并混勻 加顯色劑規(guī)則為 前10管都加 以后每隔一管加一次 但當(dāng)出現(xiàn)顯色時 周圍幾管都加 在沸水浴中準(zhǔn)確加熱15min后冷卻至室溫 再在加過顯色劑的試管中加1 5mL的50 乙醇溶液 放置10min 以收集液第二管為空白 對加過顯色劑和乙醇的試管進行光波吸收測定 測定570nm波長的光吸收值 以光吸收值為縱坐標(biāo) 以洗脫體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線 注意 1 試管太多 建議大家進行水浴時使用鋁制試管架或100mL燒杯水浴 使用橡皮筋綁試管時一捆不要太多 否則中間的管容易脫出摔裂 水浴鍋內(nèi)水面剛好沒過試管架中層即可 水浴完成后用鑷子和抹布把試管架拿出來 2 應(yīng)避免用手直接接觸茚三酮 六 思考題 1 為什么要使樣品緩慢的進入層析柱的樹脂 2 為什么要使用梯度緩沖液來洗脫 為什么0 45的緩沖液加入到A池中 3 三次加入緩沖液的作用分別是什么 平衡 加樣 洗脫 4 試設(shè)計利用離子交換劑分離一種含等電點分別為4 0 6 0 7 5和9 0的蛋白質(zhì)混合液的方案 并簡述理由 預(yù)祝大家實驗成功