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歡迎進入生物課堂 基因工程的基本操作程序 專題 基因工程 基因工程的基本操作程序主要包括四個基本步驟 1 目的基因的獲取2 基因表達載體的構(gòu)建3 將目的基因?qū)胧荏w細胞4 目的基因的檢測與鑒定 步驟一 目的基因的獲取 目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因 獲取目的基因是實施基因工程的第一步 如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因 還有植物的抗病 抗病毒 抗細菌 基因 種子貯藏蛋白的基因 以及人的胰島素基因 干擾素基因等 目的基因的提取方法 直接分離基因人工合成基因 反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 鳥槍法 1 鳥槍法 散彈射擊法 用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段 將這些片段分別載入運載體 然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞 讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制 即擴增 從中找出含有目的基因的細胞 再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來 1 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 目的基因的mRNA 單鏈DNA cDNA 雙鏈DNA 即目的基因 反轉(zhuǎn)錄 合成 2 人工合成基因法 2 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列 推測出相應的信使RNA序列 然后按照堿基互補配對原則 推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 再通過化學方法 以單核苷酸為原料合成目的基因 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學合成 上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點 操作簡便廣泛使用 工作量大 盲目 分離出來的有時并非一個基因 專一性強 操作過程麻煩 mRNA很不穩(wěn)定 要求的技術(shù)條件較高 專一性最強 僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因 哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù) 1 DNA序列自動測序儀 2 PCR技術(shù) 對提取出來的基因進行核苷酸序列分析 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 3 從基因文庫中獲取目的基因 基因文庫 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段 導入受體菌的群體中儲存 各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因 稱為基因文庫 genelibrary 基因組文庫 基因文庫中包含了一種生物所有的基因 這種基因文庫叫做基因組文庫 部分基因文庫 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因 這種基因文庫叫做部分基因文庫 用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個個片段 然后將這些片段隨機地連接在某些質(zhì)粒或其他載體上 再將它們轉(zhuǎn)移到適當?shù)乃拗骷毎?通過細胞的增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系 克隆 當這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時 這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫 這一定義也適用于線粒體DNA和葉綠體DNA 分別稱為某種生物的線粒體基因文庫或葉綠體基因文庫 為了有效地保存基因文庫 可通過細菌在固體培養(yǎng)基上繁殖而使包含各個特定DNA片段的細菌增多 通過分子雜交的方法 可以篩選出包含有所需基因的DNA片段的細菌 或噬菌體 經(jīng)過擴增得到大量這樣的細菌 或噬菌體 從中便可分離出所需基因的DNA片段 建立和使用基因文庫是分離高等真核生物基因的有效手段 對于基因定位和基因工程的研究都很有用 步驟二 基因表達載體的構(gòu)建 1 用一定的限制酶切割質(zhì)粒 使其出現(xiàn)一個切口 露出黏性末端 2 用同一種限制酶切斷目的基因 使其產(chǎn)生相同的黏性末端 3 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處 再加入適量DNA連接酶 形成了一個重組DNA分子 重組質(zhì)粒 目的基因與運載體的結(jié)合過程 實際上是不同來源的基因重組的過程 常用的受體細胞 有大腸桿菌 枯草桿菌 土壤農(nóng)桿菌 酵母菌和動植物細胞等 將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理 借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑 步驟三 目的基因?qū)胧荏w細胞 直接導入法有電擊 顯微注射 直接吸收 基因槍等方法 1 電擊法 借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細胞 2 顯微注射法 利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細胞 3 直接吸收法 把目的基因和宿主細胞混在一起 讓其吸收 4 基因槍法 在金屬微粒上涂一層目的基因 然后發(fā)射到宿主細胞中 間接導入法常用的載體是質(zhì)粒 噬菌體 科斯質(zhì)粒 1 質(zhì)粒是細菌染色體DNA以外的環(huán)狀雙鏈DNA分子 它能自我復制 也可整合到細胞染色體DNA中與其一起表達 質(zhì)粒通常還含有標記基因 這可以從細胞的表型特征來識別 2 噬菌體是一種細菌病毒 其環(huán)狀雙鏈DNA可以作為目的基因的載體 3 科斯質(zhì)粒是一種雜種質(zhì)粒 含有質(zhì)粒和 噬菌體的部分順序 很適合用作真核生物基因的載體 1 將目的基因?qū)胫参锛毎?2 將目的基因?qū)雱游锛毎?3 將目的基因?qū)胛⑸锛毎?大腸桿菌細胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是 首先用Ca2 處理細胞 以增大細菌細胞壁的通透性 使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài) 這種細胞稱為感受態(tài)細胞 第二步是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合 在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子 完成轉(zhuǎn)化過程 第二步目的基因在受體細胞內(nèi) 隨其繁殖而復制 由于細菌繁殖的速度非?？?在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因 1 將細菌用CaCl2處理 以增大細菌細胞壁的通透性 2 使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞 3 目的基因在受體細胞內(nèi) 隨其繁殖而復制 由于細菌繁殖的速度非?？?在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因 步驟四 目的基因的檢測與鑒定 不能 受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀 才能說明目的基因完成了表達 受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎 若不能表達 要對抗蟲基因再進行修飾 前三步的處理十分繁鎖 為保證目的基因得到有效利用 通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因 這樣 處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少 必須將它從中檢測出來 細菌的檢測 將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落 檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物 淘汰無表達產(chǎn)物的菌落 保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng) 研究 多細胞生物的檢測 將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導發(fā)育成完整個體 檢測這些個體是否攝入目的基因 攝入的基因是否表達 是否表現(xiàn)出相應的性狀 淘汰無變化的個體 保留有相應變化的個體進一步培養(yǎng) 研究 例 用棉鈴飼喂棉鈴蟲 如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀 說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達 如蟲吃后中毒死亡 則說明攝入了抗蟲基因并得到表達 1 以下說法正確的是 A 所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C 運載體必須具備的條件之一是 具有多個限制酶切點 以便與外源基因連接D 基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 C 練習 2 不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A 能復制 B 有多個限制酶切點C 具有標記基因D 它是環(huán)狀DNA D 練習 3 有關(guān)基因工程的敘述中 錯誤的是 A DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C 目的基因須由運載體導入受體細胞D 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶 A 練習 4 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A 限制酶只在獲得目的基因時才用B 重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C 質(zhì)粒都可作為運載體D 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料 D 練習 5 基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的 在基因操作的基本步驟中 不進行堿基互補配對的步驟是 A 人工合成目的基因B 目的基因與運載體結(jié)合C 將目的基因?qū)胧荏w細胞D 目的基因的檢測和表達 C 練習 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全