本科課件發(fā)酵工程,本科課件,發(fā)酵工程,本科,課件,發(fā)酵,工程 發(fā)發(fā) 酵酵 工工 程程Fermentation Engineering 1主講人簡介劉萍：發(fā)酵工程專業(yè)博士，研究方向為生物制藥，主講課程發(fā)酵工程、生物制藥概論、生物工藝學(xué)，參講課程細胞工程、生物學(xué)基礎(chǔ)、生物工程概論、發(fā)酵工程專題等發(fā)酵工程被評為校級精品課程和北京市精品課程建設(shè)課程聯(lián)系方式：7671、7697(6273)2需要注意的問題 認識發(fā)酵工程的重要性認識發(fā)酵工程的重要性 如何學(xué)習(xí)這門課如何學(xué)習(xí)這門課 如何去看書如何去看書 重視科技文獻重視科技文獻 尤其要重視實驗課尤其要重視實驗課 有關(guān)考試有關(guān)考試3教材及主要參考書教材：教材：生物工藝學(xué)生物工藝學(xué) 俞俊棠主編俞俊棠主編 華東理工大學(xué)出版社，華東理工大學(xué)出版社，1991.參考書：參考書：1.曹軍衛(wèi)曹軍衛(wèi),馬輝文馬輝文.微生物工程微生物工程.科學(xué)出版社，科學(xué)出版社，2002.2.P.F.斯坦伯里斯坦伯里,A 惠特克惠特克.發(fā)酵工藝學(xué)原理發(fā)酵工藝學(xué)原理.中國醫(yī)藥科中國醫(yī)藥科技出版社技出版社.1992.3.賀小賢賀小賢.生物工藝原理生物工藝原理.化學(xué)工業(yè)出版社化學(xué)工業(yè)出版社.2003.4.尹光琳尹光琳,戰(zhàn)立克戰(zhàn)立克,趙根楠趙根楠.發(fā)酵工業(yè)全書發(fā)酵工業(yè)全書.中國醫(yī)藥科技出中國醫(yī)藥科技出版社版社.1992.4主要介紹內(nèi)容第一章緒論（2學(xué)時）本章要點：掌握發(fā)酵工程的基本知識；了解發(fā)酵工程的一般工藝過程和工藝發(fā)展趨勢。5第二章工業(yè)微生物菌種的選育與保藏（4學(xué)時）1、工業(yè)菌種篩選2、培養(yǎng)分離3、工業(yè)菌種的育種方針4、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)6第三章發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化（4學(xué)時）1、培養(yǎng)基2、菌種生長條件3、種子擴大培養(yǎng)7第四章發(fā)酵機制（4學(xué)時）第一節(jié)微生物代謝機理第二節(jié)微生物的代謝調(diào)節(jié)調(diào)控與發(fā)酵生產(chǎn)8第五章發(fā)酵工程動力學(xué)（4學(xué)時）第一節(jié)微生物反應(yīng)過程概論第二節(jié)微生物發(fā)酵動力學(xué)分類第三節(jié)工業(yè)微生物培養(yǎng)方法9第六章發(fā)酵工藝控制（4學(xué)時）第一節(jié)滅菌及空氣除菌第二節(jié)氧的供給第三節(jié)發(fā)酵單元操作10第七章發(fā)酵生產(chǎn)的設(shè)備（6學(xué)時）第一節(jié)介紹常用發(fā)酵罐的組成、工作原理及操作、控制第二節(jié)發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計和自動控制11第九章發(fā)酵工程各論12學(xué)時第一節(jié)氨基酸生產(chǎn)工藝學(xué)2第二節(jié)抗生素生產(chǎn)工藝學(xué)2第三節(jié)微生物酶制劑生產(chǎn)工藝2第四節(jié)污水生化處理技術(shù)2第五節(jié)甾體激素的微生物轉(zhuǎn)化工藝2第六節(jié)活性物質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)212發(fā)酵工程實驗發(fā)酵工程實驗 16學(xué)時學(xué)時1、特定產(chǎn)物工業(yè)生產(chǎn)菌種的篩選4學(xué)時2、搖床培養(yǎng)確定菌體培養(yǎng)和營養(yǎng)條件4學(xué)時3、小型發(fā)酵罐中進行產(chǎn)品的分批發(fā)酵4學(xué)時4、流加發(fā)酵動力學(xué)研究4學(xué)時13第一章緒論第一節(jié) 發(fā)酵的定義及應(yīng)用范圍第二節(jié) 發(fā)酵工程組成及研究內(nèi)容第三節(jié) 發(fā)酵工業(yè)第四節(jié) 發(fā)酵方法的類別與流程第五節(jié) 我國發(fā)酵工業(yè)的科技進步14提問：什么是發(fā)酵15微生物發(fā)酵技術(shù) 1857年法國化學(xué)家、微生物家巴斯德提出了著名的發(fā)酵理論：“一切發(fā)酵過程都是微生物作用的結(jié)果?！卑退沟抡J為，釀酒是發(fā)酵，是微生物在起作用；酒變質(zhì)也是發(fā)酵，是另一類微生物在作祟；隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以用加熱處理等方法來殺死有害的微生物，防止酒發(fā)生質(zhì)變。同時，也可以把發(fā)酵的微生物分離出來，通過人工培養(yǎng)，根據(jù)不同的要求去誘發(fā)各種類型的發(fā)酵，獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。16一、發(fā)酵的定義1 1、傳統(tǒng)發(fā)酵、傳統(tǒng)發(fā)酵2 2、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵3 3、工業(yè)上的發(fā)酵、工業(yè)上的發(fā)酵171、傳統(tǒng)發(fā)酵最初發(fā)酵是用來描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒的生產(chǎn)過程。182、生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵指微生物在無氧條件下，分解各種有機物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴格地說，發(fā)酵是以有機物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出CO2。193、工業(yè)上的發(fā)酵泛指利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程 包括：1.厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。2.通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。產(chǎn)品有細胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細胞、酶等。20提問：發(fā)酵工程的應(yīng)用領(lǐng)域21發(fā)酵工程應(yīng)用范圍食品工程酶工業(yè)氨基酸工業(yè)有機酸工業(yè)飼料工業(yè)新材料開發(fā)生物化工環(huán)境保護22在食品工業(yè)中的應(yīng)用這是生物技術(shù)最早開發(fā)應(yīng)用的領(lǐng)域，含醇飲料：以果汁、米、麥、高梁、玉米、土豆等為主要原料釀造或經(jīng)加工的有葡萄酒、果酒、黃酒、白酒、啤酒、白蘭地、威士忌、伏特加、金酒、香檳酒、朗姆酒等傳統(tǒng)調(diào)味品及發(fā)酵食品：以豆類、米、麥等生產(chǎn)的醬、醬油、醋、豆豉、豆腐乳、泡菜等。發(fā)酵乳制品：奶酒、干酪、酸奶等23飲料酒類產(chǎn)量大、產(chǎn)值高、影響面廣，許多國家利用生物工程的技術(shù)改革舊工藝已取得明顯效果，收到顯著的經(jīng)濟效益。24用近代發(fā)酵或酶反應(yīng)技術(shù)生產(chǎn)的食品原料：葡萄糖、麥芽糖、果葡糖漿、甘露糖醇、脂肪等食品添加劑：面包酵母、味精(谷氨酸單納)、賴氨酸、檸檬酸、紅曲(色素)、甜味肽、肌苷酸和鳥苷酸(均為增鮮劑)、右旋糖酐葡聚糖和茁霉多糖(均為增稠劑)、葡萄糖氧化酶和異維生素C(均為食品保鮮劑)、乳鏈菌肽(食用防腐劉)。新型發(fā)酵飲料活性乳酸飲料。25微生物與飲食、調(diào)味品微生物與飲食、調(diào)味品青紅方醬，醬油，豆食用醋發(fā)酵飲料味精發(fā)酵面食食用藥用菌食用色素食品添加劑淹漬蔬菜Cncnc-micro26發(fā)酵食品市場主要原料：橄欖、卷心菜和腌黃瓜。1999年韓國國內(nèi)泡菜市場產(chǎn)值約為16.7億美元。1998年日本泡菜生產(chǎn)量達18萬噸，市場為13億美元，在國際市場上日韓兩國占據(jù)了95%以上的份額。2000年，中國泡菜工業(yè)的市場銷售額約為10億元，中國泡菜的代表之一-四川泡菜企業(yè)出口總額約500萬美元，僅占國際泡菜市場總量的3%。27A各種抗生素：抗細菌，抗真菌，抗原蟲，抗腫瘤天然、合成、半合成B、各種氨基酸：在醫(yī)藥中主要用于生產(chǎn)氨基酸輸液可用發(fā)酵獲得或用酶法獲得C、維生素：D、甾體激素3.2生物技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用28E、生物制品：生于預(yù)防、診斷或治療傳染病F、單克隆抗體、抗體與抗原具有高度親和性，用于制備診斷盒、治療疾病或作為生物導(dǎo)彈藥物的運載工具。純化抗原類物質(zhì)，菌種鑒別。G、其它：治療用酶、酶抑制劑、核苷酸制品、制藥工業(yè)用酶、工業(yè)發(fā)酵藥物3.2生物技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用29抗生素：目前世界各國可用發(fā)酵法生產(chǎn)的抗生素約400種，其中廣泛應(yīng)用的大約120種。l980年世界總產(chǎn)量約為25000噸。僅青、四、紅和頭孢四類抗生素的產(chǎn)值就達42億美元，最大的發(fā)酵罐為400立方米。進入90年代后，全球生產(chǎn)與銷售的各類抗生素原料藥平均每年約在3萬噸以上，總價值約為250一300億美元，1992一1993年度實際增長率為4%。美國抗感染藥物市場銷售額1992年達60.71美元。生物技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)藥市場30維生素發(fā)酵生產(chǎn)的維生素，1982年世界產(chǎn)量為6萬噸左右，六種維生累的總銷額為6.7億美元。在19691980年間，每年銷售量遞增10，19811991年間仍以7一8的速率遞增。目前，全球范圍內(nèi)使用最為普遍的是VA、VC和VE，三都每年市場銷售額近20億美元，其中VE超過10億美元，其余為VB族，每個品種都有0.5-1.5億美元的市值。在各種用途中，維生素作為動物飼料的市場正以每年2-3速度增長，在藥用和食品領(lǐng)域都以4-5的速度增長。31甾體激素目前世界市場的年銷售額為67億元，今后仍將以610的速率遞增。最近正在興起用固定化細胞進行甾體轉(zhuǎn)化，將是一個有發(fā)展前途的新工藝，目前國際上正在研究中的除干擾素以外、還有口蹄疫疫苗，狂犬病疫苗等十余種。今后幾年內(nèi)，在重組DNA的工作逐步深入當中，定會對人類和牲畜健康引起實質(zhì)性的改善。32糖酶：a-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶、支鏈淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、半乳糖酶、纖維素酶。蛋白酶：堿性、酸性、中性蛋白酶果膠酶脂肪酶凝乳酶過氧化氫酶。3、生物技術(shù)應(yīng)用于輕工、食品用酶的生產(chǎn)334、生物技術(shù)應(yīng)用于化工能源產(chǎn)品的生產(chǎn)利用發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化或酶法生產(chǎn)：烷烴、醇及溶劑、有機酸、多糖等據(jù)預(yù)測，2000年酒精發(fā)酵原料主要是纖維素、木質(zhì)質(zhì)等，并大量用于燃料消耗。美國計劃在90年代能源結(jié)構(gòu)中，煤和石油將從目前的95下降到50，酒精將在新能源中占重要地位。34酵母生產(chǎn)燃料乙醇35沼氣在利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的有機物廢料，將它們發(fā)酵制取燃料(沼氣)氣體方面，美國計劃解決全國能源需要量的10，工業(yè)有機廢水(渣)的利用在西歐轉(zhuǎn)向甲烷發(fā)酵，英、美、德、日、俄都已建成了許多大型沼氣發(fā)酵廠，如倫敦，每年可回收沼氣8800萬立方米。氫能生物柴油365、飼料工業(yè)方面隨著世界人口的不斷增加，人民生活的逐步提高可耕地的日益減少，動、植物蛋白的來源受到了限制，高質(zhì)量蛋白質(zhì)的不足已經(jīng)成為一個十分突出的問題。微生物菌體中，蛋白質(zhì)含量占4555(干物質(zhì))、所以用發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)單細胞蛋白是食品和飼料蛋白質(zhì)的重要來源。37另外，藻類蛋白飼料也不可忽視，如前西德培養(yǎng)的珊列藻，每年每公頃所得蛋白比小麥多20一35倍。Cncnc-micro38 一個 20 米直徑的水池年產(chǎn) 4 噸藻類，加工后可得相當于3000 升柴油的燃料。一英畝三角大戟可生產(chǎn)相當于 50 噸石油的燃料。圖為生長在淡水和海水中的一種硅藻396、冶金工業(yè)方面細菌浸礦，即利用細菌的直接和間接作用對礦物或礦石中有用的金屬浸出回收的過程。細菌浸出的金屬也涉及到Cu、U、Co、Ni、Mn、Zn、Pb等10余種，但大規(guī)模生產(chǎn)的只有銅和鈾(批量)。目前，美、英、日、俄、澳、加加拿大等許多國家都在積極開展此項研究和生產(chǎn)。美國用這種辦法得到的銅占銅產(chǎn)量的10以上，加拿大用細菌浸出的鈾(U308)年產(chǎn)量達230噸。據(jù)世界20個礦山資料表明，每年用細菌浸出約銅達20萬噸。40抗病、殺蟲抗生素單細胞蛋白食用和藥用真菌生物農(nóng)藥生物肥料7、生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用41什么是有機食品42微生物在對生物物質(zhì)的排泄物及尸體的分解起著重要的作用。嫌氣發(fā)酵法：指在嫌氣情況下利用分解碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的微生物，將有機廢棄物分解為可溶性物質(zhì)，進而通過產(chǎn)酸菌和甲烷細菌的作用再分解為甲烷和CO2。好氣發(fā)酵（活性污泥）法：指在曝氣情況下，用某些能降解有機物質(zhì)的產(chǎn)菌膠的細菌和某些原蟲的混合物(活性污泥)對工業(yè)或生活污水進行處理。8、生物技術(shù)在環(huán)境保護中的應(yīng)用43在化學(xué)工業(yè)和環(huán)境保護等方面，微生物工程也同樣能發(fā)揮獨持的作用，如：與化學(xué)法相結(jié)合，選育相應(yīng)的優(yōu)良菌種，以乙烯和丙烯腈為原料，分別生產(chǎn)環(huán)氧乙烷、乙二醇等，利用微生物來處理工業(yè)廢水或含毒廢液，乃至構(gòu)建超級細菌，處理大面積的海面石油污染等。44噴灑工程菌清除石油污染45微生物與環(huán)保微生物處理腈綸廢水的塔式濾池46479、生物技術(shù)應(yīng)用于高技術(shù)研究開發(fā)基因工程中酶、DNA探針等醫(yī)藥中診斷用酶48第二節(jié)發(fā)酵工程組成及研究內(nèi)容49發(fā)酵工程定義發(fā)酵工程是滲透有工程學(xué)的微生物學(xué)。是利用微生物的特定性狀，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)產(chǎn)生有用物質(zhì)或直接應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)、以把糧食、能源、化學(xué)制品、環(huán)境控制等全球性課題聯(lián)系起來的一種技術(shù)體系。是將傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)與DNA重組、細胞融合、分子修飾和改造等新技術(shù)結(jié)合并發(fā)展起來的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)。50利用微生物的特點發(fā)酵工程所利用的微生物主要是細菌、放線菌，酵母菌和霉菌。利用微生物的特點：(1)對周圍環(huán)境的溫度、壓強、滲透壓、酸堿度等條件有極大的適應(yīng)能力。(2)有極強的消化能力。(3)有極強的繁殖能力。51發(fā)酵工程組成從廣義上講，由三部分組成：上游工程、發(fā)酵工程、下游工程52FERMENTATIONProcess ControlFermentation engineering上游工程上游工程UPSTREAM PROCESSES下游工程下游工程DOWNSTREAM PROCESSES53發(fā)酵工程原始材料：包括菌種，培養(yǎng)基的糖類，氮源及某些微量元素；上游過程：(1)對菌種加以改造，提高生產(chǎn)能力或者導(dǎo)入外源基因等以獲得工程菌；(2)發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化，是通過優(yōu)化發(fā)酵條件如溫度、營養(yǎng)、供氣量等。利用工程菌的生物合成，加工和修飾等以獲得目的產(chǎn)物；下游過程：是運用生物化學(xué)、物理學(xué)方法分離、純化產(chǎn)品，最終將產(chǎn)品推向市場并獲得社會或經(jīng)濟效益。54發(fā)酵工程Continuouscentrifuges55發(fā)酵工程研究內(nèi)容主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)(1)有嚴格的無菌生長環(huán)境：包括發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進行滅菌的技術(shù)；在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術(shù)；(2)在發(fā)酵過程中根據(jù)細胞生長要求控制加料速 度的計算機控制技術(shù)；(3)種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。56(4)在進行任何大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵前，必須在實驗 室規(guī)模的小發(fā)酵罐進行大量的實驗，得到產(chǎn)物形成的動力學(xué)模型，并根據(jù)這個模型設(shè)計中試的發(fā)酵要求，最后從中試數(shù)據(jù)再設(shè)計更大規(guī)模生產(chǎn)的動力學(xué)模型。(5)由于生物反應(yīng)的復(fù)雜性，在從實驗室到中試，從中試到大規(guī)模生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)許多問題，這就是發(fā)酵工程工藝放大問題。57第三節(jié)發(fā)酵工業(yè)一、定義 是指利用生物的生命活動產(chǎn)生的酶，無機或有機原料進行酶加工，獲得產(chǎn)品的工業(yè)。58二、發(fā)酵工程的創(chuàng)立天然發(fā)酵階段純培養(yǎng)技術(shù)的建立：巴斯德，科赫等。人為地控制微生物的發(fā)酵進程。微生物的發(fā)酵開始于人類見到微生物前的一段漫長的歷史時期，大約在距今8000年前至公元1676年。最常見的例子就是發(fā)面、天然果酒的釀制、牛乳和乳制品的發(fā)酵以及利用霉菌來治療一些疾病等。其中應(yīng)用水平最高的是中國人在制曲、釀酒方面的偉大創(chuàng)造。59通氣攪拌發(fā)酵技術(shù)的建立：青霉素的生產(chǎn)深層培養(yǎng)代謝控制發(fā)酵技術(shù)：微生物進行甾體化合物的轉(zhuǎn)化，Glu和Lys發(fā)酵生產(chǎn)。對微生物具有高度專一性的酶反應(yīng)作為合成手段的一部分加以利用，進行合理的代謝。60開拓發(fā)酵原料時期：石油發(fā)酵，醋酸生產(chǎn)谷氨酸基因工程階段：人們能夠根據(jù)自己的意愿將微生物以外的基因件導(dǎo)入微生物細胞中，從而達到定向地改變生物性狀與功能創(chuàng)新的物種，使發(fā)酵工業(yè)能夠生產(chǎn)出自然界微生物所不能合成的產(chǎn)物。61四、發(fā)酵工業(yè)的范圍1、以微生物細胞為產(chǎn)物的發(fā)酵工業(yè)2、以微生物代謝產(chǎn)物為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)3、以微生物酶為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)4、生物轉(zhuǎn)化或修飾化合物的發(fā)酵工業(yè)5、微生物廢水處理和其他62微生物產(chǎn)物：微生物細胞，酶，藥物活性物微生物產(chǎn)物：微生物細胞，酶，藥物活性物質(zhì)，特殊化學(xué)物質(zhì)和食品添加劑質(zhì)，特殊化學(xué)物質(zhì)和食品添加劑631、生產(chǎn)微生物細胞物質(zhì)定義：是以獲得具有多種用途的微生物菌體細胞為目的的產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)，包括單細胞的酵母和藻類、擔子菌，生物防治的蘇云金桿菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。特點：細胞的生長與產(chǎn)物積累成平行關(guān)系，生長速率最大時期也是產(chǎn)物合成速率最高階段，生長穩(wěn)定期產(chǎn)量最高。642、微生物酶發(fā)酵酶的特點：易于工業(yè)化生產(chǎn)，便于改善工藝提高產(chǎn)量。分類：胞內(nèi)酶 和胞外酶生物合成特點：需要誘導(dǎo)作用，或遭受阻遏、抑制等調(diào)控作用的影響，在菌種選育、培養(yǎng)基配制以及發(fā)酵條件等方面需給予注意。653、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵包括初級代謝產(chǎn)物、中間代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。對數(shù)生長期形成的產(chǎn)物是細胞自身生長所必需的，稱為初級代謝產(chǎn)物或中間代謝產(chǎn)物。各種次級代謝產(chǎn)物都是在微生物生長緩慢或停止生長時期即穩(wěn)定期所產(chǎn)生的，來自于中間代謝產(chǎn)物和初級代謝產(chǎn)物。664、微生物的生物轉(zhuǎn)化定義：是利用生物細胞對一些化合物某一特定部位（基團）的作用，使它轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相類似但具有更在經(jīng)濟價值的化合物。最終產(chǎn)物是由微生物細胞的酶或酶系對底物某一特定部位進行化學(xué)反應(yīng)而形成的。675、微生物特殊機能的利用利用微生物消除環(huán)境污染利用微生物發(fā)酵保持生態(tài)平衡微生物濕法冶金利用基因工程菌株開拓發(fā)酵工程新領(lǐng)域。68五、發(fā)酵工業(yè)的特征發(fā)酵過程中離不開微生物的作用1、發(fā)酵原料的選擇及預(yù)處理2、微生物菌種的選育及擴大培養(yǎng)3、發(fā)酵設(shè)備選擇及工藝條件控制：常溫、常壓。種子擴大培養(yǎng)和發(fā)酵采用不同的工藝。4、發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取5、發(fā)酵廢物的回收和利用69(1)發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，只要加入少量的有機和無機氮源就可進行反應(yīng)?？梢岳脧U水和廢物等作為發(fā)酵的原料進行生物資源的改造和更新。(2)微生物菌種是進行發(fā)酵的根本因素，通過變異和菌種選育，可以獲得高產(chǎn)的優(yōu)良菌株并使生產(chǎn)設(shè)備得到充分利用，也可以因此獲得按常規(guī)方法難以生產(chǎn)的產(chǎn)品。70(3)發(fā)酵過程一般來說都是在常溫常壓下進行的生物化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)安全，要求條件簡單。(4)發(fā)酵對雜菌的污染的防治至關(guān)重要。反應(yīng)必需在無菌條件下進行。(5)由于生物體本身所具有的反應(yīng)機制，能夠?qū)Ｒ坏睾透叨冗x擇性地對某些較為復(fù)雜的化合物進行特定部位地氧化、還原等化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，也可以產(chǎn)生比較復(fù)雜的高分子化合物。71(6)發(fā)酵過程是通過生物體的自動調(diào)節(jié)方式來完成的，反應(yīng)的專一性強，因而可以得到較為單一的代謝產(chǎn)物。(7)工業(yè)發(fā)酵與其他工業(yè)相比，投資少，見效快，并可以取得較顯著的經(jīng)濟效益。(8)除利用微生物外，還可以用動植物細胞和酶，也可以用人工構(gòu)建的遺傳工程菌進行反應(yīng)。72第四節(jié) 發(fā)酵方法的類別與流程1、類別：根據(jù)對氧的需要區(qū)分：厭氧和有氧發(fā)酵 根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀區(qū)分：液體和固體發(fā)酵 根據(jù)從微生物生長特性區(qū)分：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵732、發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)滅菌產(chǎn)物分離純化成品742.工業(yè)發(fā)酵步驟和工藝流程(1)用作培養(yǎng)菌種及擴大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制。(2)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌。(3)將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中。(4)將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產(chǎn)物。(5)將產(chǎn)物抽提并進行精制，以得到合格的產(chǎn)品。(6)回收或處理發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢物和廢水。75菌種篩選菌種篩選搖瓶試驗搖瓶試驗發(fā)酵罐試驗發(fā)酵罐試驗純種培養(yǎng)純種培養(yǎng)762.1發(fā)酵原料的預(yù)處理原料不同處理方法也有所差異。1.淀粉利用前需變成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高壓、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加熱殺菌和用水沖稀，也可加酸處理后再補充無機鹽。3.碳氫化合物：石油脫蠟一定餾分的石油經(jīng)冷卻脫蠟而獲得的凝固點在-10的油，加入適量無機鹽進行接種發(fā)酵。772.2菌種斜面培養(yǎng)菌種：已有的優(yōu)良生產(chǎn)菌種和選育的新菌種。方法：一般都是由保存于冷凍管及砂土管或冰箱中的斜面菌種開始，在正式使用前要先轉(zhuǎn)接到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化后，再用于種子擴大培養(yǎng)。保存的菌種菌種活化種子擴大培養(yǎng)782.3 種子擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)的方法可以根據(jù)需要采用固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)兩級不同方式。固體種子擴大培養(yǎng)一般采用傳統(tǒng)的制曲工藝，一般先用克氏瓶或茄子瓶進行擴大，再轉(zhuǎn)接到曲盤擴大培養(yǎng)。需氧微生物：將克氏瓶表面培養(yǎng)的菌種接到裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在搖床上振蕩培養(yǎng)。厭氧微生物：將有菌種的試管斜面或克氏瓶轉(zhuǎn)接到三角瓶液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)。克氏瓶和茄子瓶79克氏瓶和茄子瓶搖床培養(yǎng)802.4 微生物發(fā)酵和控制發(fā)酵方式可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。固體發(fā)酵：適合于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝及鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)用來生產(chǎn)比較簡單的產(chǎn)品。液體深層發(fā)酵：適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。影響發(fā)酵的因素很多，如溫度、pH、通風(fēng)、攪拌、罐壓力等等，必須適當?shù)乜刂朴绊懓l(fā)酵的各種條件，掌握發(fā)酵的動態(tài)，并進行雜菌的檢查和產(chǎn)物測定，使整個發(fā)酵過程順利進行。812.5 發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取利用菌體：離心沉淀或板框壓濾法使菌體與醪液分開，也可以用噴霧干燥法直接做成粉劑。酒精發(fā)酵醪蒸餾塔蒸餾；抗菌素及有機酸根據(jù)產(chǎn)物的不同特性，采用離子交換樹脂吸附處理、脫色過濾、減壓濃縮等方法提取精制。獲得的產(chǎn)物都要按照有關(guān)部門制定的國家標準進行質(zhì)量檢驗和性能測定，符合要求后才為合格產(chǎn)品。82第五節(jié)我國發(fā)酵工業(yè)的科技進步在20世紀60年代以前，輕工、食品領(lǐng)域的發(fā)酵工業(yè)主要由釀酒和釀造的產(chǎn)品組成。至今，已形成了一個品種繁多，門類較齊全，具有相當規(guī)模的獨立工業(yè)體系，在國民經(jīng)濟中占有重要地位某些產(chǎn)品如味精、檸檬酸年總產(chǎn)量已躍居世界首位。83今后我國發(fā)酵工業(yè)研究的重點積極采用高新技術(shù)改造和提升現(xiàn)有發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平和開發(fā)新產(chǎn)品，形成新產(chǎn)業(yè)。84應(yīng)加強應(yīng)用基礎(chǔ)理論的研究1要充分意識到自人類基因組圖譜繪制完成后世界進入后基因組時代；轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用是發(fā)展的必然趨勢，要引起足夠重視，除對基因工程的研發(fā)工作本身要加強外，應(yīng)從開展轉(zhuǎn)基因食品安全性的研究入手，參與國際上對轉(zhuǎn)基因食品安全性的鑒定和科學(xué)評價，積極創(chuàng)建造福于人類的新一代發(fā)酵制品。852加強發(fā)酵基礎(chǔ)理論研究，從對微生物的代謝調(diào)控，生長和發(fā)酵動力學(xué)剖析基礎(chǔ)上，創(chuàng)建新的發(fā)酵系統(tǒng)，故應(yīng)積極研究開發(fā)不同類型的發(fā)酵分離耦合系統(tǒng)，達到高產(chǎn)豐收的目的。863要充分認識微生物的多樣性、生物技術(shù)的多學(xué)科性、應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛性，利用先進、實用技術(shù)，加強新資源開發(fā)和已有資源的高值化。現(xiàn)有的發(fā)酵制品原則上仍屬初級產(chǎn)品，商品化的品種單一，應(yīng)用領(lǐng)域狹窄，產(chǎn)值低，應(yīng)進一步深加工，二次開發(fā)，達到更有效地利用資源，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟效益。874瞄準發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的共性技術(shù)、關(guān)鍵技術(shù)進行重點突破，如節(jié)能降耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量、無害化的環(huán)保新工藝新裝備，提升現(xiàn)有企業(yè)的生產(chǎn)水平，使我國輕工、食品領(lǐng)域的發(fā)酵工業(yè)在新世紀實現(xiàn)跨越式的發(fā)展。88利用遺傳工程等先進技術(shù)，人工選育和改良菌種采用發(fā)酵技術(shù)進行高等動動植物細胞培養(yǎng)固定化技術(shù)廣泛應(yīng)用開發(fā)和采用大型節(jié)能高效的發(fā)酵裝置，自動控制將成為發(fā)酵生產(chǎn)控制的主要手段應(yīng)用代謝控制技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸將生物技術(shù)理廣泛地用于環(huán)境工程國際發(fā)酵工程研究方向89三、發(fā)酵工程簡介發(fā)酵工程 簡介應(yīng)用發(fā)酵工程的生產(chǎn)實例發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容發(fā) 酵 工 程的應(yīng)用菌種的選育培養(yǎng)基的配制滅菌擴大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過程和分離提純谷氨酸的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用在食品工業(yè)上的應(yīng)用生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，如啤酒、食醋等生產(chǎn)食品添加劑，如L-蘋果酸解決糧食短缺問題90第二章第二章生產(chǎn)中常用菌種的分離、生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏選育和保藏第一節(jié)第一節(jié)菌種的分離篩選菌種的分離篩選第二節(jié)第二節(jié)培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離第三節(jié)第三節(jié)工業(yè)微生物育種工業(yè)微生物育種第四節(jié)第四節(jié)菌種的保藏及活化菌種的保藏及活化帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置顯微觀察裝置第一節(jié)第一節(jié)菌種的分離簡介菌種的分離簡介一、菌種的來源一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、分離思路二、分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。定定方方案案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：采樣：有針對性地采集樣品。增增殖殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)發(fā)酵酵性性能能測測定定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟三、新種分離與篩選的步驟菌種篩選主要步驟調(diào)查研究及查閱充分的資料設(shè)計實驗方案確定采集樣品的生態(tài)環(huán)境采樣確定特定的增殖條件增殖培養(yǎng)確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的定性或半定量快速檢出法平板分離分離原種斜面確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)條件篩選初篩（1株1瓶）復(fù)篩（1株35瓶）結(jié)合初步工藝條件摸索再復(fù)篩（1株35瓶）35株單株純種分離分離生產(chǎn)性能試驗毒性試驗菌種鑒定（一）采樣一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng)為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋1.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法2.平皿劃線分離法a.連續(xù)劃線分離法b.分區(qū)劃線分離法（四）篩（四）篩選選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第二節(jié)第二節(jié)培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng)。因此，建立一更為科學(xué)的和針對性不強的分離方法是必要的。一、成功的分離培養(yǎng)方法一、成功的分離培養(yǎng)方法(1)認真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標準；(3)將生態(tài)學(xué)方法運用到分離和篩選過程。三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點的一般思路要點1羅列出所要分離的微生物類群；2根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；4羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；5列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；6根據(jù)上述1-5項中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；7用標準方法作對照來評價生態(tài)學(xué)分離方法；8根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；9運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。四、自然界中細菌的分離四、自然界中細菌的分離(一一)采樣和采集方法采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長(二二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50gm1，以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。二、分離分離目的微生物不純，需分離分離純化。采用簡便迅速，有一定準確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應(yīng)法：紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。透明圈透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。抑制圈法：瓊脂塊培養(yǎng)法。用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物抗生素篩選檢定菌培養(yǎng)，加上發(fā)酵液五、放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則五、放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37培養(yǎng)箱中存放3天。放線菌的分離放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。次代培養(yǎng)及純化次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。放線菌菌落形態(tài)六六、真菌分離1、利用低碳氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷徙生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時，真菌子實體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時應(yīng)加以考慮。4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細菌生長及菌落形成。真菌的分離方法真菌的分離方法土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。子實體直接分離培養(yǎng)擔子菌：新采集的子實體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。七、生產(chǎn)選種七、生產(chǎn)選種是在長年累月的生產(chǎn)實踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。第四節(jié)第四節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種：是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。工業(yè)菌種育種的方法工業(yè)菌種育種的方法誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組育種過程育種過程包括下列3個步驟：(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。選擇育種方法時綜合考慮的因素選擇育種方法時綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認識的明了程度；(3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。工業(yè)菌種改良方法工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。(2)增加前體物的濃度。(3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。提高特定基因的表達水平提高特定基因的表達水平(1)引入強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號，可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號，提高基因效力等。(2)誘導(dǎo)解除基因表達抑制的突變。改進菌種的生長效率改進菌種的生長效率提高菌株對底物的利用率方法：a.通過確定并改變代謝中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn)。c.賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法物理、化學(xué)或生物誘變方法一、誘變劑和誘變處理物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性。超凈工作臺小型小型X射線衍射儀射線衍射儀Co60射線機化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。誘變劑的選擇誘變劑的選擇1堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選(一一)出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。5要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。(二二)處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi),加無菌水(三三)誘變處理誘變處理根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。(四四)中間培養(yǎng)中間培養(yǎng)由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。此過程稱為中間培養(yǎng)這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。方法：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。(五五)分離和篩選分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。搖床復(fù)篩降解纖維素產(chǎn)生產(chǎn)透明圈病毒產(chǎn)生產(chǎn)空斑紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在7080%為宜。被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個/ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106107個/ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進行。(二)操作步驟1將細菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。2將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達108個ml左右，作為待處理菌懸液。3取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操作均應(yīng)在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光。4取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。7挑取菌落進行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌N甲 基 N-硝 基-N-亞 硝 基 胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。(二)操作步驟1單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1molLpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個ml，此為待處理孢子懸液。2MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1molLpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。3誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，303天后計數(shù)。4死亡率計算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。5挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選第五節(jié)第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。與篩選營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基基 本 培 養(yǎng) 基（M M，minimalmedium）能滿足某一菌種的野生型或原養(yǎng)型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）在基本培養(yǎng)基中有針對性地補加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型菌株生長需要（其他營營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型仍不能生長）的培養(yǎng)基。完 全 培 養(yǎng) 基（C M，completemedium）可滿足該菌各種營營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型菌株營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜一、誘變方法一、誘變方法物理誘變化學(xué)誘變二、淘汰野生型二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。三、檢出缺陷型三、檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。具體方法：影印法、點種法、夾層法1將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。3將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。(一一)影印法影印法4 將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5二平皿相同方位進行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。(二二)點種法點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。(三三)夾層法夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。生長譜測定的方法生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的56個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。個平皿測一個菌。以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在56個平皿上可測20株菌以上。第六節(jié)第六節(jié) 基因育種基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以一個完整的基因克隆過程包括以下步驟下步驟、獲得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因與載體在體外連接；、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；、篩選、鑒定陽性重組子；、重組子的擴增與或表達。2.2基因重組一、質(zhì)粒的特點一、質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA(CCCDNA)；其次是由于條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的不同表現(xiàn)型不同表現(xiàn)型抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。在自然條件下，許多質(zhì)粒可經(jīng)細菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實驗室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細胞內(nèi)。載體宿主系統(tǒng)載體宿主系統(tǒng)載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA；一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。載體應(yīng)具備以下條件：載體應(yīng)具備以下條件：、能在適當?shù)乃拗骷毎袕?fù)制；、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入；、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。宿主細胞必須符合以下條件宿主細胞必須符合以下條件、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制；、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；、容易導(dǎo)入重組DNA分子；、符合重組DNA操作的安全標準。目的基因的獲取目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA。可去除真核生物基因中不表達的內(nèi)含子。二、化學(xué)合成法制備DNA片段從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。PCRPCR技術(shù)技術(shù)根據(jù)需擴增片段的兩端設(shè)計引物。使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNADNA擴增擴增PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)DNADNA片斷的克隆片斷的克隆載體的條件載體的條件：a 復(fù)制起點 b 適宜的限制酶切點c 選擇標記DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、一、DNADNA連接酶連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5-磷酸和3-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自噬菌體的DNA 連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：、連接具有同源互補粘性末端的片段；、連接雙鏈DNA分子間的平端；、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主菌導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn)一、轉(zhuǎn) 化化指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。二、轉(zhuǎn)染和感染二、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。重組克隆的篩選與鑒定重組克隆的篩選與鑒定基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。一、抗藥性標志的篩選一、抗藥性標志的篩選如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內(nèi)，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。二、二、半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細菌的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸，稱為肽，它表達半乳糖苷酶的C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表達兩個片段時，宿主細胞才有半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的互補。而重組子由于基因插入使肽基因失活，不能形成互補，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。重組重組DNADNA的鑒定的鑒定遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法第七節(jié)第七節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。一、原生質(zhì)體融合育種的特點一、原生質(zhì)體融合育種的特點(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。(四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。(六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。(七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。二、原生質(zhì)體融合育種步驟二、原生質(zhì)體融合育種步驟1標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。2原生質(zhì)體制備。3等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合。4涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。6生產(chǎn)性能篩選。三、原生質(zhì)體融合育種的要點三、原生質(zhì)體融合育種的要點（一）標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。這里最重要的是標記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。(二二)原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。在放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。影響原生質(zhì)體制備的因素影響原生質(zhì)體制備的因素1菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量的青霉素。2菌體的培養(yǎng)時間 為了使細胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3 酶濃度 對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。4酶處理溫度 5破壁時的pH值6滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物。第八節(jié)第八節(jié) 篩選新的代謝產(chǎn)物篩選新的代謝產(chǎn)物一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。(2)對已知微生物的代謝產(chǎn)物進行化學(xué)修飾。(3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。(4)通過原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。(5)DNA重組技術(shù)。二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物的程序的程序突變型菌株的篩選突變型菌株的篩選一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)；篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質(zhì)；研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑；尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物；篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒、長效的化學(xué)藥物等。四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法(一)直接方法為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途，在體外試驗測得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體，觀察被測樣品的療效。這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動物體內(nèi)治療試驗。(二)間接方法 篩選醫(yī)用抗生素，可用細茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質(zhì)。在預(yù)篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。通過預(yù)篩選，直接測定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。五、檢測系統(tǒng)五、檢測系統(tǒng)篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗方法，這樣才能識別出人們需要的化合物。性能簽別性能簽別性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作。鑒別可分為兩方面：一是對微生物方面進行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌的類群；二是從化學(xué)的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產(chǎn)物?；瘜W(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗菌譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進行比較鑒別。薄板層析結(jié)果如果認為是有實用前途的代謝產(chǎn)物，則要進一步大量培養(yǎng)，并進行動物試驗、毒性考查、藥物代謝等實驗，并進行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產(chǎn)。如果是新的代謝產(chǎn)物一般要進一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，井在此基礎(chǔ)上進行合成法的研究或進行化學(xué)改造，研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系，并對作用機制、生物合成過程作進一步的研究。菌種篩選方法菌種篩選方法誘變處理后，突變細胞只占存活細胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細胞又只是突變細胞中的少數(shù)。為了花費最少的工作量，在最短的時間內(nèi)取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學(xué)篩選方案和手段。菌種篩選方案菌種篩選方案初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩的目的是確認符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。菌種篩選的手段菌種篩選的手段初篩從菌體形態(tài)變異分析 平皿快速檢測法具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。特殊變異菌的篩選方法特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。抗性突變菌株的篩選抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來?？剐酝蛔冎甑暮Y選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。一次性篩選法噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。1)恒化器法：常被用于微生物的“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。2)循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。3)誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。