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大豆蛋白的提取及與含量測定 在此處鍵入歡迎信息 長短均可 最好包括本站點的內容簡介 一 目的要求 1 學習掌握離心機 752N 天平的使用方法和注意事項 2 學習掌握大豆蛋白的提取及制備丙酮干粉的原理和方法 3 學習計算蛋白質收率 測定蛋白質含量 二 實驗原理 一 1 大豆蛋白的等電點為4 5 5 0是酸性蛋白 盡管大豆中含有水溶蛋白 鹽溶蛋白 堿溶蛋白和醇溶蛋白 但其主要成分為堿溶蛋白 本實驗為節(jié)省丙酮用量只進行堿提 2 丙酮 有機溶劑 可降低溶液的介電常數 破壞蛋白質的水化膜 故可使蛋白質在一定條件下沉淀析出 調節(jié)蛋白質溶液的pH值到等電點附近 有利于蛋白質的沉淀 三 試劑 材料及儀器 1 0 2 的NaOH 2 6mol L的HCl 3 1mol L的HCl4 化學純級丙酮5 市售大豆粉6 精密pH試紙7 天平8 離心機 普通 9 離心內 外套管10 燒杯11 攪拌棒 四 實驗步驟 提取 稱取3克大豆粉 用0 2 NaOH30毫升 先加入調成糊狀 再用少量多次地慢慢地加入 邊加邊攪拌 NaOH溶液 室溫下攪拌抽提15min 于6000r min離心7min 小心留取上清液 棄脂層和沉淀 如上清液有漂浮物 再經過濾 留出上清液2毫升稀釋50 100倍做含量測定 三 實驗步驟 制干粉 量上清液的體積 加入等體積在冰箱中預冷的丙酮 先用6mol L的HCl調pH至6 0 再用1mol L的HCl小心調pH至4 5 5 0 于4000r min離心15min 留取沉淀物 并用少量丙酮反復 至少兩次 攪拌洗滌 在離心管中進行 加入丙酮后一定將沉淀攪拌充分 加入丙酮目的使沉淀脫水 得到白色粉末狀的大豆蛋白粉 上清液回收 用干凈的濾紙吸干 平鋪在表面皿上 放入40度烘箱干燥 待整個實驗結束后 再稱重并計算產率 Folin酚法測定蛋白質含量 目的要求掌握Folin酚法測定蛋白濃度的原理和方法實驗原理蛋白質濃度可以從它們的物理化學性質 如比重 紫外吸收 折射率等測定而得知 或用化學方法 如定氮 雙縮脲反應 Folin酚試劑反應等方法來計算 其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實驗室中常用的方法 它們操作簡便 迅速 不需要復雜而昂貴的儀器 Folin酚法靈敏度高 比雙縮脲法靈敏100倍 Folin酚法所用試劑是由兩部分組成 試劑甲相當于雙縮脲試劑 可與蛋白質中的肽鏈起顯色反應 試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩(wěn)定 易被酚類還原而呈蘭色 鉬蘭和鎢蘭混合物 由于蛋白質中含有帶酚基的酪氨酸還原呈蘭色 溶液蘭色的深淺與蛋白濃度有較好的線性關系 因此用Folin酚法測定蛋白質含量 靈敏度較高 樣品中含酚類化合物及檸檬酸均有干擾作用 如果樣品酸度較高則顯色較淺 要提高碳酸鈉一氫氧化鈉的濃度 此法也可測定溶液中酪氨酸的色氨酸的濃度 Folin酚法有不少具有操作方法 但基本原理都是一個 只是在各溶液的濃度及填加量上 保溫的溫度及保溫時間上有所不同而已 本實驗所介紹的是本室常用的 靈敏度較高的操作方法 試劑和器材 1 材料 本實驗所提取大豆蛋白水提取液 經合適稀釋至可測定范圍 2 試劑 1 0 03mol LPH7 8的磷酸緩沖液 2 200 g ml的標準酪 牛血清 蛋白溶液 3 Folin試劑甲 俗稱堿性銅試劑 10gNaoH溶于400ml水中 再加50gNa2CO3 稱取0 5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中 再加0 25gCuSO4 以上兩溶液混合定容到500ml 冰箱保存可用一個月 4 Folin試劑乙 在2升磨口回流裝置的燒瓶內 加鎢酸鈉 NaWO4 2H2O 100g 鉬酸鈉 NaMoO 2M2O 25g 蒸餾水700ml 85 的磷酸50ml 濃鹽酸100ml 充分混合后 小火回流10小時 再加硫酸鋰 Li2SO4 150g 蒸餾水50ml及數滴溴 然后開口沸騰15min 以驅除過量的溴 冷卻后定容到1000ml 過濾后呈金黃色 于棕色并中保存 可使用多年 上述制備的Folin試劑乙的貯備液濃度一般在2mol L左右 幾種操作方案都是把Folin試劑乙稀釋至1mol L的酸度作為應用液 我們是把貯備液于作用前稀釋18倍 使之濃度為0 1mol L略高 這種稀釋18倍后的Folin試劑乙就是下文稱之為應用液 Folin試劑乙貯備液濃度的標定 一般是以酚酞為指示劑 用Folin試劑乙去滴定1mol L左右的標準NaOH溶液 當溶液顏色由紅變?yōu)樽匣疑?再突然變成黑綠既為終點 如果用NaOH去滴定Folin乙 終點不太好掌握 溶液的顏色是由淺黃色變?yōu)闇\綠色 再變?yōu)榛易仙珵榻K點 3 器材 試管10支試管架一個移液管 5ml 1ml 移液管架洗瓶恒溫水浴752N型分光光度計 操作方法 標準曲線的制作 標準酪蛋白溶液 用0 03mol L的磷酸緩沖液溶解的酪蛋白 濃度為200 g ml 用一支0 5ml移液管分別取上述標準酪蛋溶液0ml 0 1ml 0 2ml 0 4ml 0 6ml 0 8ml 1 0ml各加到一支試管中去 將此吸管用0 03mol LPH7 8的磷酸緩沖液 反復洗凈 再用同一支移液管 防止未經標定吸量管的相對誤差的影響 取上述緩沖液將每支試管中的溶液補加至1ml 再在另一支試管中加入1ml緩沖液作空白對照 于上述試管中各加入1mlFolin試劑甲并不時地進行振蕩 10min后再加入后1in試劑乙的應用液4毫升 立既搖勻放入55 水溶中保濕5min 取出后用自來水冷卻1min 于波長650nm進行比色測定各管的OD值 以蛋白質的濃度為橫坐標 OD值為縱坐標 既可得到標準曲線 Folin 酚法測定蛋白質含量工作曲線的制作 取7支試管 干燥的 按下表順序分別加入各種試劑并進行反應和測定 2 樣品測定 取兩支試管 平行 各加入待測的蛋白質樣品液1ml 不加buffer 其他操作同工作曲線 可取兩支試管編號8 9 與工作曲線同時進行反應和比色測定 蛋白質濃度的計算 A650值對應的mg數 Pr Pr mg ml 稀釋倍數Pr溶液的ml數 思考題1 采用Folin的酚法測定樣品的蛋白質含量時 樣品中的什么物質對測定結果有干擾 2 作為標準蛋白的酪蛋白在應用時有何要求 五 注意事項 一 使用離心機的方法及注意事項 離心機的工作原理是 在離心力場的作用下 可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度 從而將不同的物質分離 離心機是生化實驗中經常用于提取 分離 純化的常用設備 其操作中的關鍵環(huán)節(jié)是平衡 具體的使用方法及注意事項如下 由在各室上課的教師結合本室離心機進行現場指導 五 注意事項 離心機使用注意 1 檢查離心內 外套管應完整不漏 洗凈離心管 2 待離心的物質裝入離心管的量不應超過離心內套管體積的2 3 3 將一對離心管 含內 外套管 放在臺秤上平衡 可調節(jié)離心管內容物的量 也可在內 外管間加水緩沖平衡 4 檢查離心機可正常工作后 將一對平衡好的離心管按對稱的位置放在離心機中 5 蓋好離心機蓋 打開電源開關 慢慢撥動變速旋鈕 從0開始 使速度逐漸增加 記時 離心結束后 一定先將變速旋鈕慢慢撥到0位 再關電源 待離心機停止運轉后 再打開離心機蓋 取出離心管 不許用手強行使離心機停止轉動 6 用完后 將內外套管洗凈 倒立放置 使其干燥 并在使用的登記薄簽名 7 使用過程中 如出現故障 一定請本室的實驗員排除 不許擅自處理 制丙酮干粉時的注意事項 加入丙酮及加酸調pH時 都要邊加邊攪丙酮一定要遠離明火調pH時 不許調過頭 制丙酮干粉 要少量多次加入丙酮后 將沉淀充分攪起